基于RNA-seq技术分析腰突颗粒防治腰椎间盘退变的转录组学特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.002

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3778-3783.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.002

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基于RNA-seq技术分析腰突颗粒防治腰椎间盘退变的转录组学特征

何升华¹，赖居易²，孙志涛¹，王业广¹，王建¹，冯华龙²，黄飞强²

¹深圳市中医院骨科三病区，广东省深圳市 518033；²广州中医药大学深圳临床医学院，广东省深圳市 518033

修回日期:2017-03-18 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
作者简介:何升华，男，1965年生，安徽省人，汉族，2003年安徽中医学院毕业，硕士，主任医师，主要从事脊柱外科方面的研究。
基金资助:
深圳市科技计划项目(JCYJ20150401163247232)；广东省中医药局项目(20162126)；深圳市卫生计生系统科研项目(201401066)

Molecular mechanism of Yaotu Granules in the prevention and treatment of lumbar disc degeneration based on RNA-seq technology

He Sheng-hua¹, Lai Ju-yi², Sun Zhi-tao¹, Wang Ye-guang¹, Wang Jian¹, Feng Hua-long², Huang Fei-qiang²

¹Third Ward of Orthopedics, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; ²Shenzhen Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China

Revised:2017-03-18 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
About author:He Sheng-hua, Master, Chief physician, Third Ward of Orthopedics, Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Program of Shenzhen, No. JCYJ20150401163247232; the Project of Traditional Chinese Medicine Bureau of Guangdong Province, No. 20162126; the Research Project of Health and Family Planning Commission of Shenzhen, No. 201401066

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
RNA-Seq技术：采用转录组测序建库的实验方法，可提供精确的数字化表达谱检测。该技术首先将细胞中的所有转录产物中的mRNA进行富集，然后进行随机打断并用随机六碱基引物进行反转录为cDNA，进行文库构建，利用高通量测序仪测序直到获得足够的序列。
腰突颗粒：该方以独活、桑寄生为主药，达祛风除湿，养血和营，活络通痹之功；同时配合牛膝、杜仲、熟地黄补肝肾，强筋骨；再佐以川芎、当归、芍药补血活血，茯苓、甘草益气扶脾使气血旺盛，更助于祛除风湿；此外加以地龙、土鳖、蜈蚣以通络止痛，三棱、莪术破血除瘀，各药合用，是为标本兼顾，扶正祛邪之剂。

摘要
背景：腰突颗粒是课题组治疗腰椎间盘退行性疾病的经验方，一直有较好的临床疗效，但其作用机制一直未明确。
目的：基于转录组测序(RNA-Seq)技术探讨临床经验方腰突颗粒防治腰椎间盘退变的可能分子机制。

方法：将10只新西兰大白兔按随机数字表随机分为生理盐水组和腰突颗粒组(n=5)，生理盐水组予以生理盐水20 mL/次灌胃，腰突颗粒组予以灌服腰突颗粒水煎剂20 mL/次，均2次/d，连续灌胃1周。于最后一次灌胃完成2 h后经颈总动脉采血收集兔血清分别制作为10% DMEM培养液；分别使用2种血清培养液培养人髓核细胞，镜下观察2组细胞形态，锥虫蓝染色后测定2组细胞活力；另取第3代髓核细胞，干预48 h后采用RNA-Seq技术对2组细胞中的mRNA进行检测，进行转录组测序筛选差异mRNA；将得到测序结果进行差异基因表达、GO功能显著性富集及Pathway显著性富集分析。

结果与结论：①腰突颗粒组髓核细胞贴壁后以圆形或梭形多见，胞浆充足，胞核清晰。细胞核核表面光滑，核膜完整，长条状粗面内质网排列整齐，线粒体少，胞质内可见散在溶酶体及纤丝；生理盐水组细胞呈梭形和多角形，细胞核大，核仁多为2或3个，细胞核表面稍粗糙且质网可见轻微扩张，线粒体少且有部分膜不完整；②腰突颗粒组髓核P1、P2、P3代细胞贴壁速度、传代时间及细胞活力均优于生理盐水组(P < 0.05)；③比较2组测序结果发现，差异表达基因共有464个，其中上调基因有143个，下调基因有321个。差异基因的GO功能显著性富集分析显示，差异基因主要集中在生物过程部分的细胞调控与代谢过程中。差异基因的Pathway显著性富集分析结果发现，主要集中在代谢相关通路；④综上，通过RNA-Seq技术获得了腰突颗粒防治椎间盘退变作用的差异基因表达谱，腰突颗粒防治椎间盘退变的分子机制主要通过调节上调细胞外基质代谢相关基因及下调多糖合成相关基因实现，可为进一步研究提供基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2435-0227(何升华)

关键词: 组织构建, 组织工程, 椎间盘退变, RNA-Seq, 中药, 腰突颗粒, 血清干预, 转录组, 基因, 髓核细胞

Abstract:

BACKGROUND: The Herbal Compound formula Yaotu Granules for lumbar disc degeneration has achieved satisfactory efficacy, but the underlying mechanism remains unclear.

OBJECTIVE: To explore the possible molecular mechanisms of Yaotu Granules for lumbar disc degeneration based on transcriptome sequencing (RNA-seq).

METHODS: Ten New Zealand white rabbits were randomly divided into control and experimental groups (n=5 per group), followed by intragastric injection of 20 mL of normal saline and 20 mL of water decoction of Yaotu Granules, respectively, twice daily for consecutive 1 week. The different drug serums were prepared using serum samples obtained from the common carotid artery at 2 hours after the last injection. Human nucleus pulposus cells were cultured in DMEM containing 10% different drug serums to observe the cellular morphology in each group. The cell viability was detected by trypan blue staining. The passage 3 human nucleus pulposus cells were pretreated for 48 hours, the mRNA level was detected using RNA-seq, and the differentially expressed mRNA was screened by RNA-seq. Subsequently, the differential gene expression, Gene Ontology (GO) enrichment analysis and Pathway enrichment analysis were performed.

RESULTS AND CONCLUSION: In the experimental group, there were round or fusiform cells with abundant cytoplasm and clear nuclei that showed smooth surface and complete nuclear membrane; elongated rough endoplasmic reticulum arranged regularly, and less mitochondrion, scattered lysosomes and filaments were visible in the cytoplasm. In the control group, spindle and polygonal cells were found, and the large nuclei with 2 or 3 nucleoli and slightly rough surface were observed; there were mildly dilated endoplasmic reticulum, and few mitochondria with incomplete membrane. The adherent rate, generation time and cell viability of passage 1, 2 and 3 cells in the experimental group were significantly better than those in the control group (P < 0.05). Sequencing results found that there were 464 differentially expressed genes including 143 upregulated, and 321 downregulated genes. GO analysis revealed that the differentiated genes were mainly concentrated on cell regulation and metabolism. Pathway analysis found that mainly differentiated genes focused on the metabolism related pathways. These findings suggest that the differentially expressed gene profile of Yaotu Granules for lumbar disc degeneration is obtained by RNA-seq technology. Yaotu Granules mainly upregulate extracellular matrix metabolism-related genes and downregulate polysaccharide synthesis related genes in the prevention and treatment of lumbar disc degeneration, which provides basis for further research.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Intervertebral Disk Degeneration, Drugs, Chinese Herbal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

何升华，赖居易，孙志涛，王业广，王建，冯华龙，黄飞强. 基于RNA-seq技术分析腰突颗粒防治腰椎间盘退变的转录组学特征[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3778-3783.

He Sheng-hua, Lai Ju-yi, Sun Zhi-tao, Wang Ye-guang, Wang Jian, Feng Hua-long, Huang Fei-qiang. Molecular mechanism of Yaotu Granules in the prevention and treatment of lumbar disc degeneration based on RNA-seq technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3778-3783.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验共纳入10只新西兰大白兔，随机分为2组，实验实施过程中无脱失。

2.2 细胞形态观察及活力 腰突颗粒组髓核细胞贴壁后以圆形或梭形多见，胞浆充足，胞核清晰。细胞核核表面光滑，核膜完整，长条状粗面内质网排列整齐，线粒体少，胞质内可见散在溶酶体及纤丝；生理盐水组细胞呈梭形和多角形，细胞核大，核仁多为2或3个，细胞核表面稍粗糙且质网可见轻微扩张，线粒体少且有部分膜不完整。腰突颗粒组髓核P1、P2、P3代细胞贴壁速度、传代时间及细胞活力均优于生理盐水组(表1)。

2.3 转录组测序结果

2.3.1 测序质量评估 腰突颗粒组以生理盐水组作为阴性对照，在Illumina hiseq 4000测序平台上进行转录组测序后，共产生2组转录组数据，2组数据的reads均通过质量检查(表2)，符合下一步转录组分析条件。

2.3.2 基因定量分析 通过RSEM工具对2组进行基因定量表达分析^[23]。人腰椎间盘共有242 048个基因，结果发现腰突颗粒组有16 876个基因表达，生理盐水组有16 746个基因表达。腰突颗粒组中基因表达量最高的为一种胱多肽基因，FPKM为6 688.86，而此基因在生理盐水组中同样是最高表达，FPKM为8 180.30。作者推测该蛋白对于维持髓核组织正常生理生化功能具有关键作用。

2.3.3 差异基因分析 参照Audic等^[24]发表在Genome Research上的基于测序的差异基因检测方法，在本文分析中，差异表达基因默认定义为FDR(False Discovery Rate)≤ 0.001且倍数差异在2倍以上的基因。结果发现腰突颗粒组和生理盐水组相比较共有464个差异表达基因，其中上调基因有143个，下调基因有321个(图1，2)。

2.3.4 差异基因的GO功能显著性富集 分析对筛选出的差异基因作GO富集分析，得到每个差异基因的GO注释后，利用WEGO软件对差异基因做GO功能分类统计，从宏观上认识差异基因的功能分布特征。从研究结果可看出这些差异基因主要集中在生物过程部分的细胞调控与代谢过程(图3)。

2.3.5 差异基因的Pathway显著性富集分析 人体内不同基因相互协调椎间盘髓核组织行使其生物学功能，基于Pathway的分析有助于更进一步了解椎间盘髓核基因的生物学功能。作者以KEGG公共数据库对差异基因作Pathway富集分析发现差异基因富集最明显的为代谢通路相关基因^[25]，其中细胞外基质、氨基酸、核苷酸、及外源性物质生物降解和代谢通路相关基因呈下调趋势，聚糖的生物合成与代谢通路基因呈上调趋势(图4，5)。除此之外，细胞信号转导相关通路也有明显差异，如通过下调P13K-Akt信号通路部分基因影响表达影响椎间盘髓核组织的代谢。

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引言

腰椎间盘源性疾病是脊柱外科常见病、多发病，而腰椎间盘退行性改变是引起盘源性脊柱疾病的主要原因。腰椎间盘是维持腰椎正常生物力学功能、椎间隙高度及缓冲脊柱纵向压力的重要组织结构^[1-2]。导致椎间盘退变的因素有很多，但其发病机制目前并不非常明确，已有研究认为生物力学、营养因素、细胞凋亡、细胞因子的异常是主要因素^[3-6]。临床上腰椎间盘退行性改变常致腰椎间盘突出、腰椎退行性畸形、盘源性腰背疼痛等病症，大量研究证实，中药对腰椎间盘退行性变引起的疾病具有良好的防治效果^[7-9]。腰突颗粒是作者课题组临床用于治疗腰椎间盘退行性疾病20余年的经验方，一直有较好的临床疗效，但其作用机制一直未明确。

RNA-Seq技术采用转录组测序建库的实验方法^[10]，可提供精确的数字化表达谱检测^[11]。该技术首先将细胞中所有转录产物中的mRNA进行富集，然后进行随机打断并用随机六碱基引物进行反转录为cDNA，进行文库构建，利用高通量测序仪测序直到获得足够的序列^[12-14]。该技术避免了亚克隆过程中引入的偏差，且短序列长度显著增加。获得长度显著增加的短序列所包含信息可以提高识别其对应的基因的准确性^[15]，通过计算这些短序列的个数和分析其在整个基因组中的分布，可以计算出细胞的转录组表达水平，是研究腰突颗粒分子作用机制的有利工具^[13^，^16-18]。故文章基于RNA-Seq技术观察腰突颗粒对人腰椎间盘髓核细胞转录水平的作用，以探讨腰突颗粒防治腰椎间盘退变疾病的分子机制，同时为中药治疗腰椎间盘退变疾病可能的靶点提供初步依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照实验。

1.2 时间及地点 于2015年4月至2016年4月在北京大学深圳医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选用10只普通级雄性新西兰大白兔，2月龄，体质量(1.8±0.3) kg，由广东省医学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

1.3.2 腰突颗粒 含独活、桑寄生各15 g；当归、芍药、牛膝、杜仲、熟地黄、川芎、茯苓、地龙、土鳖、三棱、莪术各10 g；蜈蚣2条、甘草5 g。以上药物均由深圳市中医院药剂科鉴定后提供。

1.3.3 人髓核细胞 髓核组织由深圳市中医院3例确诊为单节段腰椎间盘突出症志愿者提供，取自全脊柱内镜术中摘除的髓核组织。患者男2例，女1例，年龄分别为58，52，64岁，涉及突出节段：L_3/4 1例，L_4/5 1例，L₅/S₁ 1例。3例患者均对研究内容及目的知情同意，并经深圳市中医院伦理委员会论证审核通过。

1.3.4 仪器及试剂 细胞培养箱及离心机(Thermo Fisher Scientific)，超净台(苏净集团安泰公司)，倒置相差显微镜(上海上光新光学科技有限公司)，眼科剪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，Illumina hiseq4000(深圳华大基因)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Corning)，锥虫蓝(上海研卉生物科技有限公司)，Trizol(北京凯瑞基生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 制备腰突颗粒水煎剂 将每剂药泡入500 mL水中 1 h后武火煮沸，再文火慢煎至药汁剩约300 mL，收集药液浓缩成浓度1.5×10³ g/L的水煎浓缩剂。

1.4.2 制备含药血清 10只普通级雄性新西兰大白兔使用随机数字表法分为腰突颗粒组和生理盐水组，每组5只。2组大白兔适应性喂养7 d后，分别以20 mL腰突颗粒水煎浓缩剂、20 mL生理盐水灌胃干预，2次/d，连续灌胃14 d。于最后一次灌胃后2 h经兔颈总动脉采血收集血清冻存备用。

1.4.3 髓核细胞培养 3例患者术中取出的髓核组织置入培养基内，超净台中PBS反复冲洗髓核组织，去除残留的纤维环及夹杂的其他组织，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小。加入3倍于髓核组织体积的0.2%胰蛋白酶消化30 min，离心后取初步消化的髓核组织，加入6倍于髓核组织体积的0.25%Ⅱ型胶原酶消化2 h，成功分离原代髓核细胞后加入体积分数10%胎牛血清培养基，吹打均匀后接种于35 cm²培养瓶内，放入37 ℃，体积分数5%CO₂细胞培养箱培养，每天倒置显微镜下观察，每3 d换液1次，待细胞80%融合后，予以传代培养。

1.4.4 含药血清干预 取部分贴壁的原代髓核细胞，分别采用10%腰突颗粒组血清培养基、10%生理盐水组血清培养基进行培养用以观察形态及活力；另取第3代髓核细胞予以10%腰突颗粒组血清培养基、10%生理盐水组血清培养基干预48 h用于转录组测序。

1.4.5 髓核细胞形态观察及活力测定

细胞形态观察：每日倒置相差显微镜下观察髓核细胞形态。

细胞活力测定：取P1、P2、P3代细胞进行锥虫蓝染色观察细胞活力，取细胞制成细胞浓度为1×10⁸ L^-1悬浮液10 μL，常温下静置5 min，用细胞计数板进行计数，细胞活力=未蓝染细胞/(蓝染+未蓝染细胞)×100%。

1.4.6 转录组相关实验

转录组测序^[17^，^19-22]：取第3代髓核细胞经干预48 h后采用Trizol法提取总RNA，使用DNaseⅠ酶消化总RNA中的DNA，消化产物用磁珠纯化；向得到的mRNA中加入适量打断试剂高温条件下使其片断化，再以片断后的mRNA为模板，合成cDNA，经过磁珠纯化，末端修复、加碱基A，连接测序接头后，进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。构建好的文库用Agilent 2100 Bio analyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System进行质量和产量检测，文库质控合格后进行测序。

生物信息分析^[17]：测序得到的原始序列数据(Raw reads)首先通过滤纯化获得高质量序列数据(clean reads)，以保证后续信息分析结果的可靠性。以人髓核细胞作为参考基因组，使用比对软件Bowtie 2将clean reads与参考基因组进行比对。用RSEM工具进行基因表达定量，表达定量的结果以FPKM为单位，将得到的基因的表达量(FPKM值)进行样本间差异基因分析。差异表达基因定义为FDR ≤ 0.001且倍数差异在2倍以上的基因。将得到的表达谱进行差异表达分析，并将差异显著的基因(P ≤ 0.001)提取相应的蛋白质序列进行GO功能富集分析以及Pathway分析。

1.5 主要观察指标 2组髓核细胞形态、活力及转录组测序基因表达差异。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，采用SPSS 18.0进行统计分析，组间比较使用成组t 检验，检验水准为0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

腰突颗粒用于防治腰椎间盘退行性改变相关疾病一直具有较好的临床效果^[26]，该方以独活、桑寄生为主药，达祛风除湿，养血和营，活络通痹之功；同时配合牛膝、杜仲、熟地黄补肝肾，强筋骨；再佐以川芎、当归、芍药补血活血，茯苓、甘草益气扶脾使气血旺盛，更助于祛除风湿；此外加以地龙、土鳖、蜈蚣以通络止痛，三棱、莪术破血除瘀，各药合用，是为标本兼顾，扶正祛邪之剂。已有众多研究表明，中药对腰椎间盘相关疾病的治疗效果可通过调节体内分子机制而实现^[26]，潘泳鸿等^[27]针对壮腰通痹汤干预小鼠的研究发现，壮腰通痹汤增强椎间盘组织自身修复能力的机制可能是通过调节异常基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、金属蛋白酶组织抑制物1来实现的。在曹越等^[28]的一项研究则表明中药可有效降低腰椎间盘突出症患者血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子的水平进而抑制炎症反应，从而减轻患者疼痛。周江涛等^[29]通过动物实验还发现独活寄生汤可降P38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化水平抑制炎性因子的产生，以减缓其介导的软骨细胞凋亡。

本研究通过提取生理盐水组以及腰突颗粒组实验动物血清，来分别对髓核细胞进行培养，以进一步检测2组血清对髓核细胞基因水平改变的影响；而成熟椎间盘虽然为无血管器官，但是其在上下终板的弥散作用下，髓核细胞仍然能维持其内环境的稳定，故血清对髓核细胞的影响，能够模拟椎间盘中髓核细胞生存环境的影响。通过腰突颗粒含药血清对人椎间盘髓核细胞进行干预，观察细胞形态及活力，结果发现腰突颗粒组髓核细胞贴壁后至传至第3代后形态仍较完整饱满，胞浆充足，胞核清晰，而生理盐水组细胞形态梭形和多角形多见，且出现多核合并模糊。除此之外，腰突颗粒组髓核P1、P2、P3代细胞贴壁速度、传代时间及细胞活力均要优于生理盐水组，因此推测腰突颗粒可延缓椎间盘髓核细胞的退变和凋亡。当前对于中药防治腰椎间盘退变的机制研究主要集中在细胞因子、信号通路、降解酶等方面，针对基因相关研究仍较少。本研究通过高通量测序方法研究腰突颗粒对髓核细胞的影响发现其导致的基因表达以生物过程相关基因差异最为明显^[12]，但同时对细胞成分及分子功能相关基因也有不同程度影响。在464个差异表达基因中有143个是上调基因，下调基因有321个，下调基因明显要对于上调基因，表明腰突颗粒的作用机制可能是通过调节功能不同的基因表达延缓或抑制了髓核细胞的凋亡，从而延缓椎间盘退变。Pathway富集分析结果发现差众多通路相关基因受影响，其中包括氨基酸、核苷酸、外源性物质生物代谢通路相关基因呈下调趋势，多糖的生物合成通路基因呈上调趋势。椎间盘的退变是因细胞生成与凋亡之间的平衡被打破而开始^[3]，腰突颗粒下调代谢相关基因的同时可上调多糖的合成，这可能是其重要的作用机制之一。进一步对代谢相关通路研究发现，细胞外基质-受体相互作用途径的基因差异在整个过程中有重要作用^[30-31]，细胞外基质主要包括胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白及与基质代谢相关的蛋白酶和细胞因子，腰突颗粒通过改变蛋白与关键酶的基因表达抑制髓核细胞的凋亡。

综上所述，腰突颗粒防治腰椎间盘组织退变的作用机制是整体性的，其通过调节多个作用途径的相关基因表达延缓髓核细胞的退变。腰突颗粒干预髓核细胞后，下调了细胞外基质代谢途径关键基因，并上调多糖合成通路的相关基因。因此作者推测，调节不同基因的表达是腰突颗粒作用的重要分子机制。但是，具体调控哪一条通路，哪一个关键基因目前还没有定论，还有待于进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于RNA-seq技术分析腰突颗粒防治腰椎间盘退变的转录组学特征

Molecular mechanism of Yaotu Granules in the prevention and treatment of lumbar disc degeneration based on RNA-seq technology

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