多功能铁铋复合纳米粒对胶质母细胞瘤的放疗增敏作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.18.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (18): 2821-2827.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.18.006

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多功能铁铋复合纳米粒对胶质母细胞瘤的放疗增敏作用

牛媛媛¹，于明¹，杜凤移²，陈思远¹，赵天³，徐宇浩¹，周倩文¹，许修健¹

江苏大学附属医院，¹神经内科，³医学影像科，江苏省镇江市 212001；²江苏大学医学院，江苏省镇江市 212013

收稿日期:2017-01-13 出版日期:2017-06-28 发布日期:2017-07-07
通讯作者: 于明，博士，硕士生导师，主任医师，副教授，江苏大学附属医院神经内科，江苏省镇江市 212001
作者简介:牛媛媛，女，1989年生，河南省新乡市人，汉族，江苏大学在读硕士，主要从事新型纳米材料的研制及在心脑疾病中的应用研究。
基金资助:
江苏省“333工程”科研项目(BRA2014173)；江苏省“六大人才高峰”科研项目(WSN-038)

Fabrication of multifunctional bismuth-doped iron nanoparticle and its radiotherapy sensitization in glioblastoma

Niu Yuan-yuan¹, Yu Ming¹, Du Feng-yi², Chen Si-yuan¹, Zhao Tian³, Xu Yu-hao¹, Zhou Qian-wen¹, Xu Xiu-jian¹

¹Department of Neurology, ³Department of Imaging, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; ²Jiangsu University Medical School, Zhenjiang 212013, Jiangsu Province, China

Received:2017-01-13 Online:2017-06-28 Published:2017-07-07
Contact: Yu Ming, M.D., Master’s supervisor, Chief physician, Associate professor, Department of Neurology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
About author:Niu Yuan-yuan, Studying for master’s degree, Department of Neurology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Supported by:
the “333 Engineering” Scientific Research Project of Jiangsu Province, No. BRA2014173; the “Six Talent Peaks” Scientific Research Project of Jiangsu Province, No. WSN-038

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
放射增敏剂：是能够增强生物体放射敏感性的一类物质，它可增强射线对肿瘤的杀伤能力，特别有助于解决实体肿瘤中乏氧细胞对射线的抗性所导致肿瘤放疗治愈率低的问题。近年来纳米材料成为研究的热点，纳米粒子(如Au、Pt、Bi、Ta、Gd等)具有高X射线光子捕获截面和康普顿散射效应，产生的剂量增强效应可提高DNA等敏感靶分子的放射损伤，对受照细胞产生放射增敏作用。
透明质酸功能化的复合纳米材料：①此纳米粒子呈近似球形，粒径较为均一，单分散性好，没有团聚现象，能很好地被细胞吞噬；②实验的复合纳米材料是由具有放疗作用的铋离子和铁离子构成，经过透明质酸功能化后能与CD44特异性结合，聚集与肿瘤周围，可实现放疗增敏的效果。

背景：透明质酸功能化的铁铋复合纳米颗粒是一种有效MRI对比剂，同时又可作为放疗增敏剂。
目的：制备透明质酸功能化的铁铋复合纳米颗粒，观察其对胶质母细胞瘤U87MG的放疗增敏作用。
方法：通过水热聚醇法制备透明质酸功能化的铁铋复合纳米颗粒HA-BiIOPs。①细胞毒性实验：取对数生长期的人胶质母细胞瘤细胞株U87MG与大鼠血管平滑肌细胞，均以含0，12.5，25，50，100，200， 400 mg/L HA-BiIOPs的培养液培养48 h，计算细胞增殖率；②组织相容性实验：在ICR小鼠尾静脉注射HA-BiIOPs溶液，观察小鼠脏器病理变化；③细胞吞噬实验：将HA-BiIOPs与U87MG细胞共培养6 h，普鲁士蓝观察纳米颗粒是否被细胞吞噬；④放疗增敏实验：取对数生长期的U87MG细胞，分组培养：对照组以培养液培养；放疗组分别给予0，3，6，9 Gy的X射线照射；HA-BiIOPs组分别加入含0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L HA-BiIOPs的培养液；联合组，先加入含0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L HA-BiIOPs的培养液，再给予0，3，6，9 Gy的X射线照射。24 h后，检测细胞增殖率及克隆形成率。
结果与结论：①不同质量浓度的HA-BiIOPs对血管平滑肌细胞和U87MG细胞增殖无明显影响；②尾静脉注射HA-BiIOPs溶液后，小鼠脏器未发生病理变化；③共培养6 h 后，HA-BiIOPs纳米颗粒可被U87MG细胞吞噬；④U87MG细胞增殖率与HA-BiIOPs质量浓度(0-200 mg/L)和放射剂量(0-9 Gy)有明显的线性负相关，尤其是在6 Gy X射线照射下200 mg/L HA-BiIOPs对细胞增殖率下降至(41±7)%。选用100 mg/L HA-BiIOPs、6 Gy X射线照射进行克隆形成实验，联合组U87MG细胞增殖率明显低于空白对照组、放疗组(P < 0.05)；⑤结果表明，透明质酸功能化的铁铋复合纳米颗粒对胶质母细胞瘤具有显著的放疗增敏作用。

ORCID: 0000-0002-7785-8502(于明)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 铁铋复合纳米材料, 水热聚醇法, 放疗增敏, 透明质酸, 人胶质母细胞瘤细胞, 生物相容性, 杀伤肿瘤, 细胞增殖率

Abstract:

BACKGROUND: Bismth-doped iron nanoparticles modified by hyaluronic acid (HA-BiIOPs) not only act as an effective MRI contrast agent, but also as a radiotherapy sensitizer.
OBJECTIVE: To fabricate the HA-BiIOPs and to observe its effect to enhance the radiosensitivity of glioblastoma cells U87MG under X-ray radiation.
METHODS: HA-BiIOPs were synthesized using hydrothermal polyol method. (1) Cytotoxicity: A cytotoxicity test was carried out on U87MG cells and rat vascular smooth muscle cells (VSMCs). Cell proliferation rate of two kinds of cells cultured with different concentrations of HA-BiIOPs (0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 mg/L) at 24 hours after culture were determined by cell counting kit-8 assay. (2) Histological analysis: ICR mice were sacrificed after intravenous injection of HA-BiIOPs, and pathological changes of mouse visceral organs were observed under an optical microscope. (3) Cellular uptake: The HA-BiIOPs after entered into the cytoplasm were observed by Prussian blue staining. (4) Radiosensitization test: U87MG cells at Logarithmic growth stage were cultured in culture medium as control group, subjected to X-ray irradiation (0, 3, 6, 9 Gy) as radiotherapy group, cultured in HA-BiIOPs (0, 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 mg/L) as HA-BiIOPs group or subjected to HA-BiIOPs culture plus X-ray irradiation as combined therapy group. Then, the cell proliferation rate and cloning efficiency were measured at 24 hours after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The HA-BiIOPs at different concentrations were non-cytotoxic for VSMC and U87MG cells. (2) After intravenous injection of HA-BiIOPs, there was no obvious toxicity to the mouse susceptible organs. (3) After 6 hours of culture, the HA-BiIOPs could be internalized by U87MG cells. (4) The proliferation rate of U87cells was negatively correlated with the concentration of HA-BiIOPs (0-200 mg/L) and X-ray dose (0-9 Gy). Especially, the combination of 6 Gy X-ray irradiation with 200 mg/L HA-BiIOPs dramatically decreased the cell viability that was decreased to (41±7)%. In the combined therapy group with 6 Gy X-ray and 100 mg/L HA-BiIOPs, the cells proliferation rate was significantly lower than that in the control and radiotherapy groups (P < 0.05). These results indicate that HA-BiIOPs have a radiosensitizative effect on glioblastoma cells U87MG.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hyaluronic Acid, Nanocomposites, Glioblastoma, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

牛媛媛，于明，杜凤移，陈思远，赵天，徐宇浩，周倩文，许修健. 多功能铁铋复合纳米粒对胶质母细胞瘤的放疗增敏作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(18): 2821-2827.

Niu Yuan-yuan, Yu Ming, Du Feng-yi, Chen Si-yuan, Zhao Tian, Xu Yu-hao, Zhou Qian-wen, Xu Xiu-jian. Fabrication of multifunctional bismuth-doped iron nanoparticle and its radiotherapy sensitization in glioblastoma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(18): 2821-2827.

图/表（结果） 8

2.1 HA-BiIOPs的理化特性表征通过水热聚醇法，利用乙二醇、三氯化铁、氯化铋和乙酸钠成功构建透明质酸功能化的复合材料HA-BiIOPs，见图1。

用透射电子显微镜表征HA-BiIOPs的粒径和形貌特征，镜下呈近似球形，粒径较为均一，单分散性较好，没有团聚现象，见图2A、B。纳米颗粒跟踪分析仪测得HA-BiIOPs粒径约为55 nm，见图2C。X射线衍射图谱显示HA-BiIOPs在220、321、420、510、520、700处有较宽的衍射峰，表明其内部具有较好的晶体结构，为可定形的物相结构，见图2D。

2.2 HA-BiIOPs的磁性测试取0.01 g HA-BiIOPs溶于 1 mL PBS中，超声震荡20 min后，为均一的黑色溶液，见图3A；用吸铁石吸附瓶身，见图3B。可见HA-BiIOPs全部聚集在磁铁处，瓶内呈现澄清液体，共用时约2 min。去除吸铁石后，摇晃瓶身，HA-BiIOPs又重新均匀分散在PBS中，证实HA-BiIOPs为顺磁性纳米颗粒。

2.3 CCK-8细胞毒性测试结果实验结果显示，0，12.5，25，50，100，200，400mg/L HA-BiIOPs组血管平滑肌细胞的增殖率分别为(105±7.5)%、(99.7±2.3)%、(99.4±2.4)%，(98.7±1.2)%、(95.7±0.7)%、(97.5±5.2)%、(98.6±1.6)%；0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L HA- BiIOPs组U87MG细胞的增殖率分别为(99.0±1.8)%、(98.0±4)%、(100.0±5.2)%，(103.0±4.2)%、(103.0±5.8)%、(98.0±2.7)%、(106.0±2.0)%。随着材料质量浓度的增高，两种细胞的增殖率无降低趋势，各组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明HA-BiIOPs对细胞无明显毒性，见图4。

2.4 U87MG细胞吞噬实验结果 HA-BiIOPs与U87MG细胞共培养6 h，红染的细胞膜内存在被蓝染的含Fe纳米颗粒(HA-BiIOPs)，见图5，证明HA-BiIOPs可以被U87MG细胞摄取，为发挥放疗增敏作用奠定基础。

2.5 HA-BiIOPs的组织相容性实验结果苏木精-伊红染色显示小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器均无水肿、坏死等炎症反应，组织学上无任何形态变化，见图6。

2.6 放疗增敏实验结果 U87MG细胞增殖率与HA-BiIOPs质量浓度(0-200 mg/L)和放射剂量(0-9 Gy)有明显的线性负相关，尤其是在6 Gy X线照射下，200 mg/L的HA-BiIOPs使细胞增殖率下降至(41±7)%，结果充分表明了HA-BiIOPs的放疗增敏能力，见图7；但当HA-BiIOPs质量浓度达到400 mg/L时，细胞增殖率为(40±2)%。考虑细胞吞噬纳米颗粒存在着浓度饱和性，同时为了减少过剩的HA-BiIOPs影响U87MG细胞的生存环境，根据细胞活性CCK-8的结果，选用100 mg/L的HA-BiIOPs在6 Gy X线照射下进行克隆形成实验。结果表明，HA-BiIOPs组与空白对照组的U87MG细胞克隆形成无明显差异；放疗组U87MG细胞克隆增殖率下降到46%，联合组U87MG细胞克隆增殖率达29%，与放疗组相比，联合组细胞增殖率下降明显(P < 0.05)，因此说明HA-BiIOPs具有放疗增敏能力，见图8。

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引言

材料方法

1.1 设计材料制备与表征实验。

1.2 时间及地点实验于2016年1至5月在江苏大学医学院完成。

1.3 材料

实验动物：4周龄雌性ICR小鼠，体质量约20 g，购于江苏大学动物实验中心，合格证号：201601826，饲养严格遵守相关标准进行饲养，且对小鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则。

主要细胞、试剂与仪器：人胶质母细胞瘤细胞株U87MG、大鼠血管平滑肌细胞购于上海肿瘤研究所。三氯化铁、氯化铋、透明质酸、乙二醇和无水乙酸钠购于阿拉丁公司；胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM购于Gibco公司(美国)；CCK-8试剂盒购于诺维赞公司。NanoSight LM10 纳米颗粒跟踪分析仪(英国)；透射电子显微镜购于JEOL公司(日本)；酶标仪购于Thermo公司(美国)；电子直线加速器购于西门子公司(德国Oncor)；X射线衍射仪BRUKER公司(德国)。

1.4 实验方法

1.4.1 构建HA-BiIOPs 将0.6 g六水氯化铋、0.4 g六水三氯化铁溶于40 mL乙二醇中，室温剧烈搅拌1 h至透亮液体；缓慢加入3.0 g无水乙酸钠搅拌30 min；加入0.1 g透明质酸钠搅拌1 h；将溶液转移至反应釜中，200 ℃ 加热3 h；冷却至室温后用外界吸铁石吸附，双蒸水、无水乙醇清洗6次后冻干，获得HA-BiIOPs粉末。

1.4.2 表征实验利用纳米颗粒跟踪分析仪、透射电子显微镜检测HA-BiIOPs的粒径和形貌，利用X射线衍射仪表征其晶体结构，利用磁铁吸附测试其磁性能力。

1.4.3 CCK-8细胞毒性实验将血管平滑肌细胞和U87MG分别培养在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中待用；若细胞状态良好，取对数生长期的细胞接种于96 孔板(3 000/孔)，将培养板置于细胞培养箱中24 h；待两种细胞都完全贴壁后，弃去孔中的培养液，分别加入含有不同质量浓度HA-BiIOPs(0-400 mg/L)的培养液继续培养48 h；弃去含有HA-BiIOPs的培养液，加入含有10 µL CCK-8 溶液的新鲜培养液，置于37 ℃细胞孵箱中培养 2 h；在酶标仪上测定波长在490 nm的A值。

1.4.4 组织相容性实验用PBS配置HA-BiIOPs溶液。取12只等条件喂养的ICR小鼠，随机分为空白对照组和实验组，实验组经尾静脉注射10 mg/kg HA-BiIOPs溶液 200 μL，14 d后CO₂麻醉处死，取心、肝、脾、肺、肾和脑，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定过夜、脱水透明、浸蜡包埋、切片、贴片、脱蜡染色(苏木精-伊红染色)、树脂封固、显微镜下观察组织形态。

1.4.5 U87MG细胞吞噬实验将HA-BiIOPs与U87MG细胞共培养6 h后，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定 45 min，PBS清洗3次，HA-BiIOPs普鲁士蓝染色，细胞伊红染色30 min(每次染色后均需用PBS清洗3次)，用显微镜拍照。

1.4.6 放疗增敏实验

细胞照射条件：采用西门子Oncor医用直线加速器，源皮距为100 cm、照射野10 cm×10 cm，予6 MV X线照射(剂量率为200 cGy/min)，根据实验要求照射不同剂量(0，3，6，9 Gy)。照射后的细胞置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度培养箱中继续培养72 h。

取对数生长期的U87MG细胞，以3 000/孔接种于4个96孔细胞培养板，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养24 h。然后将4个细胞培养板随机分为以下4组：①空白对照组：只给予培养液；②HA-BiIOPs组：分别加入含不同质量浓度(0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L)HA-BiIOPs的培养液；③放疗组：给予不同放疗剂量的X射线照射(0，3，6，9 Gy)；④联合组：先加入含不同质量浓度(0，12.5，25，50，100，200， 400 mg/L)HA-BiIOPs的培养液，然后给予不同剂量的X射线照射(0、3，6，9 Gy)。经上述处理后，细胞继续培养 72 h；弃去含有HA-BiIOPs的培养基，加入含有10 µL CCK-8溶液的新鲜培养液，置入37 ℃的细胞孵箱中孵育 2 h。在酶标仪上测定波长在490 nm的A值。每个浓度设置5个平行复孔，按以下公式计算细胞增殖率：细胞增殖率= (实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4.7 克隆形成实验将U87MG细胞消化、离心、重悬、计数，以1 000/孔接种于6孔板，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养24 h。将细胞分为空白对照组、放疗组、HA-BiIOPs组、联合组，参照放疗增敏实验，HA-BiIOPs质量浓度选取为100 mg/L，X射线照射条件为6 Gy。对各组采取相应处理后，继续培养14 d，弃培养液，PBS洗3次，40 g/L低聚甲醛固定45 min，0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下计数(50个细胞的克隆数)。按以下公式计算克隆形成率：克隆形成率(%)=克隆形成平均数/接种细胞数×100%。

1.5 主要观察指标 ①HA-BiIOPs粒径大小和形貌特征以及磁性能力；②HA-BiIOPs的细胞和组织相容性；③ HA-BiIOPs被U87MG细胞吞噬情况；④不同浓度HA-BiIOPs对胶质母细胞瘤细胞产生放疗增敏的能力，计算最佳放疗强度和最佳HA-BiIOPs浓度；⑤放疗后U87MG细胞的克隆形成能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理实验数据，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用方差分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

放射增敏剂是能够增强生物体放射敏感性的一类物质^[8]，它可增强射线对肿瘤的杀伤能力，特别是有助于解决实体肿瘤中乏氧细胞对射线抗性所导致肿瘤放疗治愈率低的问题^[9-10]。近年来纳米材料成为研究的热点，纳米粒子(如Au、Pt、Bi、Ta、Gd等)具有高X射线光子捕获截面和康普顿散射效应^[11-12]，产生的剂量增强效应可提高DNA等敏感靶分子的放射损伤^[13]，对受照细胞产生放射增敏作用^[14]。纳米铁作为一种较为成熟的纳米材料，自身具有超顺磁性^[15]，可用于磁共振成像^[16]，同时具有光热效应^[17]，还可作为载体负载药物，这些均可用于开发新的药物，用于疾病诊断和治疗的研究^[18]。近年来在X射线放射治疗研究中，成功地实现了Bi₂O₃纳米颗粒对荷瘤小鼠模型的显著放射增敏作用^[19]，对肿瘤生长有明显的抑制作用^[20]。同时，低成本的铋元素相比纳米金来说是更好商业候选者^[21-23]。因此实验制备的HA-BiIOPs既是一种有效的MRI对比剂，同时又可作为一种放疗增敏剂。实体瘤的脉管系统和淋巴系统缺陷可导致内皮间隙增加，大分子和纳米粒子选择性渗透增加，产生高通透性和滞留效应效应^[24]。由于高通透性和滞留效应的被动靶向作用，尺寸合适的纳米颗粒能在肿瘤部位聚集，有利于其在肿瘤中发挥诊断和治疗作用，实现纳米颗粒的诊疗一体化^[25-27]。

透明质酸是一种天然多聚糖，由于其生物相容性、无毒、可生物降解等特点主要用做适配体。更重要的是，透明质酸可与肿瘤中高表达的CD44结合^[28]，达到间接靶向肿瘤的目的。实验制备的透明质酸修饰后BiIOPs具有良好的水溶性、组织相容性且粒径约为35 nm，易聚集在肿瘤部位，产生较强的高通透性和滞留效应。

在恶性肿瘤放疗中，经常会遇到放疗后肿瘤复发、放射抗拒、高能射线应用使皮肤受照剂量增加及肿瘤病灶周围正常组织辐射损伤等^[29-30]，一直是困扰肿瘤放射治疗疗效与应用的棘手问题，尤其是对于某些具有辐射抗性的肿瘤这一问题就更显严重和突出^[31-32]。提高肿瘤组织照射剂量的同时最大限度地保护正常组织一直是肿瘤放射治疗追求的目标^[33]，因此，寻找理想放射增敏剂就成为提高治疗增益比的一条重要途径^[34]。复合纳米颗粒作为纳米家族的新秀之星，具有多模态的功能^[35]。实验用水热法构建的BiIOPs颗粒易于制备、稳定性好、形态及尺寸可控等优点，使其在肿瘤的早期诊断与治疗中表现出巨大的应用潜力，尤其是作为新型造影剂在肿瘤成像以及作为放射增敏剂在放射治疗等方面。关于HA-BiIOPs的研究工作尚处在初级阶段还存在许多迫切需要解决的问题，如何降低HA-BiIOPs慢性毒性，如何提高生物稳定性及明确HA-BiIOPs在放射治疗中的增敏机制等。尽管金属纳米材料在放疗增敏领域尚无大量研究，但随着对该领域的重视和研究的深入，纳米材料将作为新型放疗增敏剂应用于脑胶质瘤的治疗，成为临床肿瘤治疗中的一个重要手段。总之，金属纳米材料在放疗增敏领域的研究及临床应用具有十分广阔的前景，将会不断深入探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

多功能铁铋复合纳米粒对胶质母细胞瘤的放疗增敏作用

Fabrication of multifunctional bismuth-doped iron nanoparticle and its radiotherapy sensitization in glioblastoma

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