肺癌组织中干细胞转录因子Sox2和Oct4表达与微血管密度的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.024

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2114-2119.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.024

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肺癌组织中干细胞转录因子Sox2和Oct4表达与微血管密度的相关性

项保利，钱海红，张志林，苏菁，陈丽萍，张志华

河北北方学院附属第一医院呼吸内科，河北省张家口市 075000

修回日期:2017-03-12 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 张志华，主任医师，博士，硕士生导师，河北北方学院附属第一医院呼吸内科，河北省张家口市 075000
作者简介:项保利，男，1979年生，河北省保定市人，汉族，2004年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事呼吸内科疾病诊治与基础研究。
基金资助:
河北省卫生和计划生育委员会基金资助项目(20160369)

Expression of Sox2 and Oct4 in relation to microvessel density in lung cancer tissues

Xiang Bao-li, Qian Hai-hong, Zhang Zhi-lin, Su Jing, Chen Li-ping, Zhang Zhi-hua

Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China

Revised:2017-03-12 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Zhang Zhi-hua, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
About author:Xiang Bao-li, Master, Attending physician, Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
Supported by:
the Funded Project of Hebei Province Health and Family Planning Commission, No. 20160369

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肿瘤干细胞：肿瘤组织内有一小群与干细胞类似生物学特性的细胞被认为是肿瘤发生、扩散、复发过程中的根源。肿瘤干细胞膜上表达的ABC转运蛋白以及肿瘤干细胞生长的微环境都使其对化疗和放疗相对不敏感，并且肿瘤干细胞具有多条自我更新的信号通路。
Sox2和Oct4：具有代表性的干细胞转录因子，在干细胞的生长发育过程中起着关键的调控作用。Sox2是Sox家族中重要成员之一，其编码的基因具有HMG特征性结构域，通过与靶基因G结构域特异性结合，调控人体器官发育和细胞分化，Sox2也是一些肿瘤发育的关键因子；Oct4是转录因子POU 家族中具有代表性的胚胎干细胞转录因子，该转录因子在胚胎干细胞、成人组织的祖细胞、胚胎生殖细胞、原发肿瘤、胚胎和生殖肿瘤细胞中表达。

摘要
背景：研究已证实干细胞转录因子Sox2和Oct4的高表达与肺癌的发生密切相关。
目的：探讨肺癌组织中Sox2和Oct4表达与肿瘤微血管生成、临床病理指标的相关性。
方法：应用免疫组织化学染色法检测60例肺癌组织和60例正常组织中Sox2和Oct4的表达，以及CD34标记的微血管密度。分析Sox2，Oct4的表达和微血管密度值与临床病理参数关系。
结果与结论：①Sox2和Oct4在肺癌组织中阳性表达率为46.67%(28/60)、71.67%(43/60)，而在正常肺组织中表达均为阴性，差异有显著性意义(P < 0.001)；②肺癌组织中微血管密度值为16.22±2.18，明显高于正常组织4.36±2.07，差异有显著性意义(P< 0.001)；③Sox2、Oct4和微血管密度均与肿瘤TNM分期、分化程度、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移相关(P均< 0.05)，而与年龄、性别无关(P均> 0.05)；④肺癌组织Sox2和Oct4阳性表达组微血管密度值显著高于阴性组(P < 0.001)；⑤Spearmen相关分析显示：肺癌组织中Sox2与Oct4无明显相关性(r=2.752，P > 0.05)；⑥结果表明，Sox2和Oct4表达上调可作为肺癌发生的早期预警事件，并与微血管密度呈正相关，二者可能共同参与了肿瘤微血管的生成、浸润及血行转移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5883-6597(项保利)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 干细胞转录因子, Sox2, Oct4, 肺癌, 微血管密度, 相关性

Abstract:

BACKGROUND: High expression of stem cell transcription factors, Sox2 and Oct4, has been confirmed to be closely related to the occurrence of lung cancer.
OBJECTIVE: To explore the expression of Sox2 and Oct4 in lung cancer tissues and its correlation with microvascular generation and clinical-pathologic features.
METHODS: The expression levels of Sox2 and Oct4 and microvessel density (MVD) in lung cancer tissues (60 cases) and normal tissues (60 cases) were examined by immunohislochemistry. Then, the correlation of the expression of Sox2 and Oct4 and MVD value with clinical-pathologic features in lung cancer was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive expression of Sox2 and Oct4 was 46.67% (28/60) and 71.67% (43/60) in lung cancer tissues, respectively, while Sox2 and Oct4 were negatively expressed in normal tissues, and there was a significant difference between lung cancer and normal tissues (P < 0.001). The MVD value was 16.22±2.18 in lung cancer tissues, which was significantly higher than that in normal tissues (4.36±2.07) (P < 0.001). Expression of Sox2, Oct4 and MVD value were correlated with TNM stage, differentiation degree, ymph node metastasis, vessel invasion, and liver metastasis (all P < 0.05), but not with the patient’s age and gender (both P > 0.05). The MVD value with Sox2 and Oct4 positive expression was significantly higher than that with Sox2 and Oct4 negative expression (P< 0.001). Spearmen analysis results showed that there was no correlation between Sox2 and Oct4 in lung cancer tissues (r=2.752,P > 0.05). To conclude, the high expression of Sox2 and Oct4 has a high correlation with the initiation and progression of lung cancer, and has positive correlation with the MVD, both of which are significantly concerned with the microvascular generation, invasion and hematogenous metastasis of lung cancer.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lung Neoplasms, SOXB1 Transcription Factors, Octamer Transcription Factors, Microvessels, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

项保利，钱海红，张志林，苏菁，陈丽萍，张志华. 肺癌组织中干细胞转录因子Sox2和Oct4表达与微血管密度的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2114-2119.

Xiang Bao-li, Qian Hai-hong, Zhang Zhi-lin, Su Jing, Chen Li-ping, Zhang Zhi-hua. Expression of Sox2 and Oct4 in relation to microvessel density in lung cancer tissues[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2114-2119.

图/表（结果） 2

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引言

最新流行病学研究显示：未来5年中国肺癌新发病率呈逐年上升趋势，且发病年龄明显年轻化，严重危害国民健康，手术联合放化疗、免疫治疗等针对性的治疗方法并不理想，肺癌患者术后5年生存率仍在13%-15%^[1-2]。寻找特异性高的生物学指标对肺癌早期诊断、术后防治及应用相应的分子靶向治疗有重要的价值^[3-4]。近年研究证明多种恶性肿瘤均由一种具有自我更新能力的细胞诱导产生，这种细胞被称为“肿瘤干细胞”。这给恶性肿瘤的治疗指明了新的方向，期望以肿瘤干细胞为靶点对肿瘤实施靶向治疗^[5]。肿瘤干细胞理论认为，发生肿瘤的根源就是机体组织中形成了肿瘤干细胞^[6-8]，而肿瘤干细胞的来源有3个途径：①正常组织中原有的干细胞于外界或自身因素突变而产生：②组织中含有的祖细胞发生基因重排，重新获得与干细胞类似的表型和特性，形成肿瘤干细胞；③骨髓来源的干细胞发生突变产生。

Sox2(sex determining Y-box 2)、Oct4(octamer binding factor-4)是具有代表性的干细胞转录因子，在干细胞的生长、发育过程中发挥重要的调控作用。早期对小鼠胚胎发育的研究发现，Sox2参与了早期胚胎的发生，除此之外，Sox2在促进肺支气管基底细胞分化、维持食管发育等过程中也发挥着重要的作用。Sox2表达异常能导致各类黏膜上皮的分化失去稳态，促进肿瘤发生^[9-11]；Oct4是最重要的维持人类胚胎干细胞自我更新的基因之一，对细胞正常分化起决定性作用^[12]。目前可以确定的是Oct4主要表达于胚胎干细胞和原始生殖细胞，细胞分化后Oct4表达降低或消失。Oct4是胚胎干细胞的特异性基因，在肺癌细胞及组织中的表达鲜有报道^[13-15]。CD34特异性表达于血管内皮细胞和一些造血祖细胞，在淋巴管细胞中无表达，因而CD34能准确监测癌组织内的微血管密度，反映血管新生状况。本研究对Sox2、Oct4和微血管密度行免疫组织化学染色分析，了解3者之间及其与肺癌临床相关病理的相关性，为探索肺癌发生、血性转移的机制及抗血管浸润治疗提供科学依据。

材料方法

1.1 设计 观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年1至6月在河北北方学院附属第一医院病理实验室完成。

1.3 材料 选取原发性肺癌组织60例，取自癌灶中心处，术前未行新辅助放化疗等针对性治疗，其中男32例，女28例，年龄34-70岁，平均(52.0±7.9)岁。另取60例癌旁正常肺组织作为对照，男35例，女25例，年龄33-71岁，平均(51.6±7.4)岁。实验经河北北方学院附属第一医院伦理委员会批准。

试剂：兔抗人单克隆浓缩型Sox2抗体、兔抗人浓缩型Oct4单克隆抗体均购于香港Abcam公司；CD34抗体购于美国Abnova公司；DAB显色试剂(美国Fementas公司)。

1.4 方法

1.4.1 免疫组织化学染色方法 体积分数为10%甲醛溶液固定组织标本，并用石蜡包埋，切片厚度为4 µm。使用苏木精-伊红染色方法，病理诊断。切片经过80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脱水，灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液高温高压水化修复；PBS洗3次，加一抗(Sox2：1︰150，Oct4：1︰150)，4 ℃过夜；PBS洗3次，加二抗。室温下使用DAB显色试剂显色，根据显微镜下观察的显色情况控制显色时间，苏木精轻度复染，并用1%的盐酸乙醇分化5 min、流水冲5 min、梯度乙醇脱水(体积分数分别为80%、85%、90%、95%、100%、100%)及松节油透明5 min，最后树胶封固。阴性对照为PBS代替一抗。

1.4.2 Sox2、Oct4阳性判定标准 Sox2和Oct4均以细胞核中出现棕黄色、褐色颗粒为阳性表达，根据着色细胞占视野细胞总数的百分比及着色细胞染色强弱评分。≤5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，> 75%为4分；阴性：0分；弱(+)：1分；中(++)：2分；强(+++)：3分。两者相乘，0分为(-)，1-4分为(+)，5-8分为(++)，9-12分为(+++)，(+)-(+++)均视为阳性。

1.4.3 微血管密度检测 参照Weidner法^[16-17]进行微血管计数，选取肺癌及相应正常组织，应用CD34抗体标记染色于肿瘤微血管内皮细胞的胞质和细胞核，以孤立的棕黄色内皮细胞或内皮细胞簇团作为一个微血管并计数；先在40倍光镜下选出4个脉管最密集的区域(即密集热点区)，然后换400倍光镜下将着色的单个及集簇的内皮细胞记为观察区，计数，取其平均值即为微血管密度值。

1.5 主要观察指标 Sox2和Oct4在肺癌组织中的阳性表达及以CD34标记的肿瘤微血管密度值。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析数据，用百分率表示计数资料，运用χ²检验表示Sox2和Oct4的表达与临床病理参数关系，用x(_)±s表示计量资料，两组独立样本运用t 检验表示微血管密度值与临床病理参数的关系，两组以上独立样本运用方差分析表示微血管密度值与临床病理参数的关系，多因素采用Logistic回归分析，相关性分析采用Spearmen检验，设α=0.05为检验水准。

讨论

近年来，肿瘤干细胞成为肿瘤领域研究的热点，其基础理论为肿瘤起源于肿瘤细胞的一类亚群，这类亚群可以长时间保持休眠状态，具有逃避免疫监视、化疗药物和浸润转移的能力^[18]。肿瘤干细胞具有较强迁徙以及运动能力，可促进细胞转移，引发肿瘤浸润和转移等，此外，还可长期维持正常机体的相对稳定的休眠状态，

有极强的耐药性^[19-20]。肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展及复发的源泉，肿瘤生长以及分化最终取决于其组织中肿瘤干细胞表达，同时肿瘤本身具有转移潜力，当机体肿瘤干细胞表达达到一定程度时，肿瘤的转移将不可避免^[21]。

Lapidot等^[22]首次证实CD34⁺、CD38^-细胞是人类急性粒细胞白血病干细胞，2003年Al-Hajj等^[23]分离出CD44⁺、CD24^-^/low乳腺癌干细胞，首次证实实体肿瘤中存在肿瘤干细胞。大量研究表明：该亚群导致了诸多实体癌症的发生，如卵巢癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、成纤维细胞瘤等^[24-28]。Kim等^[29]报道支气管肺泡干细胞具有自我更新、多潜能以及增殖的属性，并且认为其可以作为肺癌的早期事件。Wang等^[30]在乳腺癌中分离出CD105⁺/CD90⁺细胞具有干细胞特性，Zhao等^[31]利用无血清悬浮成球培养法从人肝癌组织中培养出成球细胞中侧群细胞，证实侧群细胞成瘤率较非侧群细胞高，同时检测到CD133及CD90的表达，证明肝癌组织中可能表达干细胞特性。

Sox2是Sox家族中重要成员之一，是一种干细胞转录因子，其编码的基因具有HMG特征性结构域，通过与靶基因G结构域特异性结合，在调控人体器官发育和细胞分化，尤其是胚芽干细胞发育过程中发挥重要作用^[32]；Sox2同样是一些肿瘤发育的关键因子，研究发现，人体多种实体肿瘤如食管癌、肺癌、胃癌等的发生、发展均与其表达上调有关^[33-35]。2004年Vural等^[36]在小细胞肺癌患者血清中检测到Sox2呈阳性表达，2011年Lergerke等^[37]发现Sox2在浸润性乳腺癌中呈高表达，且通过体外细胞培养和体内实验分析结果显示Sox2通过抑制细胞凋亡，促进乳腺癌细胞的无限增殖，从而诱导肿瘤细胞生成。顾晓荔^[38]应用免疫组化法检测Sox2在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织，且Sox2与肿瘤TNM分期、分化程度呈明显正相关性。张燕平等^[39]采用免疫组化方法检测71例经手术切除胃癌患者的肿瘤组织中SOX-2蛋白表达情况，发现SOX-2在胃癌中的表达与胃癌复发转移、淋巴结浸润及分化程度有关，生存分析显示SOX-2的表达与患者无病生存时间相关。

Oct4是干细胞多能性调节基因，又名八聚体结合转录因子，属于POU转录因子家族，首次在胚胎干细胞和生殖细胞中发现。Oct4作为公认的胚胎干细胞标志物在卵母细胞、胚囊的内细胞团、早期分裂期胚胎、卵圆柱期胚胎的原始生殖细胞及原始外胚层中均有表达，且随着细胞的不断分化，其表达水平会逐渐下调，表明其能够保持细胞发育中的多能性^[40-41]。众多研究表明，Oct4对维持胚胎干细胞自我更新和多能性有着关键性作用^[42-43]。近来，在越来越多的癌细胞发现了Oct4的大量表达，甚至Monk等^[44]还发现了该基因仅存在于肿瘤中，而不存在于正常体细胞中，此外，该研究表明Oct4可能在癌症发展中起着决定性影响。郝美玲等^[45]应用qRT-PCR、Western blotting技术检测胃癌组织中Oct4mRNA和蛋白表达，显示胃癌组织Oct4高表达可促进胃癌的发生、发展，其机制可能与Oct4参与调节TGF-β信号通路、诱导细胞发生上皮间质转化有关；张超等^[46]应用PCR和免疫组织化学法检测40例浸润性乳腺癌组织标本中Oct4的表达，显示Oct4与浸润性乳腺癌患者的年龄、组织学分级、淋巴结转移以及Her-2的表达有关，Oct4可能通过EMT促进浸润性乳腺癌细胞的转移，是影响浸润性乳腺癌预后的因素。董翠梅等^[47]研究显示非小细胞肺癌组织中Oct4蛋白的表达与组织分化程度、淋巴结转移和临床分期相关。

实验显示Sox2和Oct4在肺癌组织中阳性表达为46.67%和71.67%，而在正常组织均为阴性，表明Sox2和Oct4可能是肺癌的新型潜在标志物，其表达上调可作为肺癌发生的早期预警事件；且二者与肿瘤分化程度、TNM分期、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移密切相关，与Li等^[48]研究结果一致，支持Sox2和Oct4促进肿瘤恶性生物学进程的理论。微血管密度是评价肿瘤血管生成重要指标，能够准确反映肿瘤血管生成状况，实验结果显示肺癌组织中微血管密度值明显高于正常组织，但在不同分化类型的组织中却无明显差异，同时在Sox2和Oct4不同表达的肺癌组织中微血管密度值差异有显著性意义，与Sodja等^[49]研究结果基本一致。

尽管Sox2和Oct4在一些肿瘤研究中的表现相互独立，但是它们多次被检测位于同一个区域内，并且还发现了它们在肺癌中可能有联系，比如Sox2-Oct4复合体。这表明它们是一些靶基因的共同激活因子，也共同形成了核心转录调节系统。一些研究发现，Sox2-Oct4复合体是TGF-β和Wnt/β-连环蛋白路径的必要因素，而TGF-β和Wnt/β-连环蛋白也是肿瘤干细胞自我更新和维持的其他重要组成部分^[50-51]。但研究结果显示Sox2和Oct4在肺癌中的表达无明显相关性，考虑与纳入的样本量相对较少有关，或者应该对其中具体的某种病理类型如鳞癌、腺癌或小细胞癌做具体的研究。

值得肯定的是，Sox2和Oct4的异常表达参与肺癌的发生、演进，与肿瘤微血管的生成及血行浸润等恶性生物学行为密切相关，联合检测二者的表达在肺癌早期诊断、预后监测中具有重要的意义^[52-53]；此外，Sox2和Oct4作为重要的转录因子，维持着胚胎干细胞分化和多能性，因而在癌细胞研究中一旦发现其具有干性，可能导致癌细胞永生、自我再生以及浸润特性，若该假设成立，研制抑制Sox2和Oct4的靶向药物将有望成为治疗肺癌的重要基因手段。

肺癌组织中干细胞转录因子Sox2和Oct4表达与微血管密度的相关性

Expression of Sox2 and Oct4 in relation to microvessel density in lung cancer tissues

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