胶原海绵复合人脂肪干细胞促血管新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.015

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (22): 3531-3535.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.015

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胶原海绵复合人脂肪干细胞促血管新生

薛静娴¹，陈绪¹，许岩磊¹，任伟业²，李燕²，张宇轩¹，姚昶¹

¹南京中医药大学附属医院，江苏省南京市 210029；²无锡贝迪生物工程有限公司，江苏省无锡市 214902

收稿日期:2018-01-13 出版日期:2017-08-08 发布日期:2017-09-01
通讯作者: 姚昶，主任中医师，博士生导师，南京中医药大学附属医院，江苏省南京市 210029
作者简介:薛静娴，女，1990年生，江苏省盐城市人，汉族，南京中医药大学在读博士，主要从事中医乳腺疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81373646)；康缘基金(HZ1009KY)；江苏省高校优势学科建设项目II期(012062003010)；江苏省中医院高峰学术人才培养(y2014cr06)

Improving angiogenesis by collagen sponge carrying human adipose-derived stem cells

Xue Jing-xian¹, Chen Xu¹, Xu Yan-lei¹, Ren Wei-ye², Li Yan², Zhang Yu-xuan¹, Yao Chang¹

¹Affiliated Hospital of Nanjing Medical University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; ²Wuxi Biot Bio-technology Co., Ltd., Wuxi 214902, Jiangsu Province, China

Received:2018-01-13 Online:2017-08-08 Published:2017-09-01
Contact: Yao Chang, Chief physician, Doctoral supervisor, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Xue Jing-xian, Studying for doctorate, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81373646; Kanion Fund, No. HZ1009KY; the Preponderant Discipline Construction Project II for High Education in Jiangsu Province, No. 012062003010; the Academic Personnel Training Project of Traditional Chinese Medicine in Jiangsu Province, No. y2014cr06

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

鸡胚绒毛尿囊膜：是研究促血管生成与抗血管生成的理想体内模型。生理情况下，血管形成主要发生在胚胎发育和女性月经周期内膜修复过程。另外，在很多病理情况下，血管生成都起着重要作用，如损伤修复、炎症、恶性肿瘤、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、银屑病、创伤愈合等也常伴随发生血管新生，特别是肿瘤生长和转移与血管新生密切相关，实体瘤必须依赖血管生成才能生长、侵袭和转移。因为鸡胚绒毛尿囊膜是天然免疫缺陷宿主，而且可耐受一定的温度变化，有利于检测某些对温度敏感的肿瘤细胞的生物学行为。所以，鸡胚绒毛尿囊膜模型常作为移植性肿瘤的实验模型之一，也可作为肿瘤新生血管形成、肿瘤侵袭和远处脏器转移潜能，以及抗肿瘤药物作用机制探讨等方面研究的体内实验模型。

背景：研究发现，脂肪干细胞胶原复合物可促进脂肪干细胞向成熟脂肪细胞分化、成熟，并可促进血管新生。

目的：探查胶原海绵复合脂肪干细胞的生物学特性及其对血管新生的影响。

方法：①实验组将人脂肪干细胞接种于胶原海绵上，以细胞单独培养为阴性对照组，培养24 h后，检测细胞黏附率；培养第2，4，6天，检测细胞增殖与培养液中血管内皮生长因子水平；②鸡胚绒毛尿囊膜实验：暴露孵育7 d的鸡胚尿囊膜，分4组，空白组向尿囊膜加入0.2 mL无菌PBS，脂肪干细胞组加入0.2 mL 2×10⁸L^-1第3代脂肪干细胞悬液，胶原海绵组加入胶原海绵，复合组加入2×10⁸ L^-1第3代脂肪干细胞悬液0.2 mL与胶原海绵。孵育7 d后，测定尿囊膜周围微血管计数。

结果与结论：①细胞黏附率：脂肪干细胞在胶原海绵上的黏附率为(93.04±0.67)%；②细胞增殖与培养液中血管内皮细胞生长因子水平：实验组培养第6天的细胞增殖A值高于对照组(P < 0.01)，培养第4，6天的血管内皮生长因子水平高于对照组(P < 0.05)；③鸡胚绒毛尿囊膜实验：脂肪干细胞组、胶原海绵组、复合组微血管计数高于空白组(P < 0.05)，复合组高于脂肪干细胞组、胶原海绵组(P < 0.05)；④结果表明：脂肪干细胞与胶原海绵具有良好的生物相容性，两者复合有良好的促进血管新生作用，其机制可能与促进脂肪干细胞增殖与分泌血管内皮生长因子相关。

ORCID: 0000-0002-7264-1478(薛静娴)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 脂肪干细胞, 胶原海绵, 生物相容性, 支架, 血管新生, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that adipose-derived stem cells (ADSCs)/collagen complexes can promote the ADSCs differentiation and maturation into mature adipocytes and promote angiogenesis.

OBJECTIVE: To explore the biological properties of the ADSCs/collagen sponge composite material and to detect its effect on angiogenesis.

METHODS: (1) ADSCs were cultured on collagen sponge (experimental group) or cultured alone (control group). After 24 hours of culture, cell adhesive rate of ADSCs was determined with flow cytometry. After 2, 4, 6 days of culture, cell proliferation and level of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the culture medium were detected. (2) Chick embryo chorioallantoic membranes were exposed and incubated for 7 days and then divided into four groups: 0.2 mL of sterile PBS was added in the blank group, 0.2 mL of 2×10⁸/L passage 3 ADSCs suspension was added in the ADSCs group, collagen sponge was added in the collagen sponge group, and collagen sponge with 0.2 mL of 2×10⁸/L passage 3 ADSCs suspension was added in the composite group. After 7 days of incubation, the microvessel count around the chorioallantoic membrane was measured.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The cell adhesive rate of ADSCs to collagen sponge reached to (93.04±0.67)%. (2) The absorbance value (at 6 days of culture) and level of VEGF (at 4 and 6 days of culture) in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.01 or P < 0.05). (3) Compared with the blank group, the number of microvessels was significantly higher in the ADSCs, collagen sponge and composite groups (P < 0.05). Moreover, higher amount of microvessels were found in the composite group than the ADSCs and collagen sponge groups (P < 0.05). To conclude, ADSCs can adhere well to the collagen sponge with good biocompatibility and their combined use can improve angiogenesis further by enhancing cell proliferation and VEGF secretion of ADSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Collagen, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

薛静娴，陈绪，许岩磊，任伟业，李燕，张宇轩，姚昶. 胶原海绵复合人脂肪干细胞促血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(22): 3531-3535.

Xue Jing-xian, Chen Xu, Xu Yan-lei, Ren Wei-ye, Li Yan, Zhang Yu-xuan, Yao Chang.

Improving angiogenesis by collagen sponge carrying human adipose-derived stem cells

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(22): 3531-3535.

图/表（结果） 5

2.1 脂肪干细胞原代及传代细胞的形态和表面抗原特征原代细胞于培养24 h后贴壁完成。流式细胞仪检测第3代细胞表面抗原CD34阴性、CD90阳性(阳性率>95%)，结果见图1。

细胞经成脂培养基诱导培养二三周后，油红O染色可见脂滴且脂滴随诱导时间的延长而增大(图2A)；成骨培养基诱导培养3周后，茜素红S染色阳性(图2B)。结果表明，这些从脂肪组织中提取并培养后的细胞为脂肪干细胞。

2.2 胶原海绵孔隙率及脂肪干细胞黏附率检测结果胶原海绵孔隙率为91%。测定5块胶原海绵24 h黏附率分别为92.24%、93.25%、92.66%、94.02%与93.04%，平均黏附率为(93.04±0.67)%。

2.3 脂肪干细胞增殖检测结果随着时间的增加，实验组与对照组脂肪干细胞都保持递增增殖状态。两组培养第2，4天的细胞A值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明细胞增殖前期，Ⅰ型胶原对细胞增殖无明显的增殖作用；实验组培养第6天的细胞A值高于对照组(P=0.006)，见表1。

2.4 脂肪干细胞分泌血管内皮生长因子测定结果随着时间的增加，各组脂肪干细胞分泌血管内皮生长因子保持递增状态，实验组培养第4，6天的血管内皮生长因子水平高于对照组(P=0.007，P=0.002)，见表2。

2.5 鸡胚绒毛尿囊膜实验结果接种部鸡胚绒毛尿囊膜的血管以接种部位为中心呈轮辐状分布，接种第3天时已有中粗血管形成，微血管形成增多，新的血管网逐渐构成，取材时见胚胎仍活动生长，鸡胚绒毛尿囊膜接种部位血管丰富，管腔饱满。

脂肪干细胞组、胶原海绵组、复合组微血管计数高于空白组(109.21±22.83，119.00±14.26，169.64±46.03，88.75±6.5，P < 0.05)，复合组高于脂肪干细胞组、胶原海绵组(P < 0.05)，脂肪干细胞组和胶原海绵组比较差异无显著性意义，见图3。

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引言

人们对美的追求，催生了植入生物组织工程材料的迅猛发展，但由于生物材料对人体属于异物，不可避免的产生异物反应，如纤维包膜挛缩、切口瘢痕增生等^[1]；之后出现了自体组织填充方法以消除异物反应，如自体脂肪颗粒注射，该方法可与吸脂减肥同时进行，将吸出的脂肪作为填充材料，但脂肪颗粒在注射后可能存在不同程度的液化吸收。有研究表明在脂肪颗粒移植后10-12个月，30%-60%的移植物将被吸收^[2]，原因为组织生长需要充分的血液供应^[3]，脂肪细胞植入后得不到充分的机体营养支持，导致了液化与吸收，后期出现结节。脂肪干细胞是一种具有高度分化潜能的，从脂肪组织中获得的干细胞，其起源于中胚层的间充质成体干细胞，在体外也可保持自我更新，可分泌大量血管生成和抗凋亡因子。多项体内和体外实验均证实脂肪干细胞在机体难愈性损伤修复中发挥了主导作用^[4-5]。将脂肪干细胞与可降解生物材料构成复合物，移植到体内，诱导目标组织形成，是提高植入生物组织工程材料存活的思路之一^[6]。胶原是构成结缔组织的主要成分，可促进细胞的黏附和增殖，生物相容性和降解性良好，降解产物能被细胞利用，是想架的支理材料之一。有研究发现，脂肪干细胞在I型胶原支架材料上能够黏附、生长，并且能够促进皮肤愈合^[7-8]。Wosnitza等^[9]研究发现，脂肪干细胞胶原复合物促进脂肪干细胞向成熟脂肪细胞分化、成熟并可促进血管新生，效果明显优于单纯胶原海绵支架。研究拟进一步评价脂肪干细胞胶原复合物中脂肪干细胞的生长与促血管新生及分泌血管内皮生长因子的相关关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年6月在江苏省中医院中心实验室完成。

1.3 材料胶原海绵由无锡贝迪生物工程有限公司提供，国食药监械(准)字2011第3640408；二甲基亚砜(DMSO)、乙二胺四乙酸(EDTA)购于美国Gibco公司；Ⅰ型胶原酶购于美国Sigma公司；EnoGene Cell Counting Kit-8 试剂盒购于南京恩晶生物科技有限公司；人血管内皮细胞生长因子定量分析酶联免疫检测试剂盒(购自南京墨迹生物公司)；7 d龄鸡胚购于江苏省农科院。

1.4 实验方法

1.4.1 制备脂肪干细胞脂肪组织来源于江苏省中医院整形外科抽脂患者术后废弃脂肪，无菌条件下以PBS洗涤3次后，用Ⅰ型胶原酶消化40 min，滤除未能消化的组织块和细胞团块，离心5 min，弃上清，取沉淀物，用DMEM培养基将其制成细胞悬液，置于培养箱内孵育，随后每二三天换液，细胞达70%-80%融合时进行传代，吸去旧培养液，洗涤、胶原酶消化孵育5 min，观察细胞浮起变圆，终止消化，离心弃上清，将沉淀制成细胞悬液，行流式细胞仪表面抗原及脂滴油红O染色与细胞茜素红S染色鉴定。

1.4.2 胶原海绵孔隙率测定将胶原海绵称质量，计为m_s；比重瓶中盛满乙醇，计质量为m₁，然后将胶原海绵浸入比重瓶中，使乙醇充分充盈于胶原孔隙，计质量为m₂；取出胶原海绵，剩余乙醇与比重瓶称质量，计为m₃，孔隙率(%) =(m₂-m₁-m_s)/(m₁-m₃)×100%。

1.4.3 脂肪干细胞与胶原海绵复合的黏附率测定无菌条件胶原海绵制成10 mm×10 mm×1 mm大小，将细胞浓度为2×10⁸ L^-1第3代脂肪干细胞悬液0.2 mL加入胶原海绵，静置4 h后，移入体积分数5%CO₂细胞培养箱，培养8 h后将胶原海绵取出，移至平皿，以培养液冲洗，测定流失细胞数；细胞材料复合物培养24 h后，重复上述步骤，得出未黏附细胞数。黏附率=(接种细胞数-流失细胞数-未黏附细胞数)/(接种细胞数-流失细胞数)×100%。

1.4.4 脂肪干细胞增殖实验取第3代脂肪干细胞，分组培养，以常规培养的细胞为对照组，实验组为与胶原海绵共培养，加入100 μL完全培养基，于培养箱继续培养，培养第2，4，6天，每孔加入10 μL CCK-8溶液，后续培养孵育2 h，以用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.4.5 血管内皮生长因子测定取第3代脂肪干细胞，分组培养，以常规培养的细胞为对照组，实验组为与胶原海绵共培养，加入100 μL完全培养基，于培养箱继续培养，培养第2，4，6天，用离心管采集细胞上清标本，3 000 r/min离心20 min后，去除悬浮物和沉淀物，用无菌管封装，按人定量分析酶联免疫检测试剂盒(millipore分装标准品)试剂盒指示进行测定培养液中血管内皮生长因子水平。

1.4.6 鸡胚绒毛尿囊膜实验采用Ribatti^[10]方法建立鸡胚绒毛尿囊膜：消毒后鸡胚孵育7 d时，将孵化的鸡胚气室处切割出一个边长约2 cm的三角形窗口，揭去蛋壳及其附着的部分卵壳膜，暴露尿囊膜，分4组，每组12枚鸡胚。空白组在尿囊膜加入0.2 mL无菌PBS，脂肪干细胞组加入细胞浓度为2×10⁸L^-1的第3代脂肪干细胞悬液0.2 mL，胶原海绵组加入10 mm×10 mm×1 mm胶原海绵，复合组加入细胞浓度为2×10⁸ L^-1第3代脂肪干细胞悬液0.2 mL与胶原海绵。无菌膜将窗口覆盖后继续孵育7 d，测定标本周围尿囊膜微血管计数：甲醇∶丙酮(1∶1)的固定液固定鸡胚尿囊膜15 min后，剪取连接标本处尿囊膜铺于载玻片，独立2人在50倍放大显微镜下将不重复的3个视野毛细血管利用格子法计数，3个视野内微血管(直径在20-40 μm之间)取平均数，以分叉数计数。

1.5 主要观察指标人脂肪干细胞与胶原海绵复合培养后的黏附率、增殖及血管内皮细胞生长因子水平；鸡胚绒毛尿囊膜实验中，各组微血管计数。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0进行统计学分析，以One-Way ANOVA(单因素方差分析)进行组间比较。

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讨论

寻找可使支架内快速血管化的方法，始终是组织工程中最具挑战性的研究领域之一^[12]。前期研究显示在胶原材料植入血管内皮生长因子，能促进血管内皮细胞增殖，体内实验中能刺激提高周围组织血管生长及促进血管从周围组织长入生物材料内^[13-15]。然而各种生长因子半衰期短，易降解失效，价格昂贵，因此，寻找一种具有自我更新与分泌促血管生成生长因子的细胞复合支架是可行的发展组织工程植入材料之一。人自体脂肪细胞来源丰富，是理想的组织工程支架载入细胞之一。但移植的脂肪组织成活率低，限制了其在临床的推广应用。脂肪干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞，同时具有来源丰富、取材容易、对机体损伤小、体外增殖迅速和生物学性状稳定等优点，是理想的组织工程和再生治疗的种子细胞^[16]。现代研究显示，人脂肪干细胞与Ⅰ型胶原复合具有良好的组织相容性与促血管生长作用^[17-18]，可有效修复组织缺损^[19]。

研究采用临床使用无锡贝迪生物工程有限公司生产的胶原海绵。胶原为海绵状高纯度Ⅰ型胶原冻干品，具备完整的三螺旋结构，相对分子量约300 000，胶原海绵孔径均匀，大小为70-100 μm，有良好的修复性，临床可用于创面修复^[20-21]、手术创腔缺损填充^[22-23]。研究结果显示胶原海绵孔隙率为91%，对脂肪干细胞的黏附率达93.04%，与于志永等^[24]研究显示孔隙率与黏附率大于90%可获得较好的脂肪干细胞生长与组织相容性，显示出此次研究中的胶原海绵可以较好地复合脂肪干细胞。

目前脂肪干细胞尚无确定的特异表面标记物，主要通过测定其定向分化能力等方面确定其性质。研究显示脂肪干细胞抗原有CD29、CD44、CD90高表达，同时CD31、CD34、CD45阴性表达，可通过流式细胞仪分拣。研究通过流式细胞仪分拣出CD90高表达同时CD34阴性的干细胞，可诱导培养出脂滴且细胞茜素红S染色阳性，显示研究中的种子细胞为脂肪干细胞。研究显示胶原海绵在与脂肪干细胞共培养4-6 d时，可显著促进脂肪干细胞增殖，而培养2-4 d时虽有促进增殖作用，但疗效欠显著，推测脂肪干细胞在培养4-6 d时进入快速增殖期，而在培养2-4 d为增殖前期^[25]，同时，胶原一定程度的降解，其降解产物可作为养料进入细胞，促进了脂肪干细胞的增殖^[26]。脂肪干细胞的增殖，分泌血管内皮生长因子水平增加，因此脂肪干细胞复合胶原中血管内皮生长因子含量升高，由此刺激血管新生。前期研究显示胶原本身具有促进血管新生作用^[27-28]，此次研究结果显示脂肪干细胞复合胶原海绵可提高血管新生1倍以上，前期研究显示血管内皮生长因子载入胶原蛋白，其促血管新生作用不显著^[13-14]，而脂肪干细胞本身促血管生长作用显著^[18]，因此，脂肪干细胞复合胶原海绵显著促进血管新生的作用应是脂肪干细胞与胶原本身作用叠加结果。

研究结果显示，目前临床运用的胶原海绵具有较好的脂肪干细胞黏附率与相容性，与脂肪干细胞复合培养后可促进脂肪干细胞的增殖，又可刺激脂肪干细胞血管内皮生长分泌，进一步促进血管新生，有利于植入体内存活与促进机体缺损部位的修复。

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胶原海绵复合人脂肪干细胞促血管新生

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