脐带间充质干细胞移植治疗慢性肝衰竭

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
慢性肝衰竭：在肝硬化的基础上，肝功能进行性减退和失代偿：①血清总胆红素明显升高；②白蛋白明显降低；③出血倾向明显，凝血酶原活动度(PTA)≤40%(或INR≥1.5)，并排除其他原因者；④有腹水或门静脉高压等表现；⑤肝性脑病。
脐带间充质干细胞阻止和减缓肝衰竭进展的可能机制：①干细胞可以分泌多种细胞因子和生长因子，抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞再生，延缓肝纤维化进展，增强了肝脏的合成功能；②移植的干细胞通过归巢能力到达受损的肝脏，在肝脏微环境中分化为功能性肝细胞，促进肝脏的修复再生，使肝脏的合成功能增强；③干细胞可以减少CD4(+)T细胞的浸润和激活，抑制Th1辅助细胞，调节各种免疫细胞的增殖和功能等。

摘要
背景：脐带间充质干细胞来源丰富，取材方便，增殖能力强，可以分化为肝细胞，为肝衰竭治疗开辟了新途径。
目的：观察脐带间充质干细胞移植治疗慢性肝衰竭的安全性和疗效。
方法：慢性肝衰竭患者50例，按平行对照分组方式分为2组：干细胞组25例，在内科综合治疗的基础上给予脐带间充质干细胞移植，经前臂静脉途径输注脐带间充质干细胞(1.4-2.3)×10⁶/kg，总体积100 mL，对照组25例，给予单纯内科综合治疗，输注等体积的生理盐水，每半个月1次，共输注3次。于治疗前、治疗后2，4，12，24周观察患者的肝功能、凝血酶原活动度、MELD评分、临床症状、生存情况及不良反应。
结果与结论：①干细胞组白蛋白、凝血酶原活动度在治疗后12，24周较对照组明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；MELD评分在治疗后4，12，24周较对照组明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；②两组丙氨酸转氨酶、总胆红素比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③治疗4周后，干细胞组临床症状明显改善，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；④随访24周，干细胞组生存率高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤未出现与干细胞治疗相关的不良反应，无肝癌发生；⑥结果表明，脐带间充质干细胞移植治疗慢性肝衰竭患者安全有效，可明显提高患者生存率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-9862-297X(张岁)

关键词: 干细胞, 移植, 脐带间充质干细胞, 慢性肝衰竭, 乙型肝炎病毒, 肝功能, 凝血酶原活动度, MELD评分, 安全性

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord mesenchymal stem cells are plentifully and conveniently obtained with a high proliferative ability, and have opened up a new way to treat patients with liver failure as they can differentiate into hepatocyte-like cells.
OBJECTIVE: To observe the safety and efficacy in the treatment of chronic liver failure by transplanting umbilical cord mesenchymal stem cells.
METHODS: Using parallel contrast method, 50 patients with chronic liver failure were divided into two groups, namely a stem cell group and a control group, containing 25 patients in each group. For the first group, transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells, (1.4-2.3)×10⁶/kg, 100 mL, was given on the basis of medical comprehensive treatment, while for the second group only simple medical comprehensive treatment was given. The injection was done every 15 days, totally three times. Liver functions, prothrombin activity, Model for End-Stage Liver Disease (MELD) score, clinical symptoms, survival and side effects of the patients were observed before and 2, 4, 12 and 24 weeks after the treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the albumin level and prothrombin activity were significantly increased in the stem cell group 12 and 24 weeks after treatment (P < 0.05), while the MELD score was significantly decreased in the stem cell group at 4, 12 and 24 weeks after treatment (P < 0.05). There was no significant difference in alanine aminotransferase and total bilirubin levels between the two groups (P > 0.05). Four weeks after treatment, clinical symptoms of the stem cell group improved significantly in comparison with the control group (P < 0.05). During the 24-week follow-up, the survival rate in the stem cell group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Additionally, there were no adverse reactions and liver cancer associated with the stem cell therapy. Results show that it is safe and effective to treat patients with chronic liver failure through the transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells, and the cell transplantation can significantly improve patients’ survival rate.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Liver Failure, Hepatitis B virus, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张岁，柳立平，马文波，贾蓓，王海舫，解从君. 脐带间充质干细胞移植治疗慢性肝衰竭[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2056-2061.

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图/表（结果） 2

2.1 参与者数量分析 干细胞组治疗12周死亡5例，其中2例死于肝性脑病，2例死于上消化道出血，1例死于肝肾综合征；对照组治疗4周死亡2例，均死于上消化道出血，治疗12周死亡9例，其中4例死于上消化道出血，3例死于肝性脑病，1例死于肝肾综合征，1例死于感染性休克，治疗24周死亡1例，死于肝性脑病。图2为患者入组流程图。

2.2 基线情况比较 对两组患者的年龄、性别、生化指标及MELD评分进行比较，差异均无显著性意义，基线特征基本一致，见表1。

2.3 两组患者生化指标及MELD评分的改善情况 干细胞组白蛋白及凝血酶原活动度在治疗后12，24周均较对照组明显升高，差异有显著性意义(P均< 0.05)；干细胞组MELD评分在治疗后4，12，24周均较对照组降低，差异具有显著性意义(P均< 0.05)；两组间丙氨酸转氨酶、总胆红素比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2-5。

2.4 临床症状改善情况 治疗4周后，干细胞组食欲、乏力、腹胀及腹水情况均较对照组明显改善，差异具有显著性意义(χ²=5.556，5.333，4.160，5.195，P均< 0.05)，见表6。

2.5 生存情况比较 干细胞组25例患者在24周的随访中，生存人数20例，死亡人数5例，其中死因为肝性脑病2例，上消化道出血2例，肝肾综合征1例；对照组25例患者在24周的随访中，生存人数13例，死亡人数12例，其中死因为肝性脑病4例，上消化道出血6例，肝肾综合征1例，感染性休克1例，干细胞组患者生存率高于对照组，差异有显著性意义(χ²=4.504，P=0.034)，见图3。

2.6 不良反应发生情况 随访24周未发现与干细胞治疗相关的不良反应，无肝细胞癌发生。

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引言

材料方法

1.1 设计 前瞻性、单盲、平行对照研究。

1.2 时间及地点 于2012年9月至2015年9月在河北医科大学第一医院中西医结合肝病诊疗中心完成。

1.3 对象 入选慢性肝衰竭患者50例，按平行对照分组方式分为2组：干细胞组25例，年龄35-67岁，在内科综合治疗的基础上给予脐带间充质干细胞治疗；对照组25例，年龄33-69岁，给予内科综合治疗，所有患者均口服核苷类药物抗乙肝病毒治疗。两组慢性肝衰竭患者基线资料差异无显著性意义。

纳入标准：①慢性肝衰竭患者诊断符合2012年《肝衰竭诊治指南》中慢性肝衰竭的诊断标准；②年龄30-70岁；③均为乙型肝炎病毒导致的慢性肝衰竭；④患者签署知情同意书。

排除标准：①合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、HIV感染；②酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎；③肝癌或其他脏器肿瘤；④严重心肺脑疾病以及衰竭状态患者；⑤高度过敏体质；⑥怀孕及哺乳期的女性；⑦有精神疾病者。

1.4 方法

1.4.1 脐带间充质干细胞制备 脐带由河北医科大学第一医院产科提供，产妇知情同意并签署知情同意书。脐带间充质干细胞为河北医科大学第一医院细胞治疗中心制备，采用贴壁培养法分离培养。脐带间充质干细胞传代到第3代，镜下观察细胞贴壁良好，融合密度达85%。流式细胞仪检测细胞高表达间充质干细胞标志CD44、CD73，不表达造血干细胞标志CD34、CD45及主要组织相容性复合体标记物HLA-DR，说明脐带间充质干细胞分离培养成功且免疫原性低，见图1。

收集培养至第4代的脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为(2-4)×10¹⁰ L^-¹，以生理盐水稀释到100 mL。

1.4.2 细胞回输 患者取仰卧位，采用单盲法经前臂静脉途径输注细胞，输注细胞前20 min肌肉注射苯海拉明注射液20 mg，然后再静脉滴注脐带间充质干细胞。干细胞组输注脐带间充质干细胞数量为(1.4-2.3)×10⁶/kg，总体积100 mL，对照组输注等体积的生理盐水，每半个月1次，共输注3次。

1.5 主要观察指标 治疗后2，4，12，24周检测白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆红素(bilirubin，TBIL)，凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)及MELD评分，观察患者的临床症状改善和生存情况，术后不良反应及肝细胞癌发生率。

MELD分值=3.8×ln[血清胆红素(μmol/L)]×0.059+ 11.2×ln(国际标准化比值INR)+9.6×ln[血清肌酐(μmol/L)]×0.011 3+6.4×(胆汁淤积或酒精性为0，其他为1)。

1.6 统计学分析 计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用成组t 检验，计数资料采用χ²检验或Fisher精确概率法，采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，并用Log-rank法进行生存曲线比较，所有数据用SPSS17.0软件分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肝衰竭是多种原因引起的严重肝脏损伤，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能严重障碍的一组临床症候群，内科治疗缺乏特效药物和手段，病死率高。干细胞移植技术的发展为肝衰竭治疗提供了希望。脐带间充质干细胞增殖能力强、具有多分化潜能^[19]、低抗原性^[20]、低病毒感染率、来源丰富、取材方便、无伦理障碍，适用于细胞治疗。Feng等^[21]用脐带间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭小鼠，结果显示在治疗组中，小鼠肝功能明显改善，肝组织中肝细胞特有标志物如CK18和甲胎蛋白明显升高，表明脐带间充质干细胞可以分化为肝细胞，从而修复肝损伤。Yang等^[22]将脐带间充质干细胞经尾静脉移植治疗爆发性肝衰竭小鼠，结果示脐带间充质干细胞移植治疗可减少肝坏死，促进肝再生，提高小鼠的生存率，并且在小鼠肝组织中检测到人白蛋白、甲胎蛋白和CK18，提示脐带间充质干细胞可归巢至损伤的肝脏，分化为肝样细胞。动物实验为脐带间充质干细胞移植治疗肝衰竭的临床应用奠定了理论基础。Shi等^[23]研究证实经外周静脉移植脐带间充质干细胞治疗慢加急性肝衰竭患者，能改善患者肝功能，降低MELD评分，显著提高患者生存率。但对于慢性肝衰竭患者的临床疗效，仍需进一步探讨。为此，作者通过外周静脉移植脐带间充质干细胞治疗慢性肝衰竭患者，对其临床疗效进行了分析。

研究结果显示干细胞组中白蛋白及凝血酶原活动度较对照组升高，MELD评分较对照组降低，生存率高于对照组，组间比较均具有显著性意义。白蛋白及凝血酶原活动度均为肝脏合成功能的指标，表明脐带间充质干细胞可以提高肝脏的合成功能，改善MELD评分，提高患者的生存率，其可能机制为：①干细胞可以分泌多种细胞因子和生长因子，抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞再生^[24-26]，延缓肝纤维化进展^[27-31]，增强了肝脏的合成功能；②移植的干细胞通过归巢能力到达受损的肝脏^[32]，在肝脏微环境中分化为功能性肝细胞^[33-36]，促进肝脏的修复再生，使肝脏的合成功能增强；③肝组织在病毒性肝炎肝衰竭发生过程中依次经历了免疫损伤、缺血缺氧和内毒素血症等三重致死性打击，其中免疫损伤是其始发因素^[37]，有研究证明干细胞可以减少CD4(+)T细胞的浸润和激活，抑制Th1辅助细胞，诱导调节性T细胞，调节各种免疫细胞的增殖和功能等^[38-40]，干细胞的这些免疫调节作用阻止和减缓肝衰竭的进展，有效提高了患者的生存率。两组患者丙氨酸转氨酶、总胆红素组间比较差异无显著性意义，但治疗后均较治疗前降低，考虑与保肝降酶效果显著有关。治疗4周后，干细胞组临床症状较对照组明显改善，且无严重不良反应发生，无肝细胞癌发生，安全性好。

总之，脐带间充质干细胞经外周静脉回输治疗慢性肝衰竭患者，可改善患者的肝功能、凝血功能和临床症状，提高患者的生存率，且无严重不良反应发生，安全有效。但病例数量较少，随访时间短，仍需加大样本量，对其远期临床疗效及不良反应继续观察，为干细胞治疗肝衰竭提供更多的临床经验。