人腰椎小关节软骨不同染色方法的差异比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.003

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3784-3789.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.003

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人腰椎小关节软骨不同染色方法的差异比较

黄磊涛¹，赖琦²，李帆²，毕海迪²，吴霞³，刘序强²，张斌²，戴闽²

¹南昌大学，江西省南昌市 330006；南昌大学第一附属医院，²骨科，江西省人工关节工程技术研究中心，³心胸外科，江西省南昌市 330006

修回日期:2017-05-19 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
通讯作者: 戴闽，硕士，主任医师，教授，南昌大学第一附属医院骨科，江西省人工关节工程技术研究中心，江西省南昌市330006
作者简介:黄磊涛，男，1990年生，南昌大学在读硕士，主要从事骨科方面的研究。
基金资助:
南昌大学研究生创新专项资金(cx2016390)

Different staining methods used for human lumbar facet joint cartilage:a comparative study

Huang Lei-tao¹, Lai Qi ², Li Fan², Bi Hai-di², Wu Xia³, Liu Xu-qiang², Zhang Bin², Dai Min²

¹Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; ²Department of Orthopedics, Artificial Joint Engineering and Technology Research Center of Jiangxi Province, ³Department of Cardiothoracic Surgery, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Revised:2017-05-19 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
Contact: Dai Min, Master, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Artificial Joint Engineering and Technology Research Center of Jiangxi Province, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Huang Lei-tao, Studying for master’s degree, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Innovation Foundation for the Graduate in Nanchang University, No. cx2016390

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
腰椎小关节：是腰椎上的惟一一个滑膜关节。从解剖学上来讲，以腰椎棘突连线作为中心，左右各有一个小关节，为一个整体，形态貌似一斜躺的大写“Y”字，与椎间盘构成三关节复合体，共同参与腰椎的各种活动，包括前屈、后仰及左右扭转等，它的结构虽小，但其作用不可忽视。
特殊病理染色：在病理学检查中，常规染色就是指苏木精-伊红染色，而在实际临床上，有些组织必须经过某种或者几种特殊的染色来帮助病理医师明确诊断或鉴别诊断。这些特殊染色方法主要是根据组织中存在的某种特有的物质与相应的染色试剂发生特异性结合，最终可以清楚观察到这些物质或者结构。本研究主要是针对小关节软骨结构的特异性显色，来评估这几种染色方法各自的优势及缺点。

摘要
背景：随着现代病理技术的不断创新及发展，在疾病诊断方面显著减少其误诊率，但特殊染色法依然是病理诊断的最主要手段。
目的：比较不同的特殊染色方法显示人腰椎小关节结构的优缺点。
方法：收集腰椎手术患者的L_4/5小关节软骨标本，行苏木精-伊红染色、番红O染色、甲苯胺蓝染色、Masson染色、番红-固绿染色，观察软骨结构。
结果与结论：苏木精-伊红染色、番红-固绿染色和甲苯胺蓝染色均可清晰观察到关节软骨各层结构。其中苏木精-伊红染色能较清楚显示软骨层、潮线及软骨下骨，软骨细胞核呈蓝紫色。番红-固绿染色清晰显示软骨4层结构：浅层(软骨表面)，中间层(细胞圆形，着色较淡，排列规律)，柱状细胞层(细胞较大，多核，排列整齐)，显示软骨基质呈均匀浅红，软骨下骨呈绿色，软骨组织与骨组织分对比鲜明。甲苯胺蓝染色显示组织结构层欠清，胞核染色清晰，胞浆几乎不着色，基质呈淡蓝紫色。而番红O染色软骨层及软骨下骨层分界比较清晰，软骨层呈均匀深红色，细胞染色较淡，与软骨基质分界不明显。Masson染色对胶原纤维较为清晰，但只能大致显示软骨与软骨下骨结构。结果说明番红-固绿染色显示软骨各层和软骨下骨结构最佳；苏木精-伊红染色观察软骨细胞形态变化较其他方法清楚，Masson染色最次。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0979-1905(黄磊涛)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 腰椎小关节, 关节软骨, 特殊染色, 苏木精-伊红染色, 番红O染色, 甲苯胺蓝染色, Masson染色, 番红-固绿染色

Abstract:

BACKGROUND: With the development of modern pathological techniques, the misdiagnosis rate has been reduced remarkably, but special stains are still the most important method for pathological diagnosis.

OBJECTIVE: To compare the advantages and disadvantages of different special stains used for observing the structure of human lumbar facet joints.

METHODS: The specimens of facet joint cartilage at L_4/5 level were collected from patients undergoing lumbar surgery, and then stained with hematoxylin-eosin, safranin O, toluidine blue, Masson, and saranin-O-fast green for structure observation.

RESULTS AND CONCLUSION: The structure of the articular cartilage could be observed clearly through hematoxylin-eosin, toluidine blue, and saranin-O-fast green staining. The cartilage surface, tidemark, and subchondral bone were shown by the hematoxylin-eosin staining, with the presence of violet chondrocyte nuclei. Safranin-O-fast green staining showed the four layers of the cartilage clearly, including the shallow layer (cartilage surface), middle layer (spherical cells arranged in disorder), columnar cell layer (large and multinucleated chondrocytes arranged neatly), tidemark, subchondral bone layer; and the cartilage matrix was reddish uniformly, the subchondral bone was green, and the cartilage and bone tissue showed a striking contrast. The cartilage structure was unclear in toluidine blue staining, with clear nuclei and almost no coloring cytoplasm, but the matrix appeared with slight purplish blue. Safranin O staining showed that the cartilage was red, which had no obvious boundary with the cartilage matrix, and chondrocytes were stained lightly. Masson staining showed clear collagen fibers, but the structures of the cartilage and subchondral were obscure. To conclude, safranin-O-fast green staining can achieve the best results, followed by hematoxylin-eosin staining and Masson staining in turn.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Lumbar Vertebrae, Staining and Labelling;, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄磊涛，赖琦，李帆，毕海迪，吴霞，刘序强，张斌，戴闽. 人腰椎小关节软骨不同染色方法的差异比较[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3784-3789.

Huang Lei-tao, Lai Qi, Li Fan, Bi Hai-di, Wu Xia, Liu Xu-qiang, Zhang Bin, Dai Min. Different staining methods used for human lumbar facet joint cartilage:a comparative study[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3784-3789.

图/表（结果） 1

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引言

人体骨骼发育成熟后，关节软骨将逐渐分成4层结构：软骨浅层、软骨中间层、柱状细胞层及软骨下骨层，其中柱状细胞层与软骨下骨层由潮线的分隔开^[1]。也有学者将成熟的关节软骨自关节面向深部分为浅表区、过渡区、辐射区和钙化软骨区4层结构，其中前3者又称为软骨非钙化层，钙化软骨区又称为软骨钙化层^[2]。既往对关节软骨的研究主要集中在膝关节，而对腰椎小关节研究的报道尚少。

系统的对腰椎小关节骨性关节炎研究最早始于1964年，Lewin对腰椎小关节骨性关节炎的流行病学、病因学和组织形态学进行了深入研究^[3]，且随着人口老龄化的进展，腰椎小关节骨性关节炎的发病率逐渐在上升，也越来越引起人们的重视^[4]。全身各处的关节因部位不同而结构及成分也各不尽相同，小关节突具有关节囊与滑膜，故属于滑膜关节，而且它是脊柱的惟一滑膜关节。正常情况下，小关节上下表面由关节软骨覆盖，关节囊内含有滑膜液，关节间隙约2 mm^[5]。近年来，有学者通过病理组织学与影像方法对腰椎小关节骨性关节炎进行对比研究，发现小关节的早期退诊断变还是病理学诊断较为可靠^[6]。临床上也发现有部分患者腰痛是由小关节病变引起的，有研究表明小关节退变是导致患者下腰痛的重要原因之一^[7]，因此小关节的作用值得重视。

目前在骨性关节炎的组织形态学研究中，大多数选取兔和大鼠的软骨组织学结构为研究材料^[8]，再通常通过常规苏木精-伊红染色，结合番红-固绿染色、甲苯胺蓝染色法及阿尔辛蓝过碘酸雪夫染色法等对关节软骨行特殊染色，来较客观全面地获得关节组织形态学相关信息^[9]。作者拟比较苏木精-伊红染色、番红O染色、甲苯胺蓝染色、Masson染色及番红-固绿染色5种染色方法对人腰椎小关节的组织结构及病理特点的染色效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 对比观察。

1.2 时间及地点 实验于2016年4至8月在江西省消化疾病研究所完成。

1.3 材料 腰椎小关节软骨标本来自1例25岁因腰椎骨折而需行后路腰椎切开复位内固定的男性患者，试验获得患者的知情同意。患者腰椎L_4/5小关节MRI图像(图1A)及术中取下的左侧L_4/5小关节标本(图1B)。

主要试剂与仪器：苏木精-伊红试剂盒购自Sigma公司；甲苯胺蓝试剂盒购自Baso公司；番红O试剂盒、改良番红-固绿试剂盒购自LEAGENE公司；Masson试剂盒购自南京建成科技有限公司；ZT-12P型生物组织全自动脱水机、石蜡切片机购自德国Leica公司；YB-7B石蜡包埋机、YT-7FB型生物组织摊烤片机购自湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 取材 清水冲洗标本至少4 h，再取下约0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm标本置于体积分数10%甲醛溶液中固定48 h，体积分数10%硝酸脱钙，每3 d换液一次。清水冲洗12 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。-20 ℃冻存约0.5 h，连续获得20张5 μm厚的切片。60 ℃烘干约0.5 h。

1.4.2 染色方法

苏木精-伊红染色：切片经二甲苯脱蜡后，再经梯度乙醇复水，自来水洗，苏木精浸染5 min，水洗，盐酸乙醇分化数秒，水洗，碳酸锂返蓝数秒，伊红浸染8 min，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

番红O染色：切片经0.5%番红O染液滴染1 min，体积分数95%乙醇分化数秒，风干，二甲苯透明，中性树胶封固。

甲苯胺蓝染色：切片经二甲苯脱蜡后，梯度乙醇复水，甲苯胺蓝染色约30 min，自来水冲洗，冰醋酸分化至胞核清晰，自来水冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

Masson染色：切片经苏木精核染5-10 min，蒸馏水冲洗1 min，盐酸乙醇分化3-5 s，温水返蓝1 min，蒸馏水洗，丽春红酸性品红液中温染5 min，体积分数2%冰醋酸水溶液浸洗5 s，1%磷钼酸分化5 min，直接入2%苯胺蓝液复染3 min，体积分数2%冰醋酸水溶液浸洗5 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

番红-固绿染色法：切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后，1%番红染液浸染1.5 min；1%固绿染液复染1 min；体积分数95%乙醇分化数秒；番红染色2 min；体积分数95%乙醇分化数秒；自然晾干；二甲苯透明；中性树胶封固。

染色结束后，显微镜观察经不同化学方法染色后的软骨负重区组织学形态。

1.5 主要观察指标 腰椎小关节中软骨、软骨下骨、潮线及骨组织的形态。

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讨论

随着现代病理技术的发展，虽然免疫组织化学技术及原位杂交技术等在病理诊断中应用越来越广泛及得到认可，但特殊染色法仍是病理技术中不可或缺的疾病诊断手段^[10]。

3.1 苏木精-伊红染色 苏木精-伊红染色是临床上用来病理诊断中使用最多的检查方法之一。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色，而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。嗜碱性结构通常包括含有核酸的部分，如细胞核中的DNA及细胞质中富含RNA的区域等。嗜酸性结构则通常由细胞内及细胞间的蛋白质，如细胞质的大部分等^[11]。该方法用于软骨染色，观察关节软骨结构仍具有一定的局限性，缺乏组织特异性，并不能较清晰的反映软骨各层结构^[12]。苏木精-伊红染色结果显示，小关节标本中软骨及软骨下骨分界并不十分清楚，正常的小关节软骨表面光滑、完整，单个软骨细胞形态规则，排列整齐，核呈蓝染，胞质及周围组织呈淡红色。软骨及软骨下骨的分界线为潮线，从染色后的玻片上观察发现，潮线的结构并不十分清楚，整个软骨层的细胞形态结构比较模糊。根据软骨基质中含有大量酸性黏多糖，而苏木精染料呈碱性，很容易与之相结合，因此组织经苏木精-伊红染色后软骨基质呈嗜碱性染色，而由于软骨细胞所处的软骨陷窝周围富含硫酸软骨素因此呈强嗜碱性染色。故以苏木精-伊红染色观察软骨细胞形态的变化相对较好。

3.2 番红O染色 番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，它显示软骨是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团结合，当软骨受到损伤时，软骨中的糖蛋白就会释放出来，使其基质成分分布不均匀，从而导致番红O淡染或不着色。传统观念认为，番红O是一种异染性染料，但经过乙醇处理后番红O可以近乎正染的形式对蛋白聚糖着色，在这种情况下，其与多聚阴离子的浓度成正比，因此可以间接反映软骨基质中蛋白聚糖的含量和分布^[13-14]。再结合图像分析系统，即可对番红O染色的软骨基质进行定量分析^[13,15]。番红O染色结果显示，软骨基质呈红染，软骨层细胞核染成红色，软骨陷窝不着色，与软骨下骨的淡染呈比较明显对比，说明番红O染色对软骨基质的显色敏感度较高。

3.3 甲苯胺蓝染色 甲苯胺蓝是一种吩噻嗪类异染性阳离子染料，常用来显示组织切片上的细胞核和黏多糖，以异染形式在软骨基质中主要与硫酸根、在细胞核与磷酸盐和醛基通过静电引力相结合，但pH 1.0时磷酸基不被离子化，不参与染色^[16-19]。由于软骨基质含大量阴离子基团，故对软骨的染色多采用阳离子染料，甲苯胺蓝染色显示的结构与番红O染色很相似^[20]，可能的原因是番红O像甲苯胺蓝一样以非常相似的方式与相同的分子相互作用^[21]，两者染色原理都是基于其本身是阳离子的染料，而软骨基质中含有阴离子基团，故两者的染色原理十分相似。用甲苯胺蓝进行基质异染，能特异地反映软骨细胞分泌的酸性黏多糖的含量^[22]，故对软骨基质显示。实验结果显示，甲苯胺蓝对关节软骨具有特殊的着色结构，主要是在软骨层及软骨基质的显示，胞浆近乎不着色，基质呈淡蓝紫色。结合其他的特殊染色方法对比，观察关节软骨结构不列为首选。

3.4 Masson染色 Masson染色也叫苯胺蓝复染，最早发表于1929年的，是由Masson氏结缔组织三色染色法而发展过来的。Masson染色法是常规用于结缔组织染色的一种复合染色方法^[23]，是用2或3种阴离子染料混合，结果将胶原纤维染成蓝色(被苯胺蓝所染)，肌纤维染成红色(被酸性品红和丽春红所染)。Masson染色主要用于胶原染色^[24]，对显示组织中纤维以及炎性因子的特异性很高。在关节软骨中，软骨组织呈淡蓝色，随着骨小梁趋于成熟，部分骨小梁中间的颜色呈红色，软骨细胞及软骨陷窝无明显着色，此法对关节软骨中的Ⅱ型胶原染色敏感性较强^[25]。实验结果显示，该方法对小关节软骨下骨显色较为清晰，部分骨小梁可见，而软骨层结构不清楚，因此不推荐Masson染色用于关节软骨的特异性染色。

3.5 番红-固绿染色番红-固绿染色法是国外研究骨性关节炎组织形态最常用的一种特殊染色法^[9]。而番红-固绿染色最关键的环节之一就是分色。嗜碱性的软骨与碱性的染料番红结合呈红色，而软骨下骨与嗜酸性染料的固绿结合呈绿色，这样将软骨组织与骨组织形成鲜明对比而被清晰的区分^[13^，^26-29^]。黏合线是钙化软骨层与软骨下骨之间的交界线^[12]，番红-固绿染色可清晰显示此结构，软骨被染成红色，软骨下骨被染成绿色^[^30-33^]。因为钙化软骨层与软骨下骨这两者都具有共同的细胞外基质无机成分-钙盐，故两者可以紧密的连接起来，黏合线的名称也说明这点^[³⁴^]。潮线是透明软骨与钙化软骨层之间的界面连接，它是钙化层的矿化缘与非钙化的关节软骨之间的分界线^[12^，^35-36^]。软骨钙化层结构是由于人体骨骼发育成熟后，软骨内骨化性生长停止，导致软骨基质沉积的钙盐不再被吸收而逐渐形成的^[^37-40^]。小关节标本经番红-固绿染色后，能够清晰的观察到软骨细胞的形态，透明软骨区还可见软骨细胞陷窝，排列规则，细胞核呈深红色，胞质呈淡红，颜色鲜艳，软骨下骨则青绿色，与软骨层形成鲜明对比。姬瑞娟等^[¹³^]通过对番红-固绿染色方法进行改进，使得该方法对关节软骨及软骨基质及骨组织特异性染色，有研究者通过采用3种方法，分别为番红O染色、番红-固绿染色及Runx2免疫组织化学对正常髁突、髁突增生及髁突骨软骨瘤分别进行染色，发现番红-固绿染色可以清晰的反映软骨和软骨下松质骨的形态以及髁内骨与软骨的分布状况，而番红O染色能够清楚的显示髁突软骨的层次结构^[^41-45^]。因此，番红-固绿染色对关节软骨各层结构的显色及形态学上的观察都是较为理想的选择。

3.6 结论实验通过对比几种不同的软骨染色方法描述人体腰椎小关节软骨的各层结构及组织形态，得出番红-固绿染色效果最佳。但也应根据临床目的选择恰当的染色方法，有时需要联合2种或2种以上的染色方法才能到达效果^[9^，⁴⁶^]。但实验的样本量太少，且缺乏评估标准。因此腰椎小关节骨性关节炎的机制研究还有待进一步的深入探讨，可能作为的解释临床上产生腰痛的另一个重要病因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人腰椎小关节软骨不同染色方法的差异比较

Different staining methods used for human lumbar facet joint cartilage:a comparative study

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