人骨骼肌来源不同表面标志物间充质干细胞特定亚群的多向分化潜能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.023

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2108-2113.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.023

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人骨骼肌来源不同表面标志物间充质干细胞特定亚群的多向分化潜能

赵亚光，李毅，宋卓悦，李广恒

郑州大学第一附属医院骨科，河南省郑州市 450000

修回日期:2017-03-13 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 李广恒，博士，教授，博士生导师。郑州大学第一附属医院骨科，河南省郑州市 450000
作者简介:赵亚光，男，1990年生，河南省开封市人，汉族，郑州大学在读硕士，主要从事关节外科基础及临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81472136)

Multi-directional differentiation potential of subpopulations of mesenchymal stem cells isolated from human skeletal muscle expressing different myogenic and endothelial markers

Zhao Ya-guang, Li Yi, Song Zhuo-yue, Li Guang-heng

Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Revised:2017-03-13 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Li Guang-heng, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Zhao Ya-guang, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81472136

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人骨骼肌干细胞：具有一般干细胞的特点，可以自我更新、繁殖产生更多的干细胞，同时也可以分化成各种各样的具有特定功能的细胞，可作为多种组织工程的种子细胞，有非常重要的研究和应用价值。
3D细胞培养：利用磁性微球载体和磁悬浮技术使贴有细胞的微球载体悬浮在培养液中，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统有盖培养皿、培养瓶或微孔板细胞培养耗时繁琐，细胞产量微小等局限性。

摘要
背景：骼肌来源的间充质干细胞，在骨形态发生蛋白4等因子的调节下具有多向分化潜能，但具体细胞亚群的分化情况尚不十分明确。
目的：观察人骨骼肌来源的不同表面标志物的间充质干细胞特定亚群的多向分化潜能。
方法：应用流式细胞分选技术，分选出具有不同细胞表面标志物的人骨骼肌干细胞亚群，根据CD56及CD34/CD144的表达差异，将细胞分成CD56⁺，CD56⁺CD34⁺CD144⁺，CD34⁺CD144⁺及未分选组共4组，对比不同细胞亚群组在骨形态发生蛋白4成骨诱导或骨形态发生蛋白4+转化生长因子β3成软骨诱导后的差异。通过碱性磷酸酶染色后碱性磷酸酶阳性细胞的百分比评估细胞骨代谢情况。将各亚群细胞进行3D培养和细胞因子处理后，通过硝酸银染色评估其成骨分化程度，通过阿尔新蓝染色评价成软骨分化程度。
结果与结论：①细胞骨代谢：经骨形态发生蛋白4处理后，4组细胞的碱性磷酸酶阳性细胞的百分比差异无显著性意义(P > 0.05)；②细胞分化：不同表面标记物的4组细胞成骨及成软骨分化有明显差异，在相同成骨培养条件下，CD56⁺组成骨能力最强；相同成软骨培养条件下，CD56⁺，CD56⁺CD34⁺CD144⁺组呈阿尔新蓝染色阳性，CD56⁺CD34⁺CD144⁺组的染色更深且区域更大；③结果证实，成骨与成软骨潜能与不同的人骨骼肌间充质干细胞类型有关。人骨骼肌来源的间充质干细胞CD56⁺亚群和成骨潜能有密切关系。同时CD56⁺CD34⁺CD144⁺亚群分化能力更强，具有更强的成软骨潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2245-1588(赵亚光)

关键词: 干细胞, 分化, 骨骼肌, 骨缺损, 软骨缺损, 间充质干细胞, 标记物, 骨形态发生蛋白4, 成骨分化, 成软骨分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells from human skeletal muscle exhibit multi-directional differentiation potential under the influence of osteogenic proteins such as bone morphogenetic protein 4 (BMP4). But the differentiation of a specific cell subpopulation is not yet clear.
OBJECTIVE: To characterize the multi-directional differentiation potential of mesenchymal stem cells from human skeletal muscle based on the expression of different surface markers.
METHODS: Four different subpopulations were isolated from the human skeletal muscle by fluorescence-activated cell sorting based on their expression of the myogenic-specific marker CD56 and the endothelial-specific markers CD34 and CD144, including CD56⁺, CD56⁺CD34⁺CD144⁺, CD34⁺CD144⁺, and unsorted groups. Osteogenic differentiation of the four groups of the cells was displayed by Von Kossa staining after the treatment with BMP4 alone or BMP4 plus transforming growth factor β3. Chondrogenic differentiation of these cells was displayed by Alcian blue staining. Bone metabolism was assessed by alkaline phosphatase staining.
RESULTS AND CONCLUSION: No significant difference in the bone metabolism was found among four groups after the treatment with BMP4 (P > 0.05). Osteogenic and chondrogenic potentials of the four cell subpopulations were significantly different. Under the same osteogenic induction, the CD56⁺ cells exhibited strongest potential for osteogenic differentiation; and under the same chondrogenic induction, the CD56⁺CD34⁺CD144⁺cells exhibited better potential for chondrogenic differentiation than the CD56⁺ cells. These findings indicate that the osteogenic and chondrogenic potentials are intimately associated with the type of mesenchymal stem cells from human skeletal muscle: the CD56⁺ cells are closely related to the osteogenic potential, while the CD56⁺CD34⁺CD144⁺ cells have stronger chondrogenic potential.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

赵亚光，李毅，宋卓悦，李广恒. 人骨骼肌来源不同表面标志物间充质干细胞特定亚群的多向分化潜能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2108-2113.

Zhao Ya-guang, Li Yi, Song Zhuo-yue, Li Guang-heng. Multi-directional differentiation potential of subpopulations of mesenchymal stem cells isolated from human skeletal muscle expressing different myogenic and endothelial markers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2108-2113.

图/表（结果） 1

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引言

骨性关节炎及骨缺损等疾病的发病率不断增高，尤其是当疾病进展到终末期，目前尚缺乏十分理想的治疗方法^[1-2]。人们发现骨骼肌来源的间充质干细胞，在骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)等因子的调节下，具有多向分化潜能，有望应用于晚期骨及软骨疾病的治疗^[3-4]，但目前缺乏优质的种子细胞来源^[5]，相关研究仍存在较大的局限性。

骨性关节炎是骨科的常见病和多发病，特别是大于60岁的老年人，据统计有90%以上有不同程度的关节软骨退行性病变^[6]。目前关节软骨损伤的修复方法，主要包括损伤部位应用富血小板血浆和透明质酸、骨软骨镶嵌成形术、微骨折技术及自体软骨细胞移植等^[7]，但是长期的结果并不令人不满意。目前研究热门的课题是关节腔内注射间充质干细胞^[8]，其可能原因是间充质干细胞可以作为生物活性因子启动再生活动完成软骨缺陷的修复^[9]。目前利用组织工程技术促进骨和软骨组织再生的研究发展迅速，研究发现多种组织来源的间充质干细胞可以作为骨和软骨再生组织工程的种子细胞^[10-11]。其中骨骼肌来源的间充质干细胞不仅取材容易，同时具有较高的多方向分化潜能。既往实验研究发现，在BMP2或BMP4的影响下，小鼠肌源性干细胞能够分化为成骨细胞系。但是肌源性干细胞多向分化潜能里哪些亚群向成骨分化，哪些亚群向成软骨分化，目前的研究还处于探索阶段^[12]。

实验首次阐明了不同亚群的人骨骼肌来源的间充质干细胞在BMP4等一些细胞因子的作用下的成骨或成软骨潜能，并探讨其多向分化潜能与肌细胞表面标志物的关系特点，为治疗骨缺损及软骨缺损提供了不可或缺的新的种子细胞。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2015年9月至2016年9月在郑州大学第一附属医院重点实验室基因与细胞治疗中心完成。

1.3 材料 骨骼肌来源于郑州大学第一附属医院骨科膝关节表面置换手术患者。患者及家属均知情同意，实验通过郑州大学伦理委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 细胞分离及原代培养 取新鲜骨骼肌组织，组织洗液反复洗涤5次，超净台里将组织置于冰盒上的培养皿中，无菌眼科剪除去非骨骼肌组织，手术刀反复切割至糊状。放入含有3 mL体积分数0.2%胶原酶的15 mL离心管中，孵育1 h，然后加入体积分数0.1%胰蛋白酶继续孵育30 min。100目滤网中过滤后将滤液置于50 mL离心管中900 r/min，离心5 min，弃上清后加入体积分数10%FBS的DMEM中，重悬后加入6孔板中，每孔2 mL。37 ℃细胞培养箱中培养并观察，取第2代细胞作为实验细胞。

1.4.2 流式细胞分选技术(FACS) 根据肌源性标记物CD56和内皮性标记物CD34CD144的表达，从而获得3种不同的骨骼肌来源的间充质干细胞亚群：分别是肌源性细胞CD56⁺CD34^-CD144^-，内皮性细胞CD56^-CD34⁺CD144⁺，肌源-内皮性细胞CD56⁺CD34⁺CD144⁺。未分类的细胞群作为对照组，因此本次实验共分4组，分别为：肌源性细胞CD56⁺亚群、内皮性细胞CD34⁺CD144⁺亚群、肌源-内皮细胞CD56⁺CD34⁺CD144⁺亚群及未分类群。

具体步骤：取第2代培养的骨骼肌细胞，弃掉培养基，用PBS冲洗3遍，然后用胰蛋白酶消化，离心后用冷PBS(含体积分数0.5%BSA)重悬并计数。细胞在相同的条件下分4组并用含鼠血清的PBS (1∶10；Sigma-Aldrich)封闭，细胞悬液在冰上孵育10 min，将CD56⁺的单克隆抗体加入细胞悬液中30 min，加入荧光燃料标记的二抗，立即用7-氨基放线菌素D加入每个离心管中，将死细胞分选出来，然后将活细胞收集起来用流式细胞仪检测及软件分析。

同样方法分选出(CD56^-CD34⁺CD144⁺)及(CD56⁺CD34⁺CD144⁺)细胞亚群，用流式细胞仪检测及软件分析。

1.4.3 单层细胞培养碱性磷酸酶染色 将流式细胞仪分选出的4类细胞(肌源性细胞D56⁺CD34^-CD144^-亚群、内皮性细胞CD56^-CD34⁺CD144⁺亚群、肌源-内皮细胞CD56⁺CD34⁺CD144⁺亚群及未分类群)分别加入6孔板中，每孔均加入含BMP4(200 μg/L)的10%胎牛血清细胞培养基中培养2 d(图1)。将细胞爬片取出，用PBS冲洗2遍，加入冷丙酮，固定10 min。用蒸馏水冲洗数次。加入新鲜配制的孵育液(体积分数3% β-甘油磷酸钠5 mL，2%巴比妥钠5 mL，2%硝酸钙10 mL，2%硫酸镁5 mL，蒸馏水25 mL)在37 ℃下孵育4 h。用蒸馏水冲洗数次。加入体积分数2%硝酸钴，作用5 min。蒸馏水冲洗数次。加入体积分数1%硫化铵，处理1 min(临用前配)，自来水冲洗。脱水，透明，封固。光学显微镜下观察碱性磷酸酶阳性细胞数目的百分比。

1.4.4 细胞体外3D培养 将流式分选出的4种细胞亚群，培养至第2代弃掉培养基，用PBS冲洗3遍，用0.25%的胰蛋白酶消化4 min，加入8 mL小牛血清终止消化，混匀吹打，计数。以肌源性细胞CD56为例，16个15 mL离心管各加入1.5 mL细胞悬浮液，每个离心管细胞数为2.5×10⁵个，以2 000 r/min离心5 min，弃上清。

成骨培养：8个15 mL离心管中各加入1 mL成骨细胞培养基(含质量浓度200 μg/L BMP4)，混匀后2 000 r/min离心5 min，含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，每隔两三天更换培养基；

成软骨培养：另外8个15 mL离心管中各加入1 mL成软骨细胞基础培养基(含质量浓度200 μg/L BMP+质量浓度10 μg/L转化生长因子β3)，混匀后2 000 r/min离心5 min，含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，每隔两三天更换培养基。

1.4.5 硝酸银染色成骨分析 按以上3D培养7，14，21 d收集样本，用石蜡包埋细胞团块，切片后用硝酸银染色。具体步骤：取石蜡切片，蒸馏水稍洗，体积分数2%硝酸银溶液浸染16 h，快速用蒸馏水冲洗数次，加人氨银溶液，浸染20 min，快速用蒸馏水冲洗数次，梯度乙醇脱水二甲苯透明封固。

1.4.6 阿尔新蓝染色成软骨分析 4种3D培养细胞团块，于21 d收集样品并用石蜡包埋，切片用阿尔新蓝染色：二甲苯脱蜡梯度乙醇脱水后，蒸馏水冲洗10 min，体积分数3%醋酸分化液处理3 min，阿尔新蓝染色30 min，自来水冲洗1 min。二甲苯透明封固。

1.5 主要观察指标 各组细胞骨代谢情况，成骨及成软骨分化能力的差异。

1.6 统计学分析 所有实验均重复3次以上，计量资料数据用x(_)±s表示。采用SPSS 21.0统计学软件对所得实验数据进行统计学分析，两组间数据比较采用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

骨骼肌来源间充质干细胞是一种优良的软骨再生的种子细胞^[13-14]。骨关节领域利用组织工程技术促进骨和软骨组织再生的研究发展迅速，多种组织来源的间充质干细胞可被利用作为骨和软骨组织工程的种子细胞^[14-15]。以往已有不少研究者运用不同的方法研究软骨修复，其中包括了对种子细胞的筛选^[12]，但是目前还没有发现更加优质的种子细胞来源^[9^，^16-17]。在自体软骨细胞植入中首先要解决细胞量的问题，种子细胞的选择必须服务于临床应用。人骨骼肌细胞具有成骨成软骨的多向分化潜能，来源丰富，生长速度快^[18]。患者自身来源的骨骼肌源性干细胞能够自体移植^[9^，^19]，可克服种族及免疫障碍，具有广阔的应用前景。因此骨骼肌来源的间充质干细胞可以作为更理想的成骨及成软骨的干细胞的种子细胞来源，以供科研需求及临床应用^[20]。

以往研究发现不同剂量的细胞因子可以诱导间充质干细胞向不同的方向分化^[2]。实验在细胞培养过程中发现，不同细胞因子对细胞分化产生的影响各异^[21]。BMP4培养让干细胞主要向骨细胞进行分化，而(BMP4+转化生长因子β3)则能够使干细胞主要向软骨细胞分化，且不同剂量的BMP4及不同培养时间其效果也有明显区别^[1^，^22-24]。

实验利用流式细胞术分选出3种骨骼肌细胞亚群，并对其成骨及成软骨能力进行分析。之前的研究已经阐明，通过现有技术分离出的人骨骼肌来源的间充质干细胞在体内或体外可以进行成骨分化以应用于骨缺损^[16^，^18]。然而所分离的骨骼肌细胞分化能力并不稳定，其成骨能力仍不十分理想^[10^，^25]。研究认为，骨骼肌干细胞可能具有不同的细胞亚群，这些不同的细胞亚群可能有成骨及成软骨潜能的差异^[1^，^26]。为了进一步探究出哪种细胞亚群具有更好的成骨或成软骨潜能，为骨及软骨修复提供更加优质的种子细胞，实验研究利用流式分选术从人骨骼肌中分离出共同表达肌源性和内皮性标记物的一些肌源性间充质干细胞，这些人骨骼肌来源的间充质干细胞表现出分化成骨及成软骨潜能^[27-28]，更重要的是，这些分化潜能与CD56或CD34，CD144等亚群细胞表面标志物的表达情况有密切关系。CD56⁺细胞与CD56^-亚群相比其成骨能力更强，而只有CD56⁺CD34⁺CD144⁺组的细胞似乎呈现更弱的肌源性特征。

实验认为成骨与成软骨潜能与不同的骨骼肌间充质干细胞类型有关。人骨骼肌来源的间充质干细胞CD56⁺亚群和成骨有密切关系，可作为临床骨缺损修复的种子细胞。同时CD56⁺CD34⁺CD144⁺亚群分化能力更强，具有更强的成软骨潜能，可以作为一种新的更优质的种子细胞向软骨分化，以应用于软骨缺损及退变等相关疾病的临床治疗。当然实验没有进一步探究其他骨骼肌来源间充质干细胞亚群，这些其他亚群的成骨及成软骨潜能还需要进一步的深入研究，同时缺少体内实验的进一步验证，体内外可能有一些差异，但是实验首次验证了肌源性细胞CD56⁺CD34^-CD144^-亚群、内皮性细胞CD56^-CD34⁺CD144⁺亚群、肌源-内皮细胞CD56⁺CD34⁺CD144⁺亚群的体外成骨及成软骨潜能，这为骨及软骨修复提供了不可或缺的优质种子细胞。同时应用自体骨骼肌间充质干细胞作为种子细胞与临床转化医学联系更加紧密，患者的依从性更好，具有很高的临床应用价值^[29-39]。

人骨骼肌来源不同表面标志物间充质干细胞特定亚群的多向分化潜能

Multi-directional differentiation potential of subpopulations of mesenchymal stem cells isolated from human skeletal muscle expressing different myogenic and endothelial markers

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