重组腺病毒载体介导人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞增殖与凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2009-2014.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.008

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重组腺病毒载体介导人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞增殖与凋亡的影响

张霞，都治香，王娜，孟亚丽

河北医科大学第一医院，河北省石家庄市 050031

修回日期:2017-03-22 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 孟亚丽，主任医师，河北医科大学第一医院，河北省石家庄市 050031
作者简介:张霞，女，1971年生，汉族，硕士，主治医师，主要从事妇科相关研究。
基金资助:
河北省2014年度医学科学研究重点课题计划项目(ZD20140325)

Effects of recombinant adenovirus vector expressing human lactoferrin on proliferation and apoptosis of cervical cancer stem-like cells

Zhang Xia, Du Zhi-xiang, Wang Na, Meng Ya-li

First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China

Revised:2017-03-22 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Meng Ya-li, Chief physician, the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
About author:Zhang Xia, Master, Attending physician, the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
Supported by:
the Key Project of Medical Science Research in Hebei Province in 2014, No. ZD20140325

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
宫颈癌干样细胞：是指宫颈癌原代细胞中细胞可分化分具有干细胞特性的细胞，可采用SP法进行分选。
重组腺病毒：重组腺病毒是从由侵染色斑组成单位(pfu)中分离获得的。一个单色斑是线性载体质粒转染后在20 cm×15 cm板上由293A细胞连续侵染后被挑选和扩增形成的。重组腺病毒可通过超速离心纯化，并测定滴度及进行PCR鉴定。

摘要
背景：基因工程在人类治疗恶性肿瘤的过程中起着重要作用，腺病毒是常用的基因工程载体，近年来发现乳铁蛋白在多种肿瘤的发生、发展及转移中有着重要作用，但目前对于乳铁蛋白通过腺病毒载体导入人体内的表达情况的研究报道目前还比较少。
目的：观察重组腺病毒载体介导的人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞的增殖及凋亡的影响。
方法：通过体外培养小鼠宫颈癌原代细胞，采用SP法分选出宫颈癌干样细胞，将构建好的载有乳铁蛋白的重组腺病毒载体人乳铁蛋白转染于宫颈癌干样细胞，分组为空白对照组、空病毒组和重组腺病毒人乳铁蛋白组。而在人乳铁蛋白感染宫颈癌干样细胞后，通过MTT法检测人乳铁蛋白感染后宫颈癌干样细胞的增殖情况，划痕实验检测宫颈癌干样细胞的迁移，通过Western blot法检测乳铁蛋白在宫颈癌干样细胞内的表达，采用Annexin V-FITC/PI法测定宫颈癌干样细胞的凋亡情况。
结果与结论：与其他2组相比，重组腺病毒人乳铁蛋白组宫颈癌干样细胞增殖数量及划痕处细胞的数目减少，凋亡细胞增加(P < 0.05或P < 0.01)。结果证实，载有乳铁蛋白的重组腺病毒载体人乳铁蛋白用于感染体外培养的宫颈癌干样细胞后，能稳定在宫颈癌干样细胞内表达，且能明显抑制宫颈癌干样细胞增殖，减少细胞迁移，并促进细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8398-3350(张霞)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 宫颈癌干样细胞, 乳铁蛋白, 宫颈癌, 腺病毒, 划痕实验, 最佳感染复数, 增殖, 凋亡, MTT, 感染复数

Abstract:

BACKGROUND: Gene engineering plays an important role in the process of human malignant tumor treatment, and adenovirus vectors for gene therapy are commonly used. In recent years, lactoferrin is found to exert important effects on the occurrence, development and metastasis of a variety of tumors. However, little is reported on the in vivo expression of adenovirus vector mediated lactoferrin in the human body.
OBJECTIVE: To investigate the effect of adenovirus mediated human lactoferrin (Ad-hLF) on proliferation and apoptosis of cervical cancer stem-like cells.
METHODS: Primary cervical cancer cells from mice were cultured in vitro to sort cervical cancer stem-like cells using SP method. Afterwards, the stem-like cells were divided into three groups, blank control group, empty vector group, and Ad-hLF group, followed by transfection with nothing, Ad-GFP and Ad-hLF, respectively. After transfection, MTT assay was used to detect the proliferation of cervical cancer stem-like cells; scratch-wound assay was employed to detect the migration of cervical cancer stem-like cells; western blot assay was used to determine the expression of lactoferrin in cervical cancer stem-like cells; and Annexin V-FITC/PI was used to detect cell apoptosis.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control and empty vector groups, Ad-hLF significantly inhibited the proliferation of cervical cancer stem-like cells and reduced the number of scratched cells, while the cell apoptosis increased in the Ad-hLF group (P < 0.05 or P < 0.01). These findings indicate that the recombinant adenovirus vector mediated lactoferrin Ad-hLF for transfection of cervical cancer stem-like cells can be stably expressed in cervical cancer stem-like cells, and can inhibit the proliferation, increase apoptosis and reduce migration of cervical cancer stem-like cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Cell Proliferation

中图分类号:

R394.2

张霞，都治香，王娜，孟亚丽. 重组腺病毒载体介导人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞增殖与凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2009-2014.

Zhang Xia, Du Zhi-xiang, Wang Na, Meng Ya-li. Effects of recombinant adenovirus vector expressing human lactoferrin on proliferation and apoptosis of cervical cancer stem-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2009-2014.

图/表（结果） 2

2.1 SP法从宫颈癌细胞中分选宫颈癌干样细胞的鉴定结果 在宫颈癌原代细胞中采用流式细胞仪进行分析，采用Hoechst 33342荧光染料进行染色，可见多数细胞聚集在图的中央及偏右部分，为非SP细胞，将其他部分对Hoechst 33342荧光染料显示阴性结果的细胞分选出来即为宫颈癌干样细胞，见图1。

2.2 Ad-GFP对宫颈癌干样细胞的感染效率 由表1可见，Ad-GFP对宫颈癌干样细胞的感染效率随着MOI的升高而增加，但在显微镜下观察到当MOI=200时，细胞状态较差，虽然感染率较高，但出现细胞脱落不贴壁的状况，所以采用MOI=100在后续实验中感染细胞。

2.3 MTT法检测各组宫颈癌干样细胞增殖能力 由表2可见Ad-hLF感染宫颈癌干样细胞后，培养24 h检测时各组细胞增殖未见显著性差异，在36，48，72 h检测结果显示Ad-hLF组宫颈癌干样细胞的增殖情况受到明显抑制，比空白对照组及空病毒组明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，而对照组与空病毒组相比宫颈癌干样细胞增殖情况均无明显差异。
2.4 宫颈癌干样细胞凋亡情况 Annexin V-FITC/PI染色后，荧光显微镜下可以观察到细胞发出荧光信号，计算出200个细胞视野中阳性细胞数，空白对照组中宫颈癌干样细胞凋亡率为(20.11±3.25)%，空病毒组中宫颈癌干样细胞凋亡率为(23.43±2.55)%，Ad-hLF组中宫颈癌干样细胞凋亡率为(55.57±3.41)%。与对照组及空病毒组相比，Ad-hLF组阳性细胞数明显增多，宫颈癌干样细胞的凋亡数量明显增加(P < 0.05，P < 0.01)，而对照组与空病毒组相比宫颈癌干样细胞凋亡情况差异无显著性意义。

2.5 宫颈癌干样细胞感染后划痕实验结果 从图2可见，细胞划痕实验后经过24 h培养，空白对照组及空病毒组细胞增殖明显增加，划痕处可见细胞迁移，基本能使划痕处汇合，而重组腺病毒Ad-hLF感染组划痕处仍可清晰辨认，细胞迁移明显减少。

2.6 Western blot检测Ad-hLF感染后乳铁蛋白在宫颈癌干样细胞中的表达 由图3可见，对照组及空病毒GFP感染组均未见乳铁蛋白的表达，而重组腺病毒Ad-hLF感染组可见乳铁蛋白在宫颈癌干样细胞中的表达显著升高(P < 0.01)，其中空白对照组中乳铁蛋白相对灰度值为8.8±3.1，空病毒组灰度值为30.9±1.4，Ad-hLF组为110.2±2.4，3组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。

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引言

肿瘤的生长的抑制机制较为复杂，可由多种效应参与其中，包括抑制肿瘤相关的增殖因子、促进肿瘤细胞凋亡等。

宫颈癌是妇科恶性肿瘤中常见的一种，具有较高的发病率，其发生发展均有多种因素参与其中，目前研究显示宫颈癌的发生与细胞周期及细胞凋亡的调控密切相关^[1-4]。基因工程在人类治疗恶性肿瘤的过程中起着重要作用。

腺病毒载体是基因工程用于治疗肿瘤和代谢疾病的载体中应用广泛的一种，分裂或非分裂的细胞均可用腺病毒感染，且不以细胞增殖为条件，腺病毒可以感染人类多种体细胞，由于腺病毒所载基因能在机体内稳定表达且不影响所感染细胞的染色体，极少出现基因重排的现象也不会对基因组有影响，而腺病毒没有包膜，即使直接通过静脉注射也不容易被机体补体灭活，具有较高的效价^[5-6]。

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)具有多种功能，是转铁蛋白家族的主要成员之一。乳铁蛋白的基因普遍存在，并具有特异性，不仅参与铁的转运，还具有多种生物活性，如免疫调节作用，抗病毒、抗菌活性，抗氧化等^[7-8]。

近年来发现乳铁蛋白在多种肿瘤的发生、发展及转移中有着重要作用，主要表现为抑制性，宫颈癌在妇科肿瘤中逐年升高的发病率，使得抑制宫颈癌增殖转移及促进相关癌细胞凋亡成为研究者关注的重点之一^[9-14]。

因此，实验探讨重组腺病毒载体介导的人乳铁蛋白(Ad-hLF)对宫颈癌干样细胞的增殖及凋亡的影响，采用Ad-hLF体外感染宫颈癌干样细胞，采用最佳感染效率的感染复数，并检测感染后宫颈癌干样细胞的增殖及凋亡情况，为该方法在研究及临床应用中提供数据基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2016年2至10月在河北医科大学药理实验室完成。

1.3 材料

载体：重组腺病毒载体Ad-GFP和Ad-hLF由河北医科大学药理实验室构建。

细胞系：宫颈癌原代细胞来自河北医科大学第一医院肿瘤科。

1.4 实验方法

1.4.1 宫颈癌细胞原代分离与培养传代 采用组织块法进行原代培养，将分离出来的宫颈癌细胞用已加入双抗并含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液置于37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱中进行培养，每隔两三天用显微镜观察细胞生长状况，并进行换液。

待细胞贴壁生长达到70%-80%时，用预温的PBS洗涤2次，然后用体积分数0.25%的胰蛋白酶(Gbico，美国)进行消化，显微镜下观察细胞的形态变化，用完全培养液终止胰蛋白酶的消化。离心后小心弃去上清，加入新鲜培养基将细胞重悬，视细胞数量以1∶3-1∶4的比例分装于新的培养瓶内于培养箱(Sheldon，德国)中继续培养。

1.4.2 宫颈癌干样细胞的分选及培养 采用SP分选法从宫颈癌细胞中分选出干样细胞。

取对数期生长的第10代宫颈癌细胞，调整细胞浓度为10⁹ L^-¹，加入质量浓度5 mg/L 的 Hoechst 33342染料进行反应，终止反应后离心分离，细胞洗涤1次。将细胞置于流式细胞仪上进行分选，Hoechst 33342的激发波长在355 nm。将分选出的宫颈癌干样细胞进行培养检测。结果分选出的干样细胞约2×10⁵个细胞，随后在培养箱中进行体外扩增培养72 h。

1.4.3 腺病毒对宫颈癌干样细胞的感染效率检测 用对照组的空病毒Ad-GFP感染宫颈癌干样细胞，以确定最佳感染复数(multiplicities of infection，MOI)。

取生长良好的宫颈癌干样细胞，经胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液洗涤后，将细胞重悬，接种于24孔板，每孔1×10⁵个细胞，培养24 h，弃去原培养基。分别加入对照组病毒液Ad-GFP，其MOI分别为25，50，75，100，200，各个组别均设置3个重复孔。培养板置于培养箱中孵育4 h后加入培养液。

培养48 h后，用荧光倒置显微镜观察能发射荧光的细胞，并进行细胞计数，荧光细胞数于细胞总数的百分比即为腺病毒对宫颈癌干样细胞的感染效率。采用具有最佳感染效果的MOI数用于进行宫颈癌干样细胞感染，继续进行实验。

1.4.4 MTT法检测宫颈癌干样细胞的增殖 取对数生长的宫颈癌干样细胞接种于24孔板，每孔300 μL，细胞浓度为5×10⁷ L^-¹，分别设空白对照组(1640完全培养基正常培养)、空病毒组(加入含病毒Ad-GFP的1640完全培养基培养)和重组腺病毒Ad-hLF组(加入含病毒Ad-hLF的1640完全培养基培养)，对照组加入等体积的完全培养液，每组设4个重复孔。

分别于感染第24，36，48，72小时吸出每孔中的培养液，加入20 μL的MTT液(碧云天公司，上海)，孵育4 h后终止培养。弃去上清液，每孔加入DMSO 200 μL，在酶标仪上于570 nm 处测定各孔吸光度值(A)，按以下公式计算细胞生长抑制率，抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

1.4.5 Annexin V-FITC/PI法测定宫颈癌干样细胞的凋亡取对数生长的宫颈癌干样细胞接种于24孔板，每孔300 μL，细胞浓度为5×10⁷ L^-¹，分别设空白对照组、空病毒空病毒组和重组腺病毒Ad-hLF组，对照组加入等体积的完全培养液，每组设4个重复孔。

宫颈癌干样细胞感染Ad-hLF 48 h后，胰蛋白酶消化，1 000×g离心10 min，弃上清，磷酸盐缓冲液洗涤2次，用结合缓冲液将细胞重悬调整细胞浓度为1×10⁵个/mL。加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μL PI混匀；暗室中室温反应15 min；然后用荧光显微镜观察每200个细胞中的阳性细胞数。

1.4.6 细胞划痕实验 取对数生长的宫颈癌干样细胞接种于24孔板，每孔300 μL，细胞浓度为5×10⁷ L^-¹，分别设空白对照组、空病毒组和重组腺病毒Ad-hLF组，对照组加入等体积的完全培养液，每组设4个重复孔。在24孔板上用已灭菌的100 μL枪头划痕。用PBS洗细胞2次，去除刮起的细胞。感染Ad-hLF，24孔板中加入体积分数10%胎牛血清的RPIM1640培养基培养细胞，0 h和24 h时在倒置显微镜下观察细胞划痕的状态。

1.4.7 Western blot检测乳铁蛋白表达 Ad-hLF感染宫颈癌干样细胞48 h后，当细胞融合度约为80%时，将培养皿置于冰浴中，使用预冷的PBS漂洗细胞一两次，经胰蛋白酶消化，PBS洗涤后，当70%-80%的细胞形态呈圆形或类圆形时用完全培养液终止胰蛋白酶的消化，以1 000×g的转速进行离心5 min，小心弃去上清液，用磷酸盐缓冲液将细胞重悬，按BCA试剂盒说明书，提取细胞总蛋白。

根据 Bradford方法测定总蛋白浓度，将符合要求的样本蛋白用于上样，将样本和上样缓冲液混合均匀，煮沸5 min，室温冷却后进行上样。于SDS-PAGE琼脂凝胶上，进行电泳，待条带跑至底部即关闭电源停止电泳，小心取下凝胶，在转移槽的阳极板上按厚滤纸(经缓冲液浸泡)、PVDF膜、凝胶、厚滤纸的顺序放置，调节恒定电流2 mA，转膜时间约为2 h，将胶中的蛋白将转移至PVDF膜上。PVDF膜平放于小盒中用封闭液封闭，兔抗人乳铁蛋白一抗用封闭液以1∶1 000稀释后与PVDF膜在4 ℃中放置过夜，PBST洗膜3次，二抗1∶2 000稀释后与PVDF膜室温条件下于摇床上结合1.5 h，PBST洗膜3次，小心将膜平放于仪器上，有蛋白的一面向上，采用ECL化学发光试剂盒参照说明书的操作步骤，在化学荧光发光仪上进行曝光显像，并计算条带相对灰度值。

1.5 主要观察指标 ①宫颈癌干样细胞的增殖情况；②检测宫颈癌干样细胞的迁移；③宫颈癌干样细胞内乳铁蛋白的表达；④宫颈癌干样细胞的凋亡。

1.6 统计学分析 实验所得数据统计分析在SPSS 19.0软件中进行。计量资料用x(_)±s表示，多组间数据差异的比较采用重复测量方差分析或单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

宫颈癌是常见的恶性肿瘤之一。近年来在年轻女性中的发生率明显升高，临床的主要治疗策略包括手术切除治疗、放疗、化疗或联合治疗，然而晚期癌症常因已发生转移而使得手术无法完全切除病灶或患者已处于体力及免疫力较差的状态，已不适合病灶全切术，也无法支撑放射性治疗及化疗带来的副作用^[15-18]。

生物治疗是肿瘤治疗中的继3种常规疗法之后的第4种新型疗法^[19-23]。目前在宫颈癌的基因治疗中，采用的载体有病毒及非病毒载体系统两种。由于非病毒载体系统的转染率较低且表达时间较短，应用于全身性治疗效果不稳定等缺点，目前仍未能得到广泛使用^[24]。而病毒载体系统中，腺病毒载体在研究及临床中得到较高的重视，因其感染率较高，可插入的外源性基因片段大、病毒载体容易获得、宿主可选择的范围较多且不会与宿舍细胞的染色体整合等多种优点，使其远优于其他几种载体系统^[25-30]。

乳铁蛋白是在哺乳动物的乳清中广泛存在的一种球蛋白。其存在于多种组织中，在各种分泌物或体液中，以乳汁中乳铁蛋白含量最多，其他如泪液、唾液和精液中也发现乳铁蛋白的存在。

近年来，国内外均有不少报道表示乳铁蛋白对多种器官的肿瘤有抑制作用，参与肿瘤的发生、发展及转移等多个过程，且指出其可能是一种抑癌基因^[31-34]。

国外有研究者发现体外培养的正常人称纤维细胞及舌鳞癌细胞的生长并不受牛乳铁蛋白的影响，另一方面有学者的研究表明头颈部鳞癌的增殖会因人乳铁蛋白的干预而受抑制^[35-36]。国内学者在体外培养3种不同的头颈部细胞时，发现乳铁蛋白可抑制其增殖，且在干预72 h后开始观察到细胞凋亡的现象^[37-40]。

实验发现Ad-hLF能显著抑制宫颈癌干样细胞的增殖，比不进行任何处理的对照组以及空病毒感染组的细胞增殖明显降低。而且Ad-hLF感染后，宫颈癌干样细胞的细胞核染色明显增多，显示细胞凋亡增加。另外通过划痕实验结果表明，Ad-hLF感染宫颈癌干样细胞后细胞迁移明显减少。而在Ad-hLF感染宫颈癌干样细胞后，通过Western blot法检测发现Ad-hLF能明显检测到乳铁蛋白的表达，提示载有乳铁蛋白的重组腺病毒载体Ad-hLF用于感染体外培养的宫颈癌细胞宫颈癌干样细胞后，能稳定在宫颈癌细胞内表达，且能明显抑制宫颈癌干样细胞增殖，减少迁移，并增加凋亡。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

重组腺病毒载体介导人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞增殖与凋亡的影响

Effects of recombinant adenovirus vector expressing human lactoferrin on proliferation and apoptosis of cervical cancer stem-like cells

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