RNA干扰TRAP1表达抑制CD133+CD44+喉癌干细胞生长并促进凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2672-2677.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.008

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RNA干扰TRAP1表达抑制CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞生长并促进凋亡

薛海涛，苏静，陈帅，陈春菊，张继华，田君海，董凯峰

河北医科大学第一医院耳鼻咽喉科，河北省石家庄市 050031

修回日期:2017-05-08 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 苏静，硕士，主治医师，河北医科大学第一医院耳鼻咽喉科，河北省石家庄市 050031
作者简介:薛海涛，1965年生，河北省阜城县人，汉族，2002年河北医科大学毕业，副主任医师，主要从事鼻科学及咽喉科学研究。
基金资助:
河北省重点研发计划(152777179)，项目名称：TRAP1在人喉鳞癌中的表达及其与化疗抵抗的关系研究

RNA interference targeting inhibition of TRAP1 suppresses cell growth and promotes apoptosis in CD133+CD44+ laryngeal carcinoma stem cells

Xue Hai-tao, Su Jing, Chen Shuai, Chen Chun-ju, Zhang Ji-hua, Tian Jun-hai, Dong Kai-feng

Department of Otorhinolaryngology, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China

Revised:2017-05-08 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Su Jing, Master, Attending physician, Department of Otorhinolaryngology, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
About author:Xue Hai-tao, Associate chief physician, Department of Otorhinolaryngology, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
Supported by:
the Key Research and Development Project of Hebei Province, No. 152777179

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
RNA干扰技术：实验应用此技术降低CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞内TRAP1表达水平，并探讨TRAP1能否作为喉鳞癌治疗的一个特异靶点。研究结果显示RNA干扰靶向抑制CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞内TRAP1表达能够抑制细胞生长促进肿瘤细胞凋亡。同时也证明TRAP1表达下调促进细胞凋亡是通过提高细胞内caspase-3，caspase-8，caspase-9活性来完成的。靶向TRAP1信号通路或许是治疗喉鳞癌的一个潜在治疗靶点。
细胞凋亡：指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

摘要

背景：肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)是线粒体特异性热休克蛋白90家族的同源基因。大量研究表明其过量表达与多种癌症的发生密切相关。但其在喉鳞癌发生中的作用及作用机制目前还不清楚。

目的：探讨RNA干扰能否靶向抑制TRAP1过表达以及对人喉癌干细胞增殖和凋亡的作用效果。
方法：采用免疫磁珠技术从人喉癌Hep-2细胞系中分选出CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞。设计及合成TRAP1的shRNA序列，Lipofectamine^TM2000转染CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞。CCK-8增殖实验、集落形成实验、流式细胞术检测干扰TRAP1基因表达对CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞增殖和凋亡的影响，采用分光光度法检测细胞内caspase-3，caspase-8，caspase-9活性。

结果与结论：①TRAP1 shRNA转染的CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞内TRAP1基因和蛋白表达明显下调(P < 0.01)；②与空白对照组和转染空质粒阴性对照组比较，TRAP1表达下调抑制了CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞增殖和集落形成能力(P < 0.05)；③与空白对照组和转染空质粒阴性对照组比较，TRAP1表达下调增加CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞凋亡率(P < 0.05)；④TRAP1 shRNA介导细胞凋亡与caspase-3，caspase-8 和caspase-9激活有关；⑤结果提示RNA干扰TRAP1表达可抑制CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞生长并促进细胞凋亡。TRAP1可能为喉鳞癌治疗的基因靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-4039-3713(苏静)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 喉鳞癌, CD44, CD133, TRAP1, RNA干扰, 细胞凋亡, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Tumor necrosis factor-associated protein 1 (TRAP1) is a heat-shock protein 90-related mitochondrial chaperone. Accumulative evidence has demonstrated that TRAP1 overexpression is closely related to carcinogenesis. However, the exact function and mechanism of TRAP1 in the occurrence of laryngeal carcinoma remains unclear.

OBJECTIVE: To investigate whether RNA interference can inhibit TRAP1 overexpression and to explore its effects on growth and apoptosis of CD133⁺CD44⁺ laryngeal carcinoma stem cells.

METHODS: CD133⁺CD44⁺ laryngeal carcinoma stem cells were sorted from human laryngeal carcinoma Hep-2 cells using immunomagnetic beads. The shRNA sequence of TRAP1 was designed and synthesized and CD133⁺CD44⁺ laryngeal carcinoma stem cells were transfected with Lipofectamine^TM 2000. Cell counting kit-8 assay, colony formation assay and flow cytometry were used to investigate the effects of interference of TRAP1 expression on growth and apoptosis of CD133⁺CD44⁺ laryngeal carcinoma stem cells. Spectrophotometric method was used to detect the activity of caspase-3, -8 and -9.

RESULTS AND CONCLUSION: TRAP1 mRNA and protein expression levels were significantly decreased in TRAP1 shRNA-transfected CD133⁺CD44⁺ laryngeal carcinoma stem cells (P < 0.01). Compared with the blank control and negative control groups, the growth and colony formation of CD133⁺CD44⁺ laryngeal carcinoma stem cells were significantly inhibited in the TRAP1 shRNA-transfected group (P < 0.05). Apoptosis of CD133⁺CD44⁺ laryngeal carcinoma stem cells was significantly inhibited in the TRAP1 shRNA-transfected group as compared with the blank control and negative control groups (P < 0.05). TRAP1 shRNA-mediated cell apoptosis was associated with the activation of caspase-3, -8 and -9. These results suggest that RNA interference targeting inhibition of TRAP1 suppresses cell growth but promotes apoptosis in CD133⁺CD44⁺ aryngeal carcinoma stem cells. TRAP1 is likely to be a gene target for treatment of laryngeal carcinoma.

Key words: Neoplastic Stem Cells, Laryngeal Neoplasms, Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Peptides and Proteins, RNA Interference, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

薛海涛，苏静，陈帅，陈春菊，张继华，田君海，董凯峰. RNA干扰TRAP1表达抑制CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞生长并促进凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2672-2677.

Xue Hai-tao, Su Jing, Chen Shuai, Chen Chun-ju, Zhang Ji-hua, Tian Jun-hai, Dong Kai-feng. RNA interference targeting inhibition of TRAP1 suppresses cell growth and promotes apoptosis in CD133+CD44+ laryngeal carcinoma stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2672-2677.

图/表（结果） 2

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引言

头颈部鳞状细胞癌是全球第八大高发肿瘤，约占全身恶性肿瘤的5%^[1-2]。喉鳞癌是鳞癌最常见也是最主要类型。在中国，特别是北部地区，喉鳞癌发病率呈上升趋势。尽管综合疗法改善了局部控制情况和整体生活质量，但在过去20年中，喉鳞癌患者的生存率并没有显著提高^[3]。随着分子生物学的发展，使用生物标志物诊断喉鳞癌并探讨喉癌症发病分子机制将有助于改善疾病治疗水平并提高患者生存率。

肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1，TRAP1)是线粒体特异性热休克蛋白90家族的同源基因，与很多生物功能有关^[4-7]。研究表明在肿瘤细胞线粒体中，TRAP1过量表达。TRAP1过量表达与乳腺癌^[8]、前列腺癌^[9]、卵巢癌等多种癌症的发生密切相关^[10]，并且患者预后较差。Im等^[11]报道TRAP1过表达导致了一系列线粒体异常，包括活性氧族水平升高，线粒体生物合成降低，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α基因表达水平降低。他们认为TRAP1过表达是线粒体紊乱和癌症形成的一个关键环节。Chen等^[12]研究者认为TRAP1表达增加与结直肠癌组织炎症严重程度成正相关，但是TRAP1在喉鳞癌发生中的具体作用和相关分子机制目前还未见报道。近几年来，国内外越来越多的学者认同肿瘤干细胞理论，并对肿瘤干细胞进行大量的研究，进一步加深了人们对肿瘤发生与发展的认识。肿瘤干细胞是肿瘤细胞内部的一类特殊的群体，具有多向分化及自我更新能力，是肿瘤发生与发展、化疗耐药及复发的重要因素^[11-12]。实验旨在探讨RNA干扰能否靶向抑制TRAP1表达以及RNA干扰对人喉癌干细胞增殖和凋亡的作用效果。

材料方法

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2016年5月在河北医科大学第一医院实验室完成。

1.3 材料 人喉癌Hep-2细胞购于中国科学院生物化学和细胞生物学研究所。RPMI 1640培养基、lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen Life Technologies公司)；mRNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)；RT-PCR反转录试剂盒、荧光定量SYBR Premix Ex Taq 试剂盒(日本Takara Bio Inc公司)；ABI 7700实时荧光定量PCR系统(美国Applied Biosystems公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗兔和羊抗小鼠IgG 抗体、CCK-8试剂盒、caspase-3, -8，-9 活性检测试剂盒(中国上海碧云天生物技术研究所)；ELISA 酶标板(英国Sunrise RC公司)；PVDF膜(德国Roche Diagnostics公司)；兔抗TRAP1多克隆抗体(美国Thermo Fisher Scientific公司)；小鼠抗GAPDH单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)；Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(中国南京凯基生物科技发展有限公司)；结合缓冲液、BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人喉癌Hep-2细胞的培养和传代 将液氮冻存的人喉癌Hep-2细胞于37 ℃水浴中复苏，接种于含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，置于 37 ℃，相对湿度95%，体积分数5%CO₂的培养箱中培养，每隔2 d或3 d换1次液，待细胞生长至80%左右融合时用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA进行消化，离心(800 r/min，5 min)收集细胞，按1∶3比例进行传代培养。

1.4.2 免疫磁珠分选CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞 将人喉癌Hep-2细胞用PBS冲洗，胰酶消化，重悬于1 mL buffer中，然后加入兔抗人CD133抗体10 μL孵育15 min后离心弃上清，反复冲冼细胞后再次重悬于buffer中，加入羊抗兔免疫磁珠10 μL孵育15 min后离心弃上清，冲洗细胞2次后将MACS分离柱置于磁场中用buffer冲洗分离柱。1 mL buffer溶液重悬细胞后注入分离柱内，待悬液完全通过分离柱后用buffer冲洗分离柱，洗脱细胞为CD133^-细胞，去除磁场后，用2倍体积的buffer快速冲洗分离柱，洗脱细胞为CD133⁺细胞；用兔抗人CD44抗体，重复上述步骤后得到CD133⁺CD44⁺细胞和CD133^-CD44^-细胞，qRT-PCR检测TRAP1在这2种细胞中的表达水平。

1.4.3 细胞转染 选择对数生长期的CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基，于37 ℃，体积分数为5%CO₂的饱和湿度培育箱中培养。当细胞生长到60%-70%融合时，以1×10⁵/孔密度接种于6孔细胞培养板中并用短发夹RNA对照质粒和TRAP1 shRNA表达质粒进行转染。根据试剂盒说明，用脂质体lipofectamine 2000转染试剂将shRNA转染到CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞中。转染后24 h，采用qRT-PCR检测TRAP1基因敲低结果。细胞继续培养72 h后收集备用。

1.4.4 qRT-qPCR SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测TRAP1表达。用mRNA提取试剂盒提取CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞总RNA，用RT-PCR反转录试剂盒Oligo-dT引物进行反转录。用ABI 7500型实时荧光定量PCR系统SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行cNDA扩增。GAPDH作为参照基因。下列引物序列用于PCR扩增：GAPDH，正义链5’-ATC ATC AGC AAT GCC TCC-3’，反义链5’-CAT CAC GCC ACA GTT TCC-3’；TRAP1，正义链5’-CGC AGC ATC TTC TAC GTG C-3’，反义链5’-CTG ATG AGT GCG CTC TCC-3’。25 μL PCR反应体系包括0.5 μL cDNA，12.5 μL SYBR Premix Ex Taq和2 μL 引物。PCR反应条件为95 ℃行预变性1 min；95 ℃变性5 s、60 ℃退火20 s，累计45次循环；72 ℃延伸8 min。荧光定量检测，采用2^-^??Ct方法分析TRAP1在细胞中的相对表达水平。所有PCR反应实验重复进行3次。

1.4.5 Western blot分析 收集培养CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞，PBS洗涤3次，加入细胞裂解液裂解细胞，冰浴30 min，10 000 r/min离心6 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg总蛋白进行15%SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白，电转法将胶上的蛋白质转至PVDF膜上，TBST洗涤，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入兔抗TRAP1多克隆抗体(1︰1 000)4 ℃孵育过夜，小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1︰1 000)作为上样对照，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔和羊抗小鼠IgG抗体(1︰2 000)作为二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，蛋白条带用Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus 荧光试剂成像。每个实验重复3次。

1.4.6 CCK-8 增殖实验 细胞转染后12 h至5 d，CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞接种于96孔细胞培养板，每孔2×10³细胞。按照试剂盒说明，用CCK-8方法检测细胞增殖。每孔加入10 μL CCK-8溶液后，于37 ℃孵育细胞2 h，酶标仪检测490 nm处的吸光度值。每个实验重复3次。

1.4.7 集落形成实验 用胰蛋白酶消化转染CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞，制成单细胞悬液。将细胞接种到6孔培养板，每孔1 000个。培养板底层为0.6%低熔点琼脂糖，上层为含体积分数为10%胎牛血清和0.3%低熔点琼脂糖的RPMI 1640培养基。37 ℃培养箱中培养14 d，倒置显微镜下观察细胞集落形成情况，计数直径> 50 μm的集落数，拍照并计算集落形成率(集落形成率=集落形成数/接种细胞数×100%)。所有实验重复3次。

1.4.8 流式细胞术实验 用Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况，收集转染CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，加入Annexin V-PE 和7-AAD染料，用漩涡器振荡并在室温避光条件下孵育15 min后，加入400 μL结合缓冲液，上BD FACSCalibur流式细胞仪检测。每个实验重复3次。

1.4.9 细胞caspase-3，caspase-8，caspase -9活性检测 用caspase-3，-8，-9活性检测试剂盒检测细胞内Caspase-3，-8，-9活性。转染CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞于含有10 mL caspase-3，caspase-8或caspase-9底物的100 mL反应缓冲液中进行匀浆，裂解物37 ℃孵育2 h。酶标仪检测405 nm处的吸光度值。每个实验重复3次。

1.5 主要观察指标 ①RNA干扰后TRAP1在CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞内的表达；②RNA干扰后CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞的增殖能力和细胞凋亡情况；③RNA干扰后CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞caspase-3，-8，-9活性。

1.6 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。数据用x(_)±s表示，组间连续变量比较用独立样本t 检验。P < 0.05差异有显著性意义。

讨论

热休克蛋白90家族成员TRAP1是许多癌症的“驱动器”，在食道、肺、脑和乳腺等部位的实体瘤中过表达^[13-15]，参与细胞周期进展，细胞代谢和某些蛋白的质量监控^[16-17]。TRAP1也是癌症治疗的靶点^[18-21]。然而，TRAP1表达在喉鳞癌发生中的作用目前仍不清楚。实验应用RNA干扰技术降低CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞内TRAP1表达水平，探讨TRAP1能否作为喉鳞癌治疗的一个特异靶点。结果显示，RT-qPCR和免疫印迹实验证实RNA干扰技术显著抑制了TRAP1表达。

TRAP1参与细胞生长和凋亡^[22]。Guzzo等^[22]建立营养缺乏条件模拟实际恶性肿瘤环境验证TRAP1抑制丁二酸脱氢酶活性，促进肿瘤生长。Im^[23]研究表明TRAP1参与癌细胞增殖、凋亡以及“干性”特征。CCK-8实验结果显示TRAP1 shRNA 技术抑制了CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞生长。通过体外软琼脂集落形成实验表明，TRAP1 shRNA 技术抑制了CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞集落形成率。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有集落形成能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。

shRNA转染3 d后行流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果显示shRNA技术介导的TRAP1敲低导致CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞凋亡。凋亡是多细胞生物体内由基因严格控制的自主有序的一种细胞死亡方式。这个过程是通过激活蛋白水解酶来完成的。阐述凋亡过程涉及的基因类型有助于研究凋亡机制。Caspase-8介导死亡受体转导通路的细胞凋亡，caspase-9参与线粒体转导通路的细胞凋亡^[24]。活化的casepase-8和caspase-9就会激活下游的caspase-3。Caspase-3是关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能^[25]。然而，caspase-8不总是在Fas信号通路早期被激活，在某些细胞中，活化的caspase-3也会激活caspase-6，后者是下游caspase-8激活的必要因素^[26]。与空白对照细胞和阴性对照细胞相比，caspase-3，-8，-9活性在TRAP1 shRNA组细胞中明显增加。表明TRAP1 shRNA技术转染后，至少存在线粒体转导通路的细胞死亡。

事实上，威斯塔研究所 Dario C. Altieri医学博士团队首先发现作为细胞保护网络成员之一TRAP1在肿瘤细胞线粒体中是被选择性激活的^[27]。后来有研究者发现TRAP1过表达增加肿瘤发生和转移过程中肿瘤细胞增殖，入侵和血管形成。近期研究发现TRAP1是胶质瘤、前列腺癌、膀胱癌等癌症进展和预后的重要靶点^[28-30]。作者的研究结果与以往研究结果一致。

Tian等^[31]采用生物发光法发现TRAP1表达敲低显著抑制了皮下移植食管癌细胞株的生长。日本Takamura等^[32]研究发现稳定下调TRAP1表达的细胞线粒体形态异常，同时线粒体分裂蛋白Drp1和Mff表达也下调。表明TRAP1调整线粒体内分裂蛋白表达水平，控制线粒体融合和分裂。所有这些研究发现说明了TRAP1异常表达与癌症进展密切相关。

综上所述，研究结果显示RNA干扰靶向抑制CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞内TRAP1表达能够抑制细胞生长促进肿瘤细胞凋亡。同时也证明TRAP1表达下调促进细胞凋亡是通过提高细胞内caspase-3, -8, -9活性来完成的。CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞凋亡是通过线粒体转导通路介导还是死亡受体转导通路介导以及哪些因子参与此过程需进一步研究探讨。研究结果表明TRAP1在CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞增殖和凋亡过程中起重要作用。靶向TRAP1信号通路或许是治疗喉鳞癌的一个潜在治疗靶点。研究结果将为建立体内体外模型系统阐述相关机制并开发喉鳞癌细胞内TRAP1特异抑制剂提供理论证据。

RNA干扰TRAP1表达抑制CD133⁺CD44⁺喉癌干细胞生长并促进凋亡

RNA interference targeting inhibition of TRAP1 suppresses cell growth and promotes apoptosis in CD133+CD44+ laryngeal carcinoma stem cells

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