miR-21/Sprouty1功能轴调控绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.002

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3287-3292.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.002

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miR-21/Sprouty1功能轴调控绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨能力

杨楠¹，周威¹，王光²，丁寅³，金岩⁴

¹解放军第309医院口腔科，北京市 100091；²解放军91551部队门诊部，江西省九江市 332005；解放军第四军医大学口腔医院，³正畸科，⁴组织工程中心，陕西省西安市 710032

修回日期:2017-02-14 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 丁寅，博士生导师，主任医师，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032
作者简介:杨楠，女，1981年生，北京市人，满族，2012年解放军第四军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事口腔正畸及干细胞研究。
基金资助:
国家重点基础研究发展计划(2011CB96700)；国家自然科学基金(81400854)

miR-21/Sprouty1 function axis regulates the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells after postmenopausal osteoporosis

Yang Nan¹, Zhou Wei¹, Wang Guang², Ding Yin³, Jin Yan⁴

¹Department of Stomatology, the 309^th Hospital of PLA, Beijing 100091, China; ²Outpatient Department of Troop 91551, Jiujiang 332005, Jiangxi Province, China; ³Department of Orthodontics, Stomatology Hospital of Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; ⁴Center of Tissue Engineering, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Revised:2017-02-14 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Ding Yin, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Orthodontics, Stomatology Hospital of Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Yang Nan, M.D., Attending physician, Department of Stomatology, the 309th Hospital of PLA, Beijing 100091, China
Supported by:
the National Basic Research Program of China (973 Program), No. 2011CB96700; the National Natural Science Foundation of China, No. 81400854

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
miRNA：是一类具有18-25个核苷酸的非编码RNA，它通过与靶基因3’UTR区非完全配对来抑制靶基因的翻译和稳定，参与多种生物功能。
Runx2和Osterix与骨髓间充质干细胞的成骨分化：在骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化过程中，Runx2和Osterix是2个极为重要的转录因子。Runx2又称核心结合因子，属于runt域基因家族，体内外实验均表明Runx2为骨髓间充质干细胞成骨分化和骨发育所必需，Runx2基因是骨形成的关键基因。而Osterix则是一种新近发现的含锌指结构的转录因子，它虽不是Runx2表达所需的转录因子，但其位于成骨细胞分化路径中Runx2的下游调控成骨细胞的生成。

摘要
背景：成骨分化是一个复杂的网络，包括多种信号通路转录水平和转录后水平的调控，具体机制仍不清楚。研究关键miRNA对骨髓间充质干细胞成骨分化的调控作用对于治疗骨质疏松和骨缺损具有重要意义。
目的：探索miR-21/Sprouty1功能轴调控绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨能力。
方法：分离培养正常人和绝经后骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞，比较2组细胞的成骨能力。Real time RT-PCR和Western Blot检测2组细胞中miR-21和Spry1的表达。利用转染的方法上调绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中的miR-21水平，检测其成骨能力及Spry1的表达变化，Real time RT-PCR和Western Blot 检测成骨标志性基因Runx2和Osterix的表达。
结果与结论：①与正常人骨髓间充质干细胞相比，绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨能力明显减弱，而且miR-21表达下降，Spry1表达上升，miR-21-Spry1 功能轴受到抑制；②通过转染miR-21，下调Spry1，增加Runx2和Osterix的表达，能够部分恢复绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0605-2250(杨楠)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, miR-21, 绝经后骨质疏松, 成骨分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Osteogenic differentiation is a complex process involving transcriptional and post-transcriptional regulation by multiple signaling pathways, and the specific mechanisms remain unclear. It is of great significance to study the role of critical miRNAs in the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in the treatment of osteoporosis and bone defects.
OBJECTIVE: To explore the regulatory ability of miR-21/Sprouty1 function axis in the osteogenic differentiation of BMSCs in patients with postmenopausal osteoporosis.
METHODS: BMSCs were isolated from healthy people (H-hBMSCs) and patients with postmenopausal osteoporosis (PMOP-hBMSCs), and their osteogenic ability was compared. Expression of miR-21 and Spry1 at gene and protein levels was detected by real-time RT-PCR and western blot assay, respectively. miR-21 expression was upregulated via transfection in PMOP-hBMSCs, and the osteogenic ability and Spry1 expression of the cells were detected, while real-time RT-PCR and western blot were used to detect the expression of osteogenic marker genes, Runx2 and Osterix.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with H-hBMSCs, PMOP-hBMSCs osteogenic ability was weakened significantly, miR-21 expression decreased, and Spry1 expression increased, indicating an inhibition to the miR-21-Spry1 function axis. Through the transfection of miR-21 and down-regulation of Spry1, the expression levels of Runx2 and Osterix were increased, and PMOP-hBMSCs osteogenic ability was partially restored.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, MicroRNAs, Osteoporosis, Postmenopausal, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

杨楠，周威，王光，丁寅，金岩. miR-21/Sprouty1功能轴调控绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3287-3292.

Yang Nan, Zhou Wei, Wang Guang, Ding Yin, Jin Yan. miR-21/Sprouty1 function axis regulates the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells after postmenopausal osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3287-3292.

图/表（结果） 1

2.1 干细胞培养和鉴定结果 对照组和绝经后骨质疏松组患者的骨髓间充质干细胞多为梭形，呈成纤维细胞样，很少一部分为大的扁平状。流式细胞仪检测细胞表面标记，发现高表达间充质干细胞表面标志物STRO-1和CD146，同时也表达间充质标志物CD29，CD90，CD44。

2.2 绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨分化能力减弱 通过real time RT-PCR和Western Blot检测成骨分化过程中特异性表达基因Runx2和Osterix的表达，结果发现Runx2和Osterix在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中的表达低于正常人骨髓间充质干细胞。这一结果表明绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱(图1)。

2.3 miR-21在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中的表达量下降 为了进一步证明绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨能力的减弱是否与miR-21表达和功能异常有关，实验检测了原代培养的绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞中miR-21的表达。Real time RT-PCR结果显示，miR-21在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中的表达明显低于正常人骨髓间充质干细胞(图2)。

2.4 Spry1在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中表达明显上升 为了验证绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨能力的减弱是否与Spry1的异常表达相关，实验检测了原代培养的绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞中Spry1的表达。Real time RT PCR和 Western Blot结果显示，Spry1在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中的表达明显高于正常人骨髓间充质干细胞。这一结果与miR-21表达下降正好相反，说明miR-21-Spry1功能轴的异常表达可能和绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨能力减弱有关(图3)。

2.5 高表达miR-21能够恢复绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞受损的成骨能力 为了验证miR-21表达量下降是否和绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱相关，绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞转染miR-21的前体(pre-miR-21)和前体对照(pre-miR阴性对照)，正常人骨髓间充质干细胞转染前体对照，转染2 d后进行成骨诱导，分别于第7天和第21天进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色比较3组细胞的成骨能力。结果显示，转染率为80%，高表达miR-21的绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和钙结节的染色面积高于转染前体对照组，但是略低于正常人骨髓间充质干细胞转染前体对照组(图4 A-C)。

此外，采用real time RT-PCR和Western Blot分析成骨特异性基因Runx2和Osterix mRNA和蛋白表达。结果发现，成骨诱导7 d后，高表达miR-21组Runx2和Osterix的mRNA水平和蛋白水平明显高于转染前体对照组，但是略低于正常对照组(图4D，E)。同时还检测了3组细胞中Spry1的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，与转染前体对照组相比，高表达miR-21组中Spry1的mRNA和蛋白表达明显下降，但是仍略高于正常对照组(图4F，G)。

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引言

慢性炎症性骨病，是一类以骨量减少为主要特征的疾病，主要包括绝经后骨质疏松、类风湿性关节炎和牙周病等。这类疾病在全球范围内广泛流行，是造成骨折、骨缺损的主要原因，严重威胁着人类的健康。如何提高骨形成能力是治疗这类疾病的重要靶点。骨髓间充质干细胞是一群具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞，在不同的诱导环境下，它能向成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞和成神经细胞分化。研究表明，骨髓间充质干细胞是成骨细胞和骨细胞的源头细胞^[1-4]。诱导骨髓间充质干细胞定向分化为骨组织对于治疗炎症性骨病和修复骨缺损具有重要意义。成骨分化是一个复杂的网络，包括多种信号通路转录水平和转录后水平的调控，具体的机制仍不清楚。

miRNA是近年来发现的一类具有18-25个核苷酸的非编码RNA，它通过与靶基因3’UTR区非完全配对来抑制靶基因的翻译和稳定。研究发现miRNA对不同细胞的成骨分化具有调控作用。但是干细胞的成骨分化是个十分复杂的过程，可能涉及多个因子及不同信号通路相互协调来共同调控干细胞的成骨分化。因此，研究关键miRNA对骨髓间充质干细胞成骨分化的调控作用对于治疗骨质疏松和骨缺损具有重要意义^[5-8]。

在骨质疏松患者中，骨吸收加快而骨形成能力受损，骨形成和骨吸收之间的平衡破坏导致全身性的骨量减少。那么骨形成受损是否和骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降有关。miRNAs表达和功能的异常是否影响了骨髓间充质干细胞的成骨分化，目前还不清楚。课题组利用基因芯片方法筛查了绝经后骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞中差异性表达的miRNA^[9]。通过对基因芯片结果进行统计分析，发现miR-21在骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞中的表达明显下降^[10]。结合作者前期的研究结果，提示miR-21-Spry1通路能够促进人骨髓间充质干细胞体外体内成骨分化。作者推测，人雌激素缺乏导致的骨质疏松(绝经后骨质疏松)可能存在骨髓间充质干细成骨分化能力异常。miR-21的表达和功能异常可能在其中发挥着重要的调控作用。基于以上假设，作者首先分离培养绝经后骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞(PMOP-hBMSCs)和正常人骨髓间充质干细胞(H-hBMSCs)，在体外检测了2种细胞的成骨能力以及miR-21和Spry1的表达。通过转染技术，进一步研究miR-21/Sprouty1功能轴调控骨质疏松间充质干细胞的成骨能力，为雌激素缺乏骨质疏松的治疗奠定重要的分子基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2010年3月至2012年1月在解放军第四军医大学组织工程中心完成。

1.3 材料 p-MiR report 质粒(Invitrogen，美国)；分子生物级质粒抽提试剂盒(QIAGEN，德国)；胶回收试剂盒(Takala，日本)；DH5α感受态细胞(天根，中国)；胰化蛋白胨(Sigma，美国)；琼脂粉(Sigma，美国)；酵母提取物(Sigma，美国)；限制性内切酶(Fermentas，美国)；荧光素酶报告基因检测试剂(Promega，美国)；脂质体2000 (Invitrogen，美国)；荧光素酶报告检测系统(Progmega，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 样本的收集 经第四军医大学伦理委员会批准，患者知情同意后，在股骨头置换术中和开放性骨折术中抽取骨髓5 mL(对照组)，来自于5名健康妇女，年龄39-45岁。临床检查排除全身疾病史、吸烟史、特殊服药史。绝经后骨质疏松组样本取自5例诊断有绝经后骨质疏松的妇女，年龄53-63岁。诊断标准根据WHO诊断参数(腰椎或者股骨的T值低于-2.5 SD)。骨质疏松组和健康组的临床资料见表1。分别抽取对照组和骨质疏松组患者骨髓5 mL，置于枸橼酸锂抗凝管中。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的分离培养 在超净台内将骨髓与等体积的不含血清的低糖α-MEM培养液(青霉素钠100 U/mL和链霉素100 U/mL)混合，用吸管反复吹打使骨髓组织基本均匀分散。室温400×g离心10 min，去掉脂肪层，用低糖α-MEM培养液重悬细胞，缓慢注入预先加入等体积的1.073 g/mL Percoll分离液的离心管内，注意保持液体分界面完整(Percoll分离液位于下方，而稀释血液位于上方)，400×g离心30 min，吸取中间的单个核细胞层，PBS洗2次重悬于含体积分数为10%胎牛血清的低糖α-MEM养液(青霉素钠100 U/mL和链霉素100 U/mL)，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于25 cm²培养瓶中，置于CO₂孵箱中孵育。24 h后换液去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。待细胞生长至80%-90%融合时，用0.25%胰酶消化按1︰2比例传代培养。

1.4.3 miR-21和Spry1表达的检测 取对数生长期第3代骨髓间充质干细胞，加入成骨诱导液(含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，10^-⁸ mol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)诱导3周，裂解细胞提取RNA，并利用试剂盒进行反转录。然后进行real time RT-PCR检测分析骨髓间充质干细胞中miR-21的表达。采用real time RT-PCR和Western blot检测分析骨髓间充质干细胞中Spry1的表达。

1.4.4 荧光素酶报告基因载体的构建 根据酶切要求选择SpeⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切。β-gal质粒载体作为转染体系的内对照，设计合成扩增引物5’-GGA CTA GTC ATG AAC ATA CAC CCA CATCC-3’和5’-CCC AAG CTT GGA GAG GGC AGT GGT TAA AGG-3’，使用已有cDNA模板，扩增得到Sprouty1 3’UTR目的片段。通过双酶切、DNA电泳、胶回收、连接，转化、挑克隆、质粒提取等过程，构建荧光素酶报告基因载体。

1.4.5 Sprouty1 慢病毒载体的构建 设计合成扩增引物hSpry1V1.5，5’-CCA CGG TGA TCC TTA ATA TTG GT-3’；hSpry1V1.3，5’-CAA TTT CCC TGC TCC CAC GGT A-3’；hSpry1V1.5Kpnl，5’-GGG GTA CCA CGA GAT CAC TAC ACA TGG A-3’；hSpry11.3Xhol，5’-CCG CTC GAG CAT GAG TTA GAC CTT GGC AAC-3’。使用已有cDNA模板，扩增得到Sprouty 1目的片段。将目的基因片段连入pENTR^TM Dual Selection Vectors。将连好的基因片段转入慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST。

1.4.6 miR-21的转染 取生长对数期第3代骨髓间充质干细胞，于转染前1 d更换新鲜的培养液，保证细胞的生长活力。转染时，使用siPORT NeoFX转染试剂，转染pre-miR-21，pre-miR 阴性对照，转染后接种于6孔培养板内培养，每孔接种2×10⁵个细胞，待细胞生长达到70%以上融合时，更换成骨诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，10^-⁸ mol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)进行成骨诱导培养。

1.4.7 骨髓间充质干细胞成骨基因的表达 分别于成骨诱导第7天和第21天进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色比较3组细胞的成骨能力。成骨诱导第7天，Real time RT-PCR检测骨髓间充质干细胞成骨特异性基因Runx2和Osterix的mRNA表达。Western Blot分析骨髓间充质干细胞Runx2和Osterix的蛋白表达。

1.5 主要观察指标 ①对照组和绝经后骨质疏松组骨髓间充质干细胞中Runx2，Osterix的mRNA和蛋白表达；②对照组和绝经后骨质疏松组骨髓间充质干细胞中miR-21的mRNA表达；③对照组和绝经后骨质疏松组骨髓间充质干细胞中Spry1的mRNA和蛋白表达；④转染miR-21后，绝经后骨质疏松组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力和Runx2，Osterix，Spry1的mRNA和蛋白表达。

1.6 统计学分析 SPSS 18.0统计软件进行相关数据分析，计量资料用x(_)±s表示，采用t 检验进行比较，计数资料用百分比表示，采用χ²检验进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

miRNA是一类内生的、长度18-25个核苷酸的非编码短小RNA，它通过与靶基因3’非翻译区(3’UTR)的非完全配对来抑制它们的翻译和稳定，具有广泛的生物学功能。miRNA是在研究参与秀丽隐杆线虫发育基因的过程中首次被发现。随后在果蝇、小鼠及人类中都发现存在多种不同的miRNAs，至今为止在人类中已发现了一千多种miRNAs，而且还不断有新的miRNAs被陆续发现^[11-14]。

骨髓间充质干细胞的成骨分化对于骨的发育重建至关重要。除了经典的遗传学和表观遗传学调控之外，越来越多的研究表明miRNA也在这一过程中发挥着重要的作用。Dicer 或者Drosha是miRNAs成熟所必需的酶，它们的缺乏将导致所有miRNA形成缺陷。体内研究发现，在骨前体细胞中条件性敲除Dicer，导致小鼠出生后死亡，并且基因缺陷鼠存在明显的骨骼发育畸形和骨、软骨形成障碍。在成骨细胞中条件性剔除Dicer，导致小鼠出生后骨形成迟缓，但是在出生后4-8个月时，骨重建加快^[15-18]。在体外，利用shRNA沉默人骨髓间充质干细胞中Dicer的表达导致其成骨分化能力下降。这些结果说明miRNA 在骨形成中是不可或缺的^[19-21]。

研究表明，绝经后骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞成骨能力明显减弱。学者们通过研究绝经后骨质疏松经典动物模型骨髓间充质干细胞的成骨能力，也发现去势骨质疏松动物骨髓间充质干细胞的成骨能力也明显减弱。由于miRNAs能够调控骨髓间充质干细胞成骨分化和骨形成^[22-27]，作者推测miRNAs的表达异常与骨质疏松状态下骨髓间充质干细胞成骨能力低下有关。课题组前期筛查去卵巢骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞中差异性表达的miRNAs，发现miR-21在去势后骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞中表达量下降。对去势小鼠骨髓间充质干细胞全基因组芯片的筛查发现，Spry1在去势骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞中表达升高而与miR-21表达相反。这一结果说明miR-21/Spry1这一功能轴在骨质疏松骨髓间充质干细胞成骨分化异常中具有一定作用。

绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨分化能力明显下降，这在本实验中也得到了验证。由于细胞微环境以及细胞内自身的分子调控能影响miRNA的功能，miRNA 在不同的病理微环境中功能亦不同^[11]。实验结果显示miR-21在绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中表达明显下降，而Spry1表达上升。绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞转染miR-21前体后miR-21表达上调，伴随着Spry1表达下调，成骨能力增强，说明miR-21/Spry1轴在绝经后骨质疏松微环境下对骨髓间充质干细胞的成骨分化是有作用的，上调miR-21能有效降低Spry1的表达，并且能部分恢复绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨能力。

另外，该研究存在一定的局限性，只进行体外实验，并没有体内或者动物实验验证，将在未来的研究中继续研究。

综上所述，miR-21是调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的关键miRNA 之一，它通过负向调控FGF信号通路的抑制剂Spry1促进了人骨髓间充质干细胞的成骨分化。miR-21/Spry1功能轴受到抑制可能是绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨能力低下的原因之一。上调miR-21/Spry1功能轴能够部分恢复绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。这一机制有利于深刻理解骨髓间充质干细胞成骨分化机制及骨质疏松发病机制，并且提示可能通过调控miR-21来治疗一些由于骨髓间充质干细胞功能低下导致的骨疾病。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

miR-21/Sprouty1功能轴调控绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞的成骨能力

miR-21/Sprouty1 function axis regulates the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells after postmenopausal osteoporosis

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