胎鼠不同脑组织中神经干细胞和神经元所占比例及差异

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3364-3369.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.014

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

胎鼠不同脑组织中神经干细胞和神经元所占比例及差异

张凤兰¹，杨璐军²，肖志成^1，3

¹昆明医科大学分子临床医学研究院，云南省昆明市 650500；²深圳市宝安区人民医院，广东省深圳市 518101；³澳大利亚莫纳什大学免疫与干细胞研究中心，澳大利亚墨尔本 VIC3010

修回日期:2017-06-14 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 肖志成，博士，教授，昆明医科大学分子临床医学研究院，云南省昆明市 650500；澳大利亚莫纳什大学免疫与干细胞研究中心，澳大利亚墨尔本 VIC3010
作者简介:张凤兰，女，1986年生，山东省菏泽市人，汉族，昆明医科大学在读博士，主要从事神经干细胞和microRNA的研究。
基金资助:
云南省高端人才引进计划(20080A004)；云南省干细胞和再生医学重点实验室(2015DG027)

Proportion and difference of neural stem cells and neurons from different embryonic mouse brain tissues

Zhang Feng-lan¹, Yang Lu-jun², Xiao Zhi-cheng^{1, 3}

¹Institute of Molecular and Clinical Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; ²Baoan People's Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China; ³Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Victoria 3800, Australia

Revised:2017-06-14 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Xiao Zhi-cheng, M.D., Professor, Institute of Molecular and Clinical Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Victoria 3800, Australia
About author:Zhang Feng-lan, Studying for doctorate, Institute of Molecular and Clinical Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Supported by:
the Talent Program of Yunnan Province, No. 20080A004; the Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Yunnan Province, No. 2015DG027

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
神经干细胞：是神经系统中的一类多潜能细胞，由于神经干细胞的取材来源十分有限，如何快速培养出大量优质神经干细胞用于后期研究仍是亟需解决的问题。研究通过细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR技术分析比较了E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中神经干细胞和神经元的比例，发现E14小鼠前脑组织中神经干细胞的比例相对较高，神经元的比例相对较低，故建议分离E14小鼠前脑组织用于后期神经干细胞的培养，以减少杂细胞在神经干细胞培养中造成的负面影响。
神经元：是构成神经系统结构和功能的基本单位，由细胞体和细胞突起构成，其中细胞突起又分为轴突和树突两类。在大脑发育过程中，神经干细胞分化为神经元经历了神经干细胞、神经祖细胞、神经母细胞、不成熟神经元和成熟神经元几个阶段，是彼此交错、循序渐进的过程。

摘要
背景：目前，小鼠神经干细胞的体外培养技术已被众多科研平台熟练掌握，但是各科研平台在培养脑源性神经干细胞时所使用的脑组织有很大差异。胎龄14 d(E14)小鼠脑组织被广泛用于培养胎鼠神经干细胞，而对于此时胎鼠不同脑组织中所含神经干细胞的详细比例及其间有无差异，目前研究较少。

目的：比较E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中神经干细胞和神经元所占比例及差异，为后期优化分离高纯度神经干细胞提供直接量化数据和前期研究基础。

方法：分离E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织，加入胰酶消化成单细胞，贴壁培养3.0-4.0 h，然后通过细胞免疫荧光实验，用DAPI标记总细胞，神经干细胞特异性抗原Nestin标记神经干细胞，神经元特异性抗原Tuj1标记神经元，统计分析Nestin⁺/DAPI和Tuj1⁺/DAPI所占比例。另外，通过实时荧光定量PCR技术检测E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中Nestin和Tuj1 mRNA的表达水平。

结果与结论：①细胞免疫荧光结果显示，E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中均有大量Nestin⁺和Tuj1⁺细胞存在；小鼠前脑组织中Nestin⁺细胞所占比例最高，明显高于全脑(P < 0.01)和大脑皮质(P < 0.05)；而前脑组织中Tuj1⁺细胞比例明显低于全脑(P < 0.05)和大脑皮质(P < 0.001)。该结果表明，与全脑和大脑皮质相比，前脑组织中神经干细胞所占比例最高，神经元所占比例最低；②Real time PCR结果显示，E14小鼠前脑组织中Nestin mRNA表达水平最高，明显高于全脑组织(P < 0.05)，略高于大脑皮质(P > 0.05)，说明前脑组织中有较多神经干细胞存在；而Tuj1 mRNA的表达水平明显低于全脑组织(P < 0.05)和大脑皮质组织(P < 0.05)，说明前脑组织中有较少神经元存在；③综合以上结果，与全脑和大脑皮质相比，分离、消化E14小鼠前脑组织所获得的神经干细胞比例最高，是后期培养优质神经干细胞的重要前提。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0096-9212(张凤兰)

关键词: 干细胞, 培养, 胎鼠, 全脑, 大脑皮质, 前脑组织, 神经干细胞, 神经元, 比例, 差异

Abstract:

BACKGROUND: At present, mouse embryonic neural stem cells (NSCs) culture has been skillfully operated by many labs, but there are differences existing about which part are dissociated to get NSCs. Embryonic 14 days (E14) mouse brain tissues are widely used for culturing NSCs, but there are less studies about the detailed percentage and difference of NSCs separated from different brain tissues.

OBJECTIVE: To test the proportion and difference of NSCs and neurons percentage from E14 mouse whole brain, cortex and forebrain, providing quantized data for optimizing the isolation of high-purity NSCs.

METHODS: E14 C57BL/6 mouse whole brain, cortex and forebrain tissues were separated and dissociated into single cells that were adherently cultured for 3.0-4.0 hours and labeled by DAPI. Then the cells were immunostained with NSCs specific marker, Nestin, and neuron specific marker, Tuj1, to identify NSCs and neurons percentage by calculating Nestin⁺/DAPI and Tuj1⁺/DAPI. In addition, real-time PCR assay was used to test Nestin and Tuj1 mRNA expression in the E14 mouse whole brain, cortex and forebrain.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunocytochemical results showed that there were a large amount of Nestin⁺ and Tuj1⁺ cells in the whole brain, cortex and forebrain of E14 mice. NSCs percentage in the forebrain was obviously higher than that in the whole brain (P < 0.01) and cortex (P < 0.05), while the percentage of neurons in the forebrain was significantly lower than that in the whole brain (P < 0.05) and in the cortex (P < 0.001). (2) Real-time PCR results showed that the Nestin mRNA expression in the forebrain was significantly higher than that in the whole brain (P < 0.05) and slightly higher than that in the cortex (P > 0.05); the Tuj1 mRNA expression in the forebrain was significantly lower than that in the whole brain (P < 0.05) and in the cortex (P < 0.05). These findings indicated that the forebrain had the most NSCs and the least neurons compared with the whole brain and the cortex. In summary, E14 mouse forebrain has the highest percentage of NSCs compared with the whole brain and cortex, which is a better source to obtain NSCs for the following cell culture experiments.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Brain, Cerebral Cortex, Prosencephalon, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张凤兰，杨璐军，肖志成. 胎鼠不同脑组织中神经干细胞和神经元所占比例及差异[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3364-3369.

Zhang Feng-lan, Yang Lu-jun, Xiao Zhi-cheng. Proportion and difference of neural stem cells and neurons from different embryonic mouse brain tissues [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3364-3369.

图/表（结果） 1

2.1 E14小鼠不同脑组织Nestin免疫荧光染色和分析 观察E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织分离培养细胞的Nestin免疫荧光染色结果，发现：Nestin阳性细胞的细胞质为绿色荧光，胞核不着色，因培养时间较短(3.0-4.0 h)，细胞形态多数为圆形或椭圆形，边缘清晰，只有极少数细胞伸出细长分枝，DAPI阳性细胞核呈蓝色；3种脑组织经消化分离后，几乎全为单个散在细胞，未见明显细胞团块，且几乎没有碎裂细胞残片，整体染色背景较干净；前脑组织中Nestin阳性细胞比例略高于全脑和大脑皮质。见图1A。

将细胞免疫荧光数据进行统计分析，发现：在分离培养的E14小鼠前脑组织中Nestin阳性神经干细胞所占比例最高，为(37.48±0.52)%；大脑皮质组织中比例最低，为(33.07±0.62)%；全脑组织中比例介于二者之间，为(33.92±0.81)%。前脑组织中Nestin阳性神经干细胞的比例显著高于全脑(P < 0.05)和大脑皮质(P < 0.01)。见图1B。该结果表明前脑组织中Nestin阳性神经干细胞比例明显高于全脑和大脑皮质。

2.2 E14小鼠不同脑组织中Nestin mRNA的表达水平 通过Real time PCR实验检测E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中Nestin mRNA的表达水平，结果显示：E14小鼠前脑组织中Nestin mRNA的表达水平(1.58±0.23)明显高于全脑组织(设定为1，P < 0.05)，略高于大脑皮质(1.15±0.04，P > 0.05)，见图2。该结果表明前脑组织中Nestin mRNA的表达水平较高。

2.3 E14小鼠不同脑组织Tuj1免疫荧光染色及分析 观察E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中分离培养细胞的Tuj1免疫荧光染色结果，发现：Tuj1阳性神经元的细胞质为红色荧光，胞核不着色，也因培养时间较短(3.0-4.0 h)，大部分阳性细胞为圆形或椭圆形，只有少数细胞具有细长的突起，DAPI阳性细胞核呈蓝色；Tuj1免疫荧光染色整体背景较干净，未见非特异性着色；前脑组织中Tuj1阳性细胞比例略低于全脑和大脑皮质，见图3A。

将细胞免疫荧光数据进行统计分析，发现：在分离培养的E14小鼠前脑组织中Tuj1阳性细胞所占比例最低(74.03±0.70)%；全脑组织中比例略低(76.97±0.81)%；大脑皮质组织中比例最高(80.81±0.29)%；前脑组织中Tuj1阳性细胞比例明显低于全脑(P < 0.05)和大脑皮质(P < 0.001)；另外，全脑组织中的Tuj1阳性细胞比例低于大脑皮质，且差异有显著性意义(P < 0.01，未标注)，见图3B。该结果表明前脑组织中Tuj1阳性神经元比例明显低于全脑和大脑皮质。

2.4 E14小鼠不同脑组织中Tuj1 mRNA的表达水平 通过Real time PCR实验检测E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中Tuj1 mRNA的表达水平，结果显示：E14小鼠前脑组织中Tuj1 mRNA的表达水平(0.71±0.08)明显低于全脑组织中的表达水平(设定为1，P < 0.05)，也低于大脑皮质组织(1.04±0.04，P < 0.05)，但皮质组织与全脑组织之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。该结果表明前脑组织中Tuj1 mRNA的表达水平较低。

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引言

材料方法

1.1 设计 神经干细胞和神经元免疫荧光实验与实时荧光定量PCR实验。

1.2 时间及地点 2015年9月至2016年6月在昆明医科大学分子临床医学研究院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京) 2011-0011，在昆明医科大学清洁级实验动物房繁殖饲养。

1.3.2 主要试剂 DMEM/F12培养基、B27、0.05% EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司)；Nestin抗体(Millipore公司)；Tuj1抗体(Convance公司)；碱性成纤维生长因子、表皮生长因子(Peprotech公司)；多聚甲醛、BSA、PBS(索莱宝公司)；DAPI、Faststart Universal SYBR Green Master (ROX)(罗氏公司)；Trizol、2,2,2-三溴乙醇、多聚鸟氨酸、层粘连蛋白(Sigma公司)；DNaseI，PrimerScript RT reagent Kit(Takara公司)；荧光二抗(Abcam公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 E14小鼠脑组织的分离 将18-28 g身体健康的成年C57BL/6雌鼠与雄鼠在傍晚合笼，一般一笼包括1只雄鼠和2只雌鼠，次日清晨观察雌鼠有无阴道栓，若有，则表示交配成功，记为胎龄0.5 d(E0.5)。标记多只孕鼠，在E14时使用。腹腔注射2，2，2-三溴乙醇将孕鼠麻醉，用剪刀剪开腹部皮肤，暴露子宫中胎鼠，在无菌条件下分离胎鼠的全脑、大脑皮质和前脑组织(以小鼠大脑侧脑室为中心的脑组织部位)。

1.4.2 E14小鼠脑组织的消化和培养 每组收集三四只胎鼠的全脑、大脑皮质和前脑组织，分别置于冰盒内1.5 mL离心管中，立即向分离的脑组织中加入适量0.05% EDTA-胰蛋白酶，37 ℃水浴锅中消化8 min，然后用黄色枪头反复多次轻柔吹散成单个细胞，800 r/min离心10 min，弃上清，加入含2% B27、20 μg/L表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的DMEM/F12生长培养基，调整细胞浓度，按照5×10⁸ L^-¹细胞浓度接种至包被多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的24孔细胞培养板中培养3.0-4.0 h，然后加入40 g/L多聚甲醛固定30 min。

1.4.3 细胞免疫荧光染色和图像处理 向40 g/L多聚甲醛固定后的样品中加入0.3% Triton X-100打孔10 min，10% BSA室温封闭1 h，然后加入神经干细胞特异性抗体Nestin(兔多抗，1︰1 000)和神经元特异性抗体Tuj1(小鼠单抗，1︰500)4 ℃孵育过夜。次日加入相应的Alexa 488结合的驴抗兔IgG(1︰1 000)和Alexa 546结合的驴抗小鼠IgG(1︰1 000)室温孵育1 h(此步后实验过程需避光)，最后，加入DAPI将细胞核染色5 min。其中每步之间都用0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min。

将免疫荧光样品置于Leica荧光显微镜下观察，在200倍视野下每个样品至少采集3张细胞分布较均匀的图片，分别计数Nesin⁺神经干细胞、Tuj1⁺神经元和DAPI总数，并计算Nestin⁺/DAPI和Tuj1⁺/DAPI比例。

1.4.4 RNA抽提和Real time PCR 每组分别收集三四只胎鼠的全脑、大脑皮质和前脑组织分别置于冰盒内1.5 mL离心管中，管内加入适量Trizol，将所取样品迅速置于-80 ℃冰箱中保存，避免反复冻融，直至抽提RNA。

按照Trizol说明书操作步骤抽提总RNA，并加入DNaseI去除基因组DNA。然后按照PrimerScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)操作说明书反转录获取相应cDNA。应用ABI7300型荧光定量PCR仪，使用Faststart Universal SYBR Green Master (ROX)进行扩增。Nestin上游引物序列：5’-AAA GTT CCA GCT GGC TGT GG-3'，下游引物序列：5’-TGG GGT CAG GAA AGC CAA GA-3'；Tuj1上游引物序列：5’-CCA TCT AGC TAC TGA CAC TG-3’，下游引物序列：5’-AAG TGG ACT CAC ATG GAG TG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGA CGT GCC GCC TGG AGA AA-3’，下游引物序列：5’-AGT GTA GCC CAA GAT GCC CTT CAG-3’。实验结果采用2^-^??Ct法进行相对定量分析。

1.5 主要观察指标 ①全脑、大脑皮质和前脑组织中Nesin⁺神经干细胞、Tuj1⁺神经元和DAPI总数，计算Nestin⁺/DAPI和Tuj1⁺/DAPI比例，比较彼此之间有无明显差异；②全脑、大脑皮质和前脑组织中Nestin和Tuj1 mRNA表达水平，比较彼此之间有无明显差异。

1.6 统计学分析 实验结果用均数±标准误表示，利用GraphPad prism 5.0软件采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较3组数据两两之间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1992年神经干细胞的发现是神经科学领域的重大进展，为神经系统的基础研究与临床应用开拓了广阔前景^[1^，^20-22]。近年来，神经干细胞的分离培养技术已日趋成熟，但是神经干细胞的来源有限和数量不足仍是普遍存在的问题^[23-25]。

虽然应用大脑的不同组织都能培养出具有自我更新、增殖和分化能力的神经干细胞，但是这些不同组织中所含神经干细胞比例不尽相同^[26-28]。许汉鹏等^[14]分析比较了E14胎鼠大脑皮质、纹状体、间脑、中后脑和脊髓来源的神经干细胞的体外生长特性，发现大脑皮质来源的神经干细胞形成神经球的速度最快，纹状体和间脑次之，中后脑和脊髓最慢；另外，大脑皮质来源神经干细胞形成的神经球的贴壁性最弱，纹状体和间脑较强，中后脑和脊髓最强。张在金等^[29]报道了E16大鼠脑室下区来源的神经干细胞可传代10-15次，而大脑皮质来源的神经干细胞只可传代6-10次，海马和纹状体来源的神经干细胞传代次数介于二者之间。马浚宁等^[30]在新生昆明小鼠海马、嗅球和大脑皮质中分离培养出具有自我更新和多向分化潜能的神经干细胞，并发现从嗅球和大脑皮质提取的神经干细胞传至9-11代时会出现贴壁现象，而从海马分离的神经干细胞传至12-15代时才出现贴壁现象。以上研究结果说明不同组织来源的神经干细胞的增殖能力和贴壁能力不同。另外，Seaberg等^[31]研究发现来源于大脑皮质、室管膜、纹状体和视神经祖细胞的神经干细胞的自我更新能力和持续分化为神经元的能力有明显区别，从室管膜部位分离培养的神经干细胞在移植到宿主体内后能存活到成年和老年。根据上述报道可知，取材部位对于神经干细胞的培养和移植非常重要，选择合适的取材部位是获得理想神经干细胞的有效方法。分离含神经干细胞比例较高的大脑组织，能有效减少杂细胞在神经干细胞培养中造成的负面影响，快速扩増出优质神经干细胞，用于后期研究工作。

Nestin属第Ⅵ类中间纤维丝蛋白，在胚胎发育早期的神经上皮强烈表达，随着神经系统发育，其表达逐渐减弱，直至停止^[32-34]。当前，Nestin被广泛应用于鉴定神经干细胞^[35-38]。Tuj1(Class III β-tubulin)是一种微管蛋白，也是不成熟神经元的特异性抗原之一^[39-41]。在大脑发育过程中，神经干细胞分化为神经元是一个循序渐进的过程，分别经历了神经干细胞、神经祖细胞、神经母细胞、不成熟神经元和成熟神经元几个阶段^[42]。而在此过程中，Nestin和Tuj1的表达是一个相互交错的过程，Nestin表达的减少和Tuj1表达的增加互相对应。故此实验中Nestin阳性细胞和Tuj1阳性细胞中有一部分是重叠的，即是Nestin和Tuj1双阳性细胞。

实验将全脑、大脑皮质和前脑组织消化分离的细胞短暂贴壁培养后立即进行Nestin和Tuj1细胞免疫荧光染色，能真实反映所分离获取的脑组织中神经干细胞和神经元的数量和比例。其次，因为实验样品为单层贴壁细胞而非脑组织，便于计数分析，故实验数据可靠性更强。另外，实验还能检测在消化、分离脑组织为单细胞过程中操作是否恰当，是否因操作不当有细胞团块、细胞死亡或细胞碎片存在等现象，为后期培养神经干细胞提供实践经验。另外，因为E14时海马尚在发育早期阶段，体积较小且难于与其他脑组织完全分离，故未对其进行研究。

Nestin细胞免疫荧光结果表明，E14小鼠前脑组织中Nestin⁺细胞所占比例最高，且与全脑和大脑皮质之间有显著性差异；Real time PCR结果显示E14小鼠的前脑组织中Nestin mRNA表达水平最高，明显高于全脑组织，略高于大脑皮质。实验结果说明前脑组织中有较多神经干细胞存在。Tuj1细胞免疫荧光结果表明，E14小鼠前脑组织中Tuj1⁺细胞所占比例最低，且与全脑和大脑皮质之间有显著性差异；Real time PCR结果显示E14小鼠的前脑组织中Tuj1 mRNA表达水平最低，明显低于全脑组织和大脑皮质。实验结果说明前脑组织中有较少神经元存在。根据以往研究，E14是小鼠大脑神经发生时期，胶质细胞含量极少，因此，此时前脑组织中神经元含量相对较少，应该说明神经干细胞含量相对较多。综合以上结果表明，与全脑和大脑皮质相比，分离E14小鼠的前脑组织能获得更高纯度的神经干细胞，是后期培养优质神经干细胞的重要前提。

胎鼠不同脑组织中神经干细胞和神经元所占比例及差异

Proportion and difference of neural stem cells and neurons from different embryonic mouse brain tissues

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