麝香酮对外源性骨髓间充质干细胞在颅骨缺损大鼠体内迁移的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
麝香酮：是从鹿科动物林麝Moschus berezovskii Flerov或原麝Moschus moschiferus L。成熟雄体香囊中的干燥分泌物麝香经蒸馏提取得到的活性成分之一，学名为3-甲基十五烷酮，是麝香的主要香味成分。
细胞标记：是指在多细胞系统中，为了追踪调查某特定细胞(群)的作用和行为，把作为对象的细胞(群)加以标记。间充质干细胞的标记物为CD105?CD73和CD90≥95%，CD45?CD34?CD14?CD11b?CD79a?CD19或HLA-Ⅱ类分子< 2%?

摘要
背景：骨髓间充质干细胞是多向分化干细胞，在骨折愈合和中有着重要作用。如何促进其在体内迁移，进而促进骨缺损的修复，有着重要研究意义。
目的：研究不同浓度麝香酮对外源性骨髓间充质干细胞在体内迁移的影响，探讨其促进骨折愈合的机制及其引经理论初探。
方法：建立大鼠颅骨缺损的大鼠模型；贴壁筛选法提取干细胞，取第3代细胞，利用DAPI进行标记，然后尾静脉回植入颅骨缺损的大鼠体内。分别以0，42，84，168 μL/kg麝香酮灌胃1次。
结果与结论：与高剂量麝香酮组和空白组相比，低、中剂量麝香酮组骨缺损部分的骨髓间充质干细胞数量增加，干细胞因子和Fractalkine的表达水平明显增加。提示中低剂量麝香酮具有促进外源性干细胞在体内的迁移作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9308-0913(侯费祎)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 麝香酮, 颅骨缺损, DAPI, 细胞迁移, 干细胞因子, Fractalkine, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are a kind of stem cells with multi-directional differentiation ability and play an important role in the healing of fractures. Therefore, it is of great significance to explore how to promote the BMSCs migration in vivo, thereby promoting bone defect repair.
OBJECTIVE: To study the effects of different concentrations of musk ketone on in vivo migration of exogenous BMSCs, and to preliminarily explore the mechanism of fracture healing and cited theory.
METHODS: A rat model of skull defects was made. Passage 3 BMSCs were harvested by using adherence method, labeled with DAPI, and then injected via the tail vein into the model rats. After that, the rats were intragastrically administrated with 0 (blank control), 42 (low dose), 84 (middle dose), 168 μL/kg (high dose) musk ketone, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of exogenous BMSCs in the defect region, and the expression of stem cell factor and Fractalkine showed a significant increase in the low- and middle-dose groups compared with the high-dose and blank control groups. These findings indicate that the low- and middle-dose musk ketone can promote the in vivo migration of exogenous stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cell Movement, Fractures, Bone, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

侯费祎，谢兴文，李慎松，邵宏斌，张莲. 麝香酮对外源性骨髓间充质干细胞在颅骨缺损大鼠体内迁移的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2043-2048.

Hou Fei-yi, Xie Xing-wen, Li Shen-song, Shao Hong-bin, Zhang Lian. Effect of musk ketone on in vivo migration of exogenous bone marrow mesenchymal stem cells in skull defect rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2043-2048.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年6月在甘肃中医药大学动物实验中心及甘肃省中医药研究院细胞培养中心完成。

1.3 材料

动物：①SPF级SD大鼠40只，鼠龄4个月，雌雄各半，体质量200-220 g；②雄性SPF级SD大鼠5只，鼠龄2个月，体质量120-130 g。所有大鼠均由甘肃中医学院动物实验中心提供。

药物：麝香酮，剂量10 g/瓶，购自成都曼思特生物科技有限公司。

主要试剂及仪器：氯胺酮购自西安力邦制药有限公司；3-异丁基-1-甲基购自莱阳市双双化工厂；胰岛素购自江苏万邦医药股份有限公司；地塞米松购自广西万德药业股份有限公司)；FITC CD44，FITC CD45及FITC CD90购自美国B-D公司；DAPI购自博士德公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM/F-12购自GIBCO公司；胰蛋白酶购自Sigma公司；乙二胺四乙酸购自莱阳市双双化工厂；倒置相差显微镜(CX-17)、二氧化碳培养箱(MCO-15AC)、紫外灯购自日本OLYMPUS公司，高压灭菌器(LDZX-30KBS)购自上海东亚压力容器公司；牙科钻购自上海岭之崎精密仪器有限责任公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 采用贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞^[9]。在无菌条件下将2月龄大鼠脱颈处死后，取股骨和胫骨，去除周围组织，剪除干骺段，暴露髓腔。用DMEM/F12培养液对髓腔进行冲洗，过滤，吹打均匀后移入培养皿内，在37 ℃体积分数5%CO₂孵育箱内培养，每3 d换液1次。在相差显微镜见细胞汇合成单层时，当原代细胞融合成单层或接近单层时，进行细胞传代：吸去培养液，用PBS轻轻清洗1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA 0.02%) 1.0-2.0 mL，轻轻晃动培养皿，使消化液覆盖整个皿底，37 ℃消化1.0- 2.0 min，倒置相差显微镜下见细胞皱缩，间距加大，分离成单个小圆细胞时，滴加含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中止消化，然后用吸管反复吹打悬浮细胞，制成细胞悬液。按照1∶3的比例接种到新的培养皿中，每2 d换液1次。

1.4.2 骨髓间充质干细胞鉴定

成脂诱导：细胞传至第3代时，利用成脂诱导液(0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基、10 μmol/L胰岛素、0.5 μmol/L地塞米松、体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行诱导，15 d后利用40 g/L多聚甲醛固定10 min，蒸馏水漂洗3次，油红O染色观察。

成骨诱导：细胞传至第3代时，利用成骨诱导液(10 mmol/L的β-甘油磷酸钠、1×10^-⁷ mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸)进行诱导，25 d后利用40 g/L多聚甲醛固定10 min，蒸馏水漂洗3次。5%硫代硫酸钠孵育30 min，蒸馏水冲洗，加入1%硝酸银溶液，紫外灯下染色30 min，蒸馏水冲洗掉浮于表面的黑色物质，继续用5%硫代硫酸钠染色20 min，蒸馏水漂洗后观察。

细胞表型鉴定：原代细胞传代至第3代后，0.25%胰酶消化，培养基终止，反复吹打，将细胞悬液置于离心管中，1 000 r/min离心10 min，弃上清。加10 mL PBS，1 000 r/min离心10 min，弃去上清。重复3次。然后取200 μL细胞，加入FITC CD44，FITC CD45及FITC CD90(1∶40)50 μL，37 ℃避光孵育30 min。加10 mLPBS，1 000 r/min离心10 min，弃去上清。重复3次。加入500 μLPBS，流式细胞仪检测CD44，CD45及CD90表达。

1.4.3 细胞标记 待第3代细胞融合80%以上时，加入终浓度为50 mg/L DAPI标记2 h。

1.4.4 MTT检测 将细胞浓度3×10⁷ L^-¹ DAPI标记的第3代细胞(标记组)和未标记的3代细胞(空白组)，分别接种于96孔培养板，每孔100 µL，37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下分别培养24，48，72 h后，弃培养液，PBS漂洗2次，换含0.5%MTT的无血清的DMEM/F12培养液，继续孵育4 h，弃培养液，每孔加入100 µL的DMSO，摇床振荡10 min，测量490 nm处吸光度值。

1.4.5 颅骨骨缺损模型的建立 4月龄大鼠行腹腔麻醉(用氯胺酮(0.1 g/kg)，麻醉后，取侧卧位，术野处剪毛消毒，手术部位脱毛消毒。在头部右侧做一纵行切口，暴露颅骨并切除局部骨膜。用牙科钻造成直径6 mm的圆形骨缺损^[10]。生理盐水冲洗骨缺损部位以去除残存骨屑，逐层缝合伤口。

1.4.6 细胞移植 造模2 h后，将标记后的细胞用胰蛋白酶消化，配置成1×10⁷ L^-¹细胞混悬液，通过尾静脉注入4月龄造模大鼠体内，每只大鼠1 mL^[11]。

1.4.7 药物干预 将造模大鼠随机分为4组，每组10只，移植后第2天分别0，42，84，168 μL/kg麝香酮进行灌胃，只给药一次^[12]。

1.4.8 免疫组化检测 细胞移植2周后，氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔麻醉，脱颈处死动物，取骨缺损处骨痂后置于40 g/L多聚甲醛中固定1 d，流水洗涤，脱钙液脱钙12 d，浸蜡，包埋，切片(厚度4 μm)，切片60 ℃烤40 min，常规脱钠、水化；体积分数30%过氧化氢室温灭活8 min，蒸馏水洗；热修复抗原，胎牛血清封闭，一抗湿盒4 ℃孵育过夜，PBS洗，生物素标记的山羊抗小鼠IgG孵育20 min，PBS洗；SABC 37 ℃烤20 min，PBS洗，DAB显色，蒸馏水洗；中性树脂封固，显微镜观察，随机取3个200倍视野，检测累计吸光度值。

1.4.9 迁移细胞观察 细胞移植2周后，取骨缺损处骨痂切片，荧光显微镜观察，随机取3个200倍视野，检测累计吸光度值。

1.5 主要观察指标 移植后骨髓间充质干细胞迁移情况、干细胞因子和趋化因子Fractalkine的表达

1.6 统计学分析 用SPSS 16.0统计软件包进行统计处理。并用Bonferroni法进行组间两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞的于1987 年Friedenstein等^[13]首次发现。实验证明，机体内除了骨髓外，脐血及外周血中也存在间充质干细胞^[14-15]。但也有学者认为，外周血只能产生非融合的贴壁细胞层，并且表达造血细胞的表面标志，所以外周血并不是间充质干细胞丰富的来源。间充质干细胞可分化为各种中胚层组织细胞如脂肪细胞^[16]、成骨细胞^[17]、软骨细胞^[18]、心肌细胞^[19]。过去几十年，人们倾向于认为骨髓间充质干细胞的分化替代功能是其参与和促进组织损伤修复的主要方式。近年来，随着研究的深入，学术界提出了一种新的观点：骨髓间充质干细胞参与组织损伤修复可能通过至少两种不同的方式：旁分泌机制和分化替代机制，并且骨髓间充质干细胞的旁分泌机制可能在组织修复中发挥着比分化替代功能更为关键的作用^[20]。

麝香酮为天然麝香的主要功能成分。孙蓉等^[21]研究表明麝香酮可抑制谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡，其作用机制可能与抑制细胞内钙超载，稳定细胞线粒体跨膜电位有关，对于大鼠脑缺血再灌注损伤、氧化应激损伤人血管内皮细胞后的细胞凋亡均有保护作用^[22-25]。同时，邹亮等^[8]研究发现麝香酮在小肠段肠道吸收较好、迅速，从小肠各肠段吸收速率和程度的统计学分析表明，麝香酮在十二指肠中的吸收速率高于空肠回肠，吸收程度高于回肠。这为麝香酮的剂型设计供依据。同时鉴于麝香酮是麝香的主要有效成分，实验结果符合麝香辛香走窜的特点，为其临床用于急重症的治疗提供了理论基础和数据支撑。作者发现，麝香酮可以促进骨髓间充质干细胞的增殖以及成骨分化^[25]，但是其对于干细胞的迁移，是否有影响，还有待于研究。作者预实验尝试麝香酮静脉给药，因大鼠血管细，麝香酮粘稠度较大，脂溶性，溶质问题无法解决，且静脉给药困难，后期导致大鼠尾静脉栓塞坏死，故采用灌胃给药。

实验结果发现麝香酮对外源性骨髓间充质干细胞的迁移具有促进作用，以中低浓度效果较好。因此说明麝香酮促进骨折愈合主要机制之一是通过促进体内骨髓间充质干细胞的迁移，从而促进缺损处的骨痂形成、加速骨折的愈合；干细胞因子是一种多功能细胞因子, 刺激早期干细胞的增殖和定居；干细胞因子常与碱性成纤维细胞生长因子联合应用于各种来源干细胞的培养，促进干细胞的增殖分化和迁移^[26-39]。实验结果表明麝香酮可以干细胞因子和Fractalkine的表达，以中低浓度效果较好。实验过程中随着剂量增加，效果出现降低，可能是由于随着剂量的增高，当血药浓度达到一定峰值时，造成相关受体的饱和，导致反向的抑制，具体原因还需进一步研究。中医理论认为肾主骨，骨折的愈合与肾关系密切，所以说麝香酮与中医理论的上的足少阴肾经关系密切，但是其是否可以归属于足少阴肾经，还有待进一步的研究；干细胞作为一种进入体内的药物，而麝香酮正好促进这些药物向损伤处迁移，符合中医的引经理论“引药物直达病所”；与此同时麝香酮还可以促进干细胞因子和Fractalkine的表达，说明中医引经理论可能不仅仅是指引药物到达病所，还通过促进体内相关的的因子的表达，调整机体自身的坏境进行自我修复进而加速骨折的愈合。

同时，实验也存在诸多不足之处，中低浓度麝香酮促迁移效果较好，但是否存在比低浓度组效果更好的浓度，当麝香酮剂量增加，在哪个剂量开始出现抑制，目前还不明确；其促进干细胞迁移的具体机制尚不完全明确，与中医引经理论的结合点是否在此，还有待于进一步的研究。总之，随着干细胞的培养技术的成熟以及其多方向的分化潜能，为干细胞在疾病的治疗应用中提供了良好的应用前景和研究平台。促进外源性干细胞在体内的迁移，控制其向特定方向分化，是目前的主要任务。从细胞分子学角度对于中医引经理论的阐述尚不明确，需要找到一个契合点，进而更好地解读中医引经理论内涵。