无菌回收膝关节镜术后引流液体外培养自体间充质干细胞的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
关节腔引流液：是指通过手术引流或穿刺等方式从关节腔内获得的液体，包括组织渗出液、血液、关节滑液等；临床上往往可以根据引流液的颜色、黏稠度及引流量等判断疾病的转归。有研究认为通过引流可以减少关节腔内血肿形成，降低伤口张力，减少伤口疼痛和不良愈合率，促进关节功能早期康复。
术后引流液分离培养干细胞：在国内外研究中少见相关报道，可能为软骨组织工程修复提供新的来源和技术支持；但考虑到细胞在分子水平的诱导机制尚待进一步探索，故其临床效果仍有待于进一步的临床试验观察。

摘要
背景：目前间充质干细胞在骨科中的应用前景极为广阔，尤其是对于治疗关节软骨缺损疾病表现出巨大的潜力，骨髓是间充质干细胞的主要来源，但常规髂骨穿刺法抽取骨髓，来源有限，技术要求严格，限制了其应用程度，因此，探寻新的方便有效的细胞来源具有重要意义。
目的：探讨膝关节镜术后引流液体外培养自体间充质干细胞的可行性。
方法：选取行膝关节镜手术患者8例，在关闭切口前置特制的无菌血袋，收集术后引流液，采用羟乙基淀粉沉淀法及密度梯度离心法分离培养间充质干细胞，观察细胞形态，绘制生长曲线，流式细胞仪鉴定表面标志物，进行三系诱导分化染色鉴定。
结果与结论：①细胞呈梭形，贴壁生长，细胞增殖能力好，表面表达CD44、CD90、CD105、CD73，而不表达CD45；②通过标准方法诱导，间充质干细胞能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化，表明培养的细胞为间充质干细胞；③8例样本均培养出间充质干细胞，其细胞形态、增殖能力、细胞表型等无明显差异；④该结果表明，膝关节镜术后引流液可以培养出间充质干细胞，且细胞质量稳定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0001-5649-4212(梁学振)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 间充质干细胞, 关节镜, 引流液, 骨髓间充质干细胞, 培养, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have a extreme prospect in orthopedics, which show great potential especially in the treatment of articular cartilage defect disease. Bone marrow is the main source of mesenchymal stem cells, and the iliac puncture is a conventional way to obtain bone marrow, but is restricted by the limited resources and strict technical requirements. Therefore, it is of great significance to explore new effective and convenient sources of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of autologous mesenchymal stem cells derived from the joint drainage fluid after knee arthroscopy.
METHODS: We selected eight patients who underwent arthroscopic surgery to collect joint drainage fluid by pre-made sterile blood bag before the wound closure. Precipitation with hydroxyethyl starch and density gradient centrifugation method were performed to isolate and culture mesenchymal stem cells from the joint drainage fluid. Cell morphology, growth curve, surface marker identification were observed and detected using flow cytometry. Then, adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation of cells were induced and identified by oil red O, toluidine blue staining, and alizarin red staining, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The cultured cells were spindle-shaped, adherently grew and had good proliferation ability, which were positive for CD44, CD90, CD105 and CD73, but not for CD45. Under standard inductions, the cultured cells were induced to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes. Therefore, these cells were confirmed as mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells were successfully isolated from the joint drainage fluid of eight patients and had no difference in cell morphology, proliferation and phenotypes. To conclude, the joint drainage fluid is an ideal source of mesenchymal stem cells with the guaranteed quality and quantity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Arthroscopes, Drainage, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞形态学与生物学特性实验。

1.2 时间及地点 于2013年10月至2014年10月在山东中医药大学附属医院运动损伤骨科收集膝关节镜术后引流液，相关样本处理及检测在济南赛尔生物科技股份有限公司完成。

1.3 对象

纳入标准：①明确行膝关节镜手术，且无严重心肺疾患及传染疾病，可以耐受手术；②同意将术后引流液用于细胞分离培养研究，并签署知情同意书。

排除标准：①无法耐受手术及拒绝签署知情同意书；②有其他引起细胞水平变化的相关疾病，如肿瘤、感染。

符合选择标准的8例患者纳入研究，其中男2例，女6例；年龄33-71岁，平均45.18岁；左膝3例，右膝5例；前交叉韧带损伤者3例，骨性关节炎者5例；前交叉韧带损伤患者采用关节镜下前交叉韧带损伤重建术，骨性关节炎患者采用关节镜下骨性关节炎广泛清理+微骨折术。该研究符合山东中医药大学附属医院伦理委员会要求。

主要试剂和仪器：L-DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素(Gibco)；甲苯胺蓝、CD44、CD45、CD73、CD105、CD90(BD公司)；MTT试剂盒(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(天津灏洋)；SW-CJ型生物洁净工作台(苏州安泰)；CO₂培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；流式细胞仪(Millipore公司)；生物倒置显微镜(Olympus)；台式低速离心机(湖南湘仪)。

1.4 方法

1.4.1 样本收集 ①关节镜手术：全部患者均采用硬腰联合麻醉，患者取平卧位，常规应用止血带，压力为280-350 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，取髌前内、外侧入路分别建立关节镜视野及工作通道，顺序探查髌上囊、髌股关节、内外侧间沟、髁间窝及内外侧半月板等结构，确认前交叉韧带、半月板及各部位关节软骨损伤情况，针对关节内损伤进行相应处理；②引流液收集：为尽可能地无菌获取引流液，术后均放置引流管和特制的引流袋(无菌抗凝三联血袋)。具体操作：手术结束后松止血带，放置引流管，连接引流袋，并根据引流情况决定引流管拔出时间。对于术后在手术台上引流液可达到150 mL的患者，待引流初步稳定后拔出引流管，术肢弹力绷带加压包扎，此时引流液直接从手术室递送；对于术后在手术台上引流液尚未达到150 mL的患者，返回病房继续引流，待引流液达150 mL左右，且引流稳定后拔出引流管，此时引流液从病房递送；③引流液递送：引流达到规定要求后，撤除引流装置，于2 h内送往实验室，引流液的运输环境为12-16 ℃黑暗环境。实验室人员接收后进行信息核对并检查三联袋是否密封，如无问题，登记信息，消毒后传递入无菌室内进行处理。

1.4.2 样本处理及检测

引流液单个核细胞分离：采用羟乙基淀粉沉淀法加密度梯度离心法，将引流液离心去血浆后，加入等体积的生理盐水充分混匀，再加入0.5倍体积的羟乙基淀粉，20 ℃下静置30 min，取上清液，2 500 r/min离心5 min，收集沉淀，用生理盐水重悬，缓慢加到密度为1.077 g/mL 的淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min。取中间白膜层，生理盐水洗涤2次，收集单个核细胞，计数。

培养、扩增、传代：收集到的单个核细胞按细胞浓度为5×10⁹ L^-¹接种于25 cm²培养瓶内，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱培养；次日后换液，之后每2 d或3 d换液1次，没有贴壁的血细胞随着换液除去，贴壁的间充质干细胞形成集落，待细胞70%-80%汇合，用0.25%胰蛋白酶消化，1∶4比例扩增、传代。

形态学观察：每天用倒置显微镜拍照观察并记录细胞形态变化及生长状态。

生长曲线测定：取第3代细胞，按照接种密度1×10³/孔接种于96孔培养板进行培养，每天取1板进行MTT检测，共检测7 d。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录结果。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

细胞表面标记检测：取第3代细胞，0.05%胰酶(含EDTA)消化，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，离心，弃上清液，重悬细胞于EP管中，每管2×10⁵个细胞/100 µL，各管依次加入1 µL的单克隆抗体CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和同型阴性对照。避光孵育45 min，用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，除去未结合抗体，500 µL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。

定向诱导分化功能的鉴定：取第3代细胞接种于4个6孔板中，随机分为4组：软骨细胞诱导组、成骨细胞诱导组、脂肪细胞诱导组和对照组。其中软骨细胞诱导组培养液更换为成软骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清，100 mg/L维生素C，100 mg/L链霉素，1×10⁵ U/L青霉素，1 μmol/L地塞米松，6.25 mg/L亚硒酸，6.25 mg/L转铁蛋白，1 mmol/L丙酮酸钠，6.25 mg/L胰岛素)；成骨细胞诱导组培养液更换为成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清，100 mg/L维生素C，100 mg/L链霉素，1×10⁵ U/L青霉素，10 μmol/L地塞米松，10 μg/L转化生长因子β1，10 mmol/L β-磷酸甘油酸二钠)；脂肪细胞诱导组培养液更换为成脂诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，100 mg/L链霉素，1×10⁵ U/L青霉素，10 mg/L胰岛素，0.1 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，对照组用L-DMEM培养基培养。诱导21 d后，软骨细胞诱导组进行甲苯胺蓝染色，成骨细胞诱导组进行茜素红染色，脂肪细胞诱导组进行油红O染色，倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.5 主要观察指标 术后引流液分离出的间充质干细胞的形态、生长状况、表面标记物及诱导分化能力。

1.6 统计学分析 采用Excel数据分析软件对实验结果进行统计处理。

讨论

目前软骨损伤作为医学难题一直困扰着临床医师^[12-15]，主要源于软骨缺乏血管及修复损伤所需的未分化细胞，且软骨细胞再生能力低下，几乎没有迁徙能力，不能迅速聚集到损伤部位^[16-18]，而通过磨削、微骨折等手段修复所形成的软骨多为纤维软骨，其生物学性能、耐磨性及韧性均不及透明软骨，且易退变，无法恢复原有软骨组织的结构和功能，仅能在一定程度减轻患者疼痛感，短期效果有效，而长期效果不容乐观^[19-20]。自体骨或异体骨移植在治疗软骨损伤方面虽取得了一定成效，但其各自仍存在缺陷。自体骨的来源比较受限，且对供骨区产生新的损伤，应用范围仍较局限^[21-22]；异体骨的来源相对充足，但因其可能产生免疫排异反应及携带某些病原体，引起机体损伤，且免疫排斥反应问题在很大程度上决定了异体骨软骨移植能否成功，故其应用范围亦未普及^[23-24]。故迫切需要良好的软骨修复材料，而组织工程化骨在修复骨、关节软骨损伤方面展现了可观的应用前景^[25-29]。

间充质干细胞是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，细胞呈梭形，贴壁生长，在一定的诱导条件下可向成骨、脂肪、软骨、肌腱、神经等细胞多向分化，还具有支持造血、调节免疫、促进血管新生等生物学特性，是修复软骨组织的一种理想来源^[30-32]，被公认为是继造血干细胞之后下一个最可能进入临床应用的干细胞类型^[33-41]。

间充质干细胞最早是从骨髓中发现的，骨髓是间充质干细胞最主要的来源，研究也最为深入^[42-46]。骨髓间充质干细胞一般从患者髂骨处穿刺获取，是一种侵入性的骨髓采集方式，需要在局麻甚至全麻的条件下进行；需要多点穿刺采集才能达到临床治疗需求；而且穿刺过程中非常容易出现骨髓凝集，技术要求高，采集较为不便，患者痛苦大，而年幼或年老者，以及身体较为虚弱者，难以耐受在短时间内抽取大量骨髓，因而对患者年龄和身体状况有较高要求。脐血已成为间充质干细胞的另一重要来源^[47-49]。大量的实验及临床研究表明，脐血干细胞在体外相对于骨髓间充质干细胞更具成软骨细胞分化的潜能，而且其后遗症和排斥率更低^[50]，同时可以与不同材料结合形成软骨组织，成为软骨组织工程更具吸引力的种子细胞来源^[51-53]。脐血干细胞的采集不同于传统的骨髓采集，其存在于胎盘和脐带，不需要进行麻醉，无痛、无副作用，在胎盘、脐带与母体和胎儿完全分离以后直接采集；但其来源比较有限，且存放要求较高^[54]，故寻找一种广泛、安全有效且获取简单的间充质干细胞培养来源极其重要。

在临床中，骨科手术大部分以骨的手术为主，特别是靠近干骺端和关节的手术，如关节置换、关节清理、关节面骨折等，术中出血主要来自于骨松质，与髂骨穿刺来源的骨髓同源。因此以术后引流液为样本，进行体外分离培养间充质干细胞在理论上是可行的。实验结果也显示，以膝关节镜术后引流液为样本来源，通过羟乙基淀粉沉淀及密度梯度离心法分离、培养、扩增后，细胞呈梭形，贴壁生长，细胞增殖能力好，表面表达CD44、CD90、CD105、CD73，而不表达CD45；通过更换培养基向软骨细胞诱导分化，结果显示细胞形态发生改变，趋向于软骨细胞状形态，核浆比也相应地降低，甲苯胺蓝染色后可见大量的糖胺聚糖均匀分布于细胞基质中。另外，8例样本均培养出间充质干细胞，但培养的间充质干细胞因为患者的年龄、患病时间、治疗方式等不同而表现出不一样的生长速度，但是符合S型曲线。根据2006年国际间充质及组织干细胞委员会对人来源间充质干细胞实验研究提出的最低鉴定标准^[55]：①在标准培养条件下，间充质干细胞必须具备对塑料底物的贴附特性；②通过流式细胞仪检测，间充质干细胞群体表达CD105、CD73及CD90阳性率≥95%，且CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR的阴性表达率≥98%；③在体外，通过标准方法诱导，间充质干细胞必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。该结果表明膝关节镜术后引流液可以培养出间充质干细胞，且细胞质量稳定。

实验主要针对膝关节镜手术，其手术类型多包括骨性关节炎清理、半月板损伤探查修补、前交叉韧带损伤重建及髁间嵴骨折复位内固定等，术中多根据损伤情况进行骨赘打磨、滑膜清理、微骨折、创面新鲜化及钻取骨道等操作，术后会产生一定量的引流液，多为血性液体，平均引流量100-300 mL，以往这部分引流液在引流结束后被当作医疗废弃物直接被丢弃，但是研究发现，其内含有相当丰富的富血小板血浆及骨髓血^[56]，若加以提纯、分离、体外培养，则可以获得大量间充质干细胞。

保证引流液的全程无菌是非常重要的，实验使用无菌抗凝三联血袋进行收集，对于术后出血较多者，可直接在手术台上引流；对于术后出血不多者，在手术室内置入三联血袋，返回病房继续引流。严格的手术室环境，避免了引流过程中染菌可能性。总体上看，引流过程持续30 min至24 h，亦未出现血液凝集现象。引流液收集结束以后，在12-16 ℃的黑暗环境中于2 h内递送至GMP标准实验室。所有样本均未出现染菌或血液凝集现象。

利用术后引流液培养间充质干细胞的方法为废弃物重新利用，避免了资源浪费；来源充足，采集150 mL左右的引流液即可以满足临床治疗的需求，另外取材也方便、不受年龄、时间等限制，患者无额外痛苦，无任何附加经济损耗，并且由于来自于患者自身，无伦理问题及免疫排斥反应。对于行关节手术的患者来说，提供了一种可行的间充质干细胞培养来源。

总之，术后引流液体外培养的间充质干细胞为组织工程修复关节软骨缺损提供新的来源和技术支持，具有广阔的发展前景；但研究仍存在着一些不足之处，没有与正常骨髓来源的间充质干细胞分化能力进行比较；同时，细胞的最佳纯化方法、细胞在分子水平的诱导机制、长期安全性等问题尚需要进一步观察和探索。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程