用于生物人工肝反应器构建三维支架材料的选择与优化

doi:10.12307/2021.053

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (28): 4429-4434.doi: 10.12307/2021.053

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用于生物人工肝反应器构建三维支架材料的选择与优化

陈黎1，黄蕾2，余梦瑶2，张国英1，张世昌2，3

南京医科大学第一附属医院，1产科，2检验学部，江苏省南京市 210029；3第三军医大学西南医院传染科，重庆市 400038

收稿日期:2020-06-15 修回日期:2020-06-18 接受日期:2020-07-29 出版日期:2021-10-08 发布日期:2021-05-14
通讯作者: 张世昌，博士，副教授，硕士生导师，南京医科大学第一附属医院检验学部，江苏省南京市 210029；第三军医大学西南医院传染科，重庆市 400038 E-mail:zsc78@yeah.net
作者简介:陈黎，女，1979年生，江苏省南京市人，汉族，2012年英国Warwick大学毕业，博士，副教授，主要从事早产发生机制与再生医学相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81671836)，项目负责人：张世昌

Screening and optimization of three-dimensional scaffolds for the construction of bioartificial liver bioreactor

Chen Li1, Huang Lei2, Yu Mengyao2, Zhang Guoying1, Zhang Shichang2,3

1Department of Obstetrics, 2Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; 3Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Received:2020-06-15 Revised:2020-06-18 Accepted:2020-07-29 Online:2021-10-08 Published:2021-05-14
Contact: Zhang Shichang, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China E-mail:zsc78@yeah.net
About author:Chen Li, MD, Associate professor, Department of Obstetrics, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671836 (to ZSC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物人工肝：指含有生物成分，能够综合发挥肝脏氧化脱毒、生物转化、分泌与合成等功能的人工肝支持系统，用于终末期肝病的短期肝脏功能替代治疗，主要由生物反应器、肝细胞和体外辅助装置等组成。
人工肝生物反应器：指生物人工肝中用于支持肝细胞或其他细胞培养并发挥细胞功能的生物反应装置。理想的人工肝生物反应器需实现肝细胞培养、物质传输、免疫阻隔等作用的有效结合，目前常见生物反应器包括中空纤维型、灌流式/支架型、细胞包裹/悬液型、平板式生物反应器。

背景：生物反应器是生物人工肝的核心部分，其性能直接关系到生物人工肝支持治疗的效果和作用。将支架材料应用于中空纤维性反应器中有望解决中空纤维型反应器对肝细胞培养支持不足的问题。
目的：筛选可用于生物人工肝反应器构建的三维支架材料。
方法：检测聚氨酯、壳聚糖、聚乳酸-聚羟乙酸酯支架材料的孔隙率。将HL-7702人肝细胞分别接种于3种支架上，培养4 h时，检测细胞接种率；培养24 h时，检测细胞活性与细胞内乳酸脱氢酶漏出量；培养3 d时，检测细胞内白蛋白合成量。根据上述实验结果选择聚氨酯进行以下实验：鼠尾胶原被覆组，以鼠尾胶原溶液浸泡材料后接种HL-7702人肝细胞悬液；纤维蛋白凝胶组，以含纤维蛋白原的培养液重悬HL-7702人肝细胞，随后接种于支架上；聚氨酯对照组，直接接种HL-7702人肝细胞悬液。培养1，3，5，7 d后，检测细胞活性、细胞内乳酸脱氢酶漏出量与白蛋白合成量。
结果与结论：①3种支架均为多孔结构，聚氨酯和壳聚糖有较好的弹性，聚乳酸-聚羟乙酸酯质地较硬，聚氨酯和壳聚糖支架材料的孔隙率显著高于聚乳酸-聚羟乙酸酯(P < 0.05)；②聚氨酯内的细胞接种率高于聚乳酸-聚羟乙酸酯(P < 0.05)，低于壳聚糖(P < 0.05)；聚氨酯、壳聚糖内的细胞活性与白蛋白合成量高于聚乳酸-聚羟乙酸酯(P < 0.05)；3组间的细胞内乳酸脱氢酶漏出量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③纤维蛋白凝胶组的细胞分布较聚氨酯对照组、鼠尾胶原被覆组均匀，培养3，5，7 d的细胞活性与白蛋白含量高于聚氨酯对照组、鼠尾胶原被覆组(P < 0.05)，培养3，5，7 d的乳酸脱氢酶漏出量低于聚氨酯对照组、鼠尾胶原被覆组(P < 0.05)；④结果表明，聚氨酯支架材料经纤维蛋白凝胶优化培养可用于生物人工肝反应器的构建。
https://orcid.org/0000-0002-6673-2963(陈黎)；https://orcid.org/0000-0002-6587-2518(张世昌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 支架材料, 三维支架, 聚氨酯, 生物反应器, 生物人工肝, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Bioreactor is the core part of bioartificial liver, and its performance determines the effect of bioartificial liver support therapy. The application of scaffolds in hollow fiber bioreactor is expected to solve the problem of insufficient support for hepatocyte culture.

OBJECTIVE: To screen three-dimensional scaffolds for the development of bioartificial liver reactor.
METHODS: The porosity of polyurethane, chitosan and poly(DL-lactide-co-glycolide) scaffolds was detected. HL-7702 human hepatocytes were seeded on three kinds of scaffolds respectively, and the cell inoculation rate was detected at 4 hours; the cell viability and lactate dehydrogenase leakage were detected at 24 hours; and the intracellular albumin synthesis was detected at 3 days. According to the above experimental results, polyurethane was selected in the following experiment. In the rat tail collagen coating group, material was inoculated with rat tail collagen solution and then inoculated with HL-7702 human hepatocyte suspension. In the fibrin gel group, HL-7702 human hepatocytes were resuspended in fibrinogen culture medium, and then inoculated on the scaffold. In the polyurethane control group, material was inoculated with HL-7702 human hepatocyte suspension directly. After 1, 3, 5, and 7 days of culture, cell viability, lactate dehydrogenase leakage and albumin synthesis were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The three kinds of scaffolds were porous. Polyurethane and chitosan scaffolds had good elasticity, but poly(DL-lactide-co-glycolide) scaffold was hard. The porosity of polyurethane and chitosan scaffolds was significantly higher than that of poly(DL-lactide-co-glycolide) scaffold (P < 0.05). (2) The inoculation rate of cells in polyurethane scaffold was significantly higher than that in poly(DL-lactide-co-glycolide) scaffold (P < 0.05), and significantly lower than that in chitosan scaffold (P < 0.05). The cell viability and albumin synthesis of cells cultured in polyurethane and chitosan scaffolds were significantly higher than that of poly(DL-lactide-co-glycolide) scaffold (P < 0.05). There was no significant difference in lactate dehydrogenase leakage among the three groups (P > 0.05). (3) The cell distribution of fibrin gel group was more homogeneous than that of polyurethane control group and rat tail collagen coating group. The cell viability and albumin content at 3, 5, and 7 days after culture were higher than those of polyurethane control group and rat tail collagen coating group (P < 0.05). The lactate dehydrogenase leakage amount at 3, 5, and 7 days of culture was lower than that of polyurethane control group and rat tail collagen coating group (P < 0.05). (4) Our results suggested that fibrin gel optimized polyurethane scaffolds could be used in the construction of bioartificial liver reactor.

Key words: material, scaffold, three-dimensional scaffold, polyurethane, bioreactor, bioartificial liver, biocompatibility

中图分类号:

陈黎, 黄蕾, 余梦瑶, 张国英, 张世昌. 用于生物人工肝反应器构建三维支架材料的选择与优化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4429-4434.

Chen Li, Huang Lei, Yu Mengyao, Zhang Guoying, Zhang Shichang. Screening and optimization of three-dimensional scaffolds for the construction of bioartificial liver bioreactor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(28): 4429-4434.

图/表（结果） 9

2.1 三维支架材料的结构特点聚氨酯支架材料有良好的弹性和抗牵拉能力；壳聚糖有较好的弹性，但亦拉断；聚乳酸-聚羟乙酸酯质地较硬，缺少弹性和可牵拉能力。倒置相差显微镜下3种材料均为多孔性三维支架材料，聚氨酯支架材料的微孔大小不均一，孔壁较薄；壳聚糖的微孔较小，大小相对较为均一，孔壁较薄；聚乳酸-聚羟乙酸酯的微孔大小不均一，孔壁较厚，透光性较差，见图1。

2.2 三维支架材料的孔隙率和微孔直径聚氨酯的孔隙率较高，与壳聚糖孔隙率相比差异无显著性意义(P > 0.05)，这两种材料的孔隙率显著高于聚乳酸-聚羟乙酸酯(P < 0.05)。聚氨酯的微孔直径在100-1 000 μm之间，孔径大小差异较大；壳聚糖的微孔直径在50-300 μm之间，孔径大小较均一；聚乳酸-聚羟乙酸酯的孔径在100-500 μm之间，平均值与聚氨酯接近，见表1。

2.3 支架材料与肝细胞的生物相容性
2.3.1 支架材料内的细胞接种率聚氨酯内的细胞接种率高于聚乳酸-聚羟乙酸酯(P < 0.05)，壳聚糖内的细胞接种率最高，高于聚氨酯和聚乳酸-聚羟乙酸酯(P < 0.05)，见表2。

2.3.2 支架材料内的细胞生长情况由于三维支架材料均有一定厚度，倒置相差显微镜下难以观察L02细胞在支架材料内的分布，因此利用FDA染色显示活细胞，荧光显微镜下观察可见，L02细胞在聚氨酯和聚乳酸-聚羟乙酸酯内均黏附微孔壁生长，聚氨酯上的L02细胞分布更均匀；利用MTT试剂在细胞内形成的结晶能够增加细胞与材料的对比度，倒置相差显微镜下可见L02细胞在壳聚糖内呈黑色的多细胞聚集体，大多不贴壁生长，见图2。

2.3.3 三维支架材料内的细胞活性聚氨酯和壳聚糖内的L02细胞活性均较高，两者之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；聚乳酸-聚羟乙酸酯内的L02细胞活性较低，低于聚氨酯和壳聚糖(P < 0.05)，见表2。
2.3.4 三维支架材料内的细胞乳酸脱氢酶漏出量聚乳酸-聚羟乙酸酯内的细胞乳酸脱氢酶漏出量稍高于聚氨酯和壳聚糖，但三者之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。
2.3.5 三维支架材料的细胞白蛋白合成量 3种三维支架材料内的L02细胞均能合成大量白蛋白，聚氨酯与壳聚糖内的细胞白蛋白合成量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但聚乳酸-聚羟乙酸酯内的细胞白蛋白合成量低于壳聚糖和聚氨酯(P < 0.05)，见表2。

2.4 聚氨酯材料内细胞培养条件的优化
2.4.1 优化培养的细胞形态观察利用FDA染色聚氨酯内的活细胞，荧光显微镜下可见，鼠尾胶原被覆组的L02细胞在材料内贴壁生长，其贴壁细胞数量明显高于聚氨酯对照组，见图3A、B；纤维蛋白凝胶组的L02细胞经MTT染色呈黑色的球形体，并且均匀分布在材料微孔内，见图3C。

2.4.2 优化培养的细胞活性鼠尾胶原被覆组和聚氨酯对照组的L02细胞活性在前3 d升高明显，从第3天开始，鼠尾胶原被覆组的细胞活性显著高于聚氨酯对照组(P < 0.05)；纤维蛋白凝胶组的L02细胞活性在7 d内显著升高(P < 0.05)，除第1 天与鼠尾胶原被覆组、聚氨酯对照组无显著差异外(P > 0.05)，第3，5，7天的细胞活性高于聚氨酯对照组、鼠尾胶原被覆组(P < 0.05)，见图4。

2.4.3 优化培养的细胞乳酸脱氢酶漏出量聚氨酯对照组和鼠尾胶原被覆组的乳酸脱氢酶漏出量在培养的前5 d缓慢升高，在第7天升高迅速；纤维蛋白凝胶组的乳酸脱氢酶漏出量在前5 d维持稳定，在第7天升高明显；第1天时，3组间乳酸脱氢酶漏出量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；从第3天开始，聚氨酯对照组的乳酸脱氢酶漏出量高于鼠尾胶原被覆组、纤维蛋白凝胶组(P < 0.05)，纤维蛋白凝胶组低于鼠尾胶原组(P < 0.05)，见图5。

2.4.4 优化培养的细胞白蛋白合成量鼠尾胶原被覆组和聚氨酯对照组的L02细胞白蛋白合成量在第3天最高，随后呈下降趋势，纤维蛋白凝胶组的白蛋白合成量在7 d内逐渐上升；第1天时，3组间白蛋白合成量比较差异无显著性意义
(P > 0.05)；第3，5，7天时，鼠尾胶原被覆组白蛋白合成量高于聚氨酯对照组(P < 0.05)，纤维蛋白凝胶组高于鼠尾胶原被覆组、聚氨酯对照组(P < 0.05)，见图6。

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引言

肝功能衰竭是各种严重肝病的终末期表现，肝移植是肝功能衰竭治疗的最有效手段，但供肝来源紧缺限制了肝移植的广泛使用。以培养肝细胞为材料的体外生物人工肝支持系统，有望为肝功能衰竭患者等待肝移植或通过自身肝再生恢复提供过渡的“桥梁”[1-3]。生物人工肝的3大要素是生物反应器、肝细胞和体外装置，其中生物反应器是生物人工肝的核心部分，其性能直接关系到生物人工肝支持治疗的效果和作用[4-6]。中空纤维型生物反应器具备良好的免疫阻隔作用，是目前应用最广泛的生物反应器[7-8]，但肝细胞在这种反应器内分布不均匀，易沉积底部，难以提供三维肝细胞培养微环境[9-10]。以往研究试图利用中空纤维为肝细胞提供三维支持，研制出中空纤维三维编织型、氧合中空纤维型、螺旋编织纤维型等生物反应器[11-15]，虽然能够部分改善肝细胞在生物反应器内的分布，但仍难以使肝细胞分布均匀，不能为肝细胞培养提供令人满意的三维微环境，无法提高生物反应器的肝支持效果。三维支架材料是改善肝细胞培养三维微环境的理想方法，在三维支架材料内培养的肝细胞能够形成具有较强肝细胞功能的肝组织，将三维支架材料应用于中空纤维型生物反应器的设计与构建中，有可能使肝细胞在生物反应器内分布更均匀，为生物反应器的组织化培养提供可能[16]。实验对比分析多种三维支架材料的孔隙率、孔径、物理特性等结构特点，观察其与肝细胞的相容性，并进一步优化培养条件，以探讨将三维支架材料用于构建人工肝生物反应器的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2006年12月至2008年12月在第三军医大学西南医院感染科实验室完成。
1.3 材料三维多孔支架材料壳聚糖、聚乳酸-聚羟乙酸酯、聚氨酯分别由解放军军事科学院卫生装备研究所、山东生物材料研究所、四川大学高分子科学与工程学院提供。L02细胞(即HL-7702人肝细胞)来源于正常人肝组织的人肝细胞株，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
1.3.1 实验用主要试剂鼠尾胶原、二乙酸荧光素(FDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、DMSO(美国Sigma)；牛纤维蛋白原和牛凝血酶(北京库尔科技有限公司)；RPMI-1640培养基、新生小牛血清、胰酶、PBS(美国Gibco)；人白蛋白ELISA检测试剂盒(美国Bethyl Lab公司)。
1.3.2 实验用主要仪器倒置相差显微镜和荧光显微镜(IX70型，日本Olympus公司)；酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；细胞培养箱(德国Nuaire公司)；自动生化分析仪(日本HITACH公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 三维支架材料的结构观察和微孔直径测定将三维多孔支架材料壳聚糖、聚乳酸-聚羟乙酸酯、聚氨酯分别手工裁剪成厚度0.2 cm的薄片，分别在倒置相差显微镜下观察。随机选取10个视野，利用标尺测定支架材料每个微孔的直径，计算平均值。
1.4.2 支架材料孔隙率的测定将3种支架材料裁剪成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的立方体即1.0 mL体积，每种材料6块。将立方体材料置双蒸水内，用负压泵排空支架材料内的空气；取出支架材料，5 000 r/min离心5 min，收集支架材料内的液体，测定支架材料内的液体体积。计算孔隙率，孔隙率(%)=支架材料内液体体积(μL)/支架材料体积×100%。
1.4.3 支架材料内细胞接种率测定将聚氨酯、壳聚糖、聚乳酸-聚羟乙酸酯3种支架材料裁剪成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的立方形即1.0 mL体积，各6块，用60Co照射消毒后备用。胰酶消化培养的L02细胞，用含体积分数10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液制成1×109 L-1的细胞悬液，将1 mL细胞悬液分别接种至3种支架材料上，尽量排空支架内的气泡，置培养板内在细胞培养箱培养。培养4 h后，将支架材料取出，收集培养板内的细胞，并用血细胞计数板计数未接种上的剩余细胞数，计算细胞接种率，细胞接种率(%)=(接种细胞总数－剩余细胞数)/接种细胞总数×100%。
1.4.4 支架材料的处理和细胞接种将3种支架材料裁剪成24孔培养板孔大小，厚0.5 cm，铺在12孔培养板孔内；PBS漂洗3次，烤干后用60Co照射消毒，使用前用培养液漂洗3次。将对数生长期的L02细胞用胰酶消化，用含体积分数10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液配制成4×107 L-1的细胞悬液，每孔支架材料内接种细胞悬液0.5 mL，置入37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内培养4 h后，每孔加含体积分数10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液1.5 mL，继续在细胞培养箱培养。培养24 h后进行细胞活性和乳酸脱氢酶漏出量检测，培养3 d后进行白蛋白合成量检测。通过实验结果选择物理特性和肝细胞相容性更好的支架材料进行培养条件的优化。
1.4.5 聚氨酯材料内肝细胞培养条件的优化聚氨酯材料的分组处理和细胞接种：①鼠尾胶原被覆组：将消毒过的聚氨酯材料用10 mg/L的鼠尾胶原溶液浸泡1 h以上，PBS漂洗5次，吸净支架内的液体，用含体积分数10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液将L02细胞配制成浓度为4×107 L-1的细胞悬液，每块材料接种0.5 mL细胞悬液，37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱培养4 h后，每孔加含体积分数10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液1.5 mL继续培养；②纤维蛋白凝胶组：用凝血酶溶液漂洗聚氨酯材料1次，吸净支架内的液体，用RPMI-1640培养液将纤维蛋白原储存液稀释成质量浓度为1 g/L，用该液体将L02细胞配制浓度为4×107 L-1细胞悬液，每块材料接种0.5 mL细胞悬液，形成纤维蛋白凝胶后，每孔加含体积分数10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液1.5 mL继续培养；③聚氨酯对照组：聚氨酯材料不经任何处理，每块材料接种0.5 mL浓度为4×107 L-1的细胞悬液，37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱培养4 h后，每孔加含体积分数10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液1.5 mL继续培养。
1.4.6 支架材料内L02细胞生长情况观察培养24 h后，在需观察的聚氨酯和聚乳酸-聚羟乙酸酯材料内加入4 μL FDA储存液，置37 ℃培养箱孵育10-15 min，吸弃上清，PBS漂洗细胞3次，荧光显微镜下观察每种材料上的细胞生长和贴壁情况。在细胞培养24 h后，在需观察的壳聚糖材料内加入5 g/L的MTT溶液200 μL，37℃孵育4 h，倒置相差显微镜下观察。
1.4.7 支架材料内L02细胞活性检测优化培养1，3，5，7 d后，每孔加入5 g/L的MTT溶液200 μL，37 ℃孵育4 h；将孔内支架材料取出，5 000 r/min离心5 min，吸净支架材料内的培养液，收集底部的结晶沉淀；将培养液的支架材料和相应结晶沉淀置同一离心管内，每管加2.0 mL DMSO，反复振荡，37 ℃孵育10 min；每种材料吸取200 μL至96孔板，在酶标仪以490 nm波长测定A值。
1.4.8 支架材料内细胞乳酸脱氢酶漏出量检测优化培养1，3，5，7 d后，收集培养液上清，按试剂盒说明书参数在自动生化分析仪上检测乳酸脱氢酶含量。
1.4.9 支架材料内细胞白蛋白合成量检测优化培养1，3，5，7 d后，收集培养液上清，按人白蛋白ELISA检测试剂盒说明书检测培养上清中人白蛋白含量。
1.5 主要观察指标聚氨酯、壳聚糖、聚乳酸-聚羟乙酸酯支架材料上L02细胞的接种率、活性、细胞内乳酸脱氢酶漏出量与白蛋白合成量；聚氨酯内培养条件优化后L02细胞的活性、细胞内乳酸脱氢酶漏出量与白蛋白合成量。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prsim 8.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，予以正态性和方差齐性检验，多组间对比采用多因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。

讨论

3.1 三维支架材料的肝细胞相容性生物人工肝是肝组织工程的一个重要分支，用于人工肝支持系统生物反应器的三维支架材料应该基本满足组织工程对三维支架材料的要求[17-18]，如良好的生物相容性和细胞相容性、可降解性、无毒性。壳聚糖、聚乳酸-聚羟乙酸酯、聚氨酯被证实有较好的生物相容性[19-21]。此次实验选择支架材料的目的是为生物反应器内的肝细胞提供适宜的生长代谢微环境，故良好的肝细胞相容性是三维支架材料应用于生物反应器的关键。此次实验结果显示，3种支架材料内培养L02细胞的乳酸脱氢酶漏出量无差异，提示3种支架材料对肝细胞无明显的细胞膜损伤或细胞毒性，与L02细胞有较好的相容性。显微镜下观察可见，经FDA染色的聚氨酯和聚乳酸-聚羟乙酸酯内可见大量L02细胞贴壁生长，表明L02细胞能够在材料内较好地黏附生长；经MTT染色的壳聚糖内可见细胞互相聚集呈多细胞球形体生长，这可能是由于壳聚糖的亲水性较强，不能吸附血清或培养液中的大量蛋白质，影响受体介导的细胞黏附过程。其他研究也表明肝细胞在壳聚糖内培养呈多细胞聚集生长[21]。
材料的亲水性、表面电荷和结构不仅影响细胞的黏附，对在材料上培养细胞的活性高低和功能表达均有重要作用[22-23]。MTT是评估支架材料内细胞生长状况的有效方法，此次实验结果发现，L02细胞在聚乳酸-聚羟乙酸酯内的细胞活性较低，显著低于壳聚糖和聚氨酯，壳聚糖与聚氨酯内培养的细胞活性无差异，提示聚氨酯和壳聚糖更有利于L02细胞的培养生长。检测支架材料内L02细胞培养上清中白蛋白含量亦发现，聚乳酸-聚羟乙酸酯内L02细胞的白蛋白合成量低于壳聚糖和聚氨酯，说明聚氨酯和壳聚糖材料内的L02细胞具有更强的白蛋白合成能力。因此，聚氨酯和壳聚糖是3种支架材料中能较好地支持肝细胞黏附、生长和功能表达的材料。已有的文献报道认为聚乳酸-聚羟乙酸酯与肝细胞有较好的相容性[24]，与此次实验结果不一致，其原因可能是此次实验采用的聚乳酸-聚羟乙酸酯孔隙率较低和缺乏弹性，影响了细胞的活性和功能。
3.2 三维支架材料的特性良好的肝细胞相容性只是三维支架材料用于人工肝生物反应器制备的基础，在三维支架材料的物理特性上还需具有较强的可接种性及合理的孔性、韧性和三维立体性，以适应反应器内肝细胞大量高密度培养的要求。细胞在支架材料内的接种率与材料的亲疏水性、韧性或弹性、微孔孔径等密切相关[25]。此次实验结果显示，壳聚糖内的细胞接种率最高，这可能是由于壳聚糖为亲水性支架材料，细胞悬液能够迅速吸入支架材料内[26]；聚氨酯和聚乳酸-聚羟乙酸酯均为疏水性支架材料，细胞悬液不能自动吸入支架材料内[27]，但聚氨酯的细胞接种率高于聚乳酸-聚羟乙酸酯，其主要的原因是聚氨酯是弹性较强的支架材料，细胞接种时可反复挤压排空气体，而聚乳酸-聚羟乙酸酯为质地较硬缺乏弹性的材料，细胞悬液难以进入支架材料内。以上结果提示壳聚糖和聚氨酯的细胞可接种性较高。
无论是从材料的肝细胞相容性看还是材料的可接种性看，聚氨酯和壳聚糖均适用于生物反应器的制备。此次实验筛选三维支架材料的目的是与聚醚砜中空纤维联合制备生物反应器。中空纤维的制备方法与三维支架材料完全不同，同时两种材料均为有机物，难以采用同一种方法将两种材料制备在一起，只能分开制备两种材料，再将中空纤维穿插于支架材料内，这就要求选择的支架材料必须有较强的弹性而不易碎。有无液体条件下壳聚糖材料的体积变化较大，较长时间无液体浸泡可使壳聚糖材料失去支架材料的原有结构和塌陷变形，应用于生物反应器可能导致反应器内部结构的变形。因此，此次实验选择有良好肝细胞相容性、合适孔隙率、较强弹性等优点的聚氨酯进一步探讨用于生物人工肝反应器的可行性。
3.3 聚氨酯内培养条件的优化三维支架材料内培养细胞存在一个共同的问题：孔径小的支架材料有利于细胞的固定并进行组织化培养，但细胞难以分布均匀；孔径大的的支架材料细胞易接种均匀，但部分细胞不易固定在支架材料内[28]。生物反应器内支架材料体积更大，接种更困难，故此次实验选择较大孔径的聚氨酯进一步优化培养，提高肝细胞在支架材料内的黏附固定率。提高细胞在三维支架材料内黏附固定率的方法较多，常用的有胶原被覆、胶原凝胶、Matrigel凝胶、纤维蛋白凝胶、黏附肽嫁接等方法，其中胶原凝胶需要调节pH值，迅速混合接种难以在生物反应器内使用[29]；Matrigel凝胶来源于肿瘤细胞，同时价格昂贵，不适宜反应器内大规模使用；黏附肽嫁接处理过程复杂，尚难以广泛使用[30]。故此次实验选择胶原被覆和纤维蛋白凝胶作为聚氨酯材料细胞培养优化的研究方法。
此次实验形态观察实验发现，鼠尾胶原被覆能有效提高聚氨酯材料上黏附的细胞数，细胞贴壁生长，但仍有细胞从支架材料内漏出；纤维蛋白凝胶组细胞均匀分布在聚氨酯材料微孔内，呈球形体生长，细胞全部黏附在聚氨酯内，提示纤维蛋白凝胶可使支架材料内的细胞接种率更高、分布更均匀。细胞活性实验检测结果显示，纤维蛋白凝胶组培养后期的细胞活性高于聚氨酯对照组和鼠尾胶原被覆组，并持续升高，鼠尾胶原被覆组和聚氨酯对照组的细胞活性在3 d后未见升高，表明纤维蛋白凝胶的使用能有效提高聚氨酯内的L02细胞活性，这可能是由于纤维蛋白凝胶能将更多的细胞固定在聚氨酯内，同时细胞呈球形体生长，有助于细胞活性的稳定[31]。细胞乳酸脱氢酶漏出量能够反映细胞膜的稳定性。此次实验结果显示纤维蛋白凝胶组的细胞乳酸脱氢酶漏出量维持在低水平，且显著低于鼠尾胶原被覆组和聚氨酯对照组，说明纤维蛋白凝胶能提供一定的三维支持，可维持细胞膜的稳定[32]。细胞白蛋白合成量检测结果显示，纤维蛋白凝胶组培养后期的细胞白蛋白合成量高于聚氨酯对照组和鼠尾胶原被覆组，呈上升趋势，而后两组呈下降趋势，这是由于在鼠尾胶原被覆组和聚氨酯对照组的细胞为贴壁生长，而纤维蛋白凝胶组细胞呈球形体三维生长。大量研究报道认为，三维生长可以促进肝细胞白蛋白合成、生物转化等功能的稳定表达[33]。以上结果证实，纤维蛋白凝胶促使聚氨酯支架材料内的细胞均匀分布，提高肝细胞的活性和功能。纤维蛋白凝胶的形成可在细胞接种分布均匀后进行，从而不影响细胞在生物反应器内的接种，同时纤维蛋白原价格便宜，适宜于生物反应器内大量使用。因此，纤维蛋白凝胶可作为生物反应器内优化三维支架材料的有效方法。
综上所述，实验通过对比分析多种三维支架材料的物理特性和肝细胞相容性，发现聚氨酯支架具有更好的可接种性和肝细胞相容性，但其生物相容性还需植入实验动物体内验证。进一步利用纤维蛋白凝胶优化聚氨酯材料内的肝细胞培养条件，既解决了接种细胞分布不均匀的问题又能提供良好的肝细胞支持作用，有利于提高培养肝细胞功能。因此，实验成功将三维支架材料和中空纤维整合在一起，为构建新型杂交型生物人工肝反应器奠定了基础[16]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

用于生物人工肝反应器构建三维支架材料的选择与优化

Screening and optimization of three-dimensional scaffolds for the construction of bioartificial liver bioreactor

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