感觉神经递质降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨能力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.003

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 1980-1985.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.003

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感觉神经递质降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨能力的影响

陈杰^1，2，丁宇翔¹，刘彦普¹，马戈¹，刘伟¹

¹军事口腔医学国家重点实验室，口腔疾病国家临床医学研究中心，陕西省口腔疾病重点实验室，第四军医大学口腔医院口腔外科，陕西省西安市 710032；²解放军兰州军区总医院颌面外科，甘肃省兰州市 730050

修回日期:2017-03-24 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 丁宇翔，博士，副主任医师，军事口腔医学国家重点实验室，口腔疾病国家临床医学研究中心，陕西省口腔疾病重点实验室，第四军医大学口腔医院口腔外科，陕西省西安市 710032
作者简介:陈杰，男，1980年生，山西省阳泉市人，汉族，2003年解放军第四军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事颌骨代谢与骨质疏松的相关理论及临床研究工作。
基金资助:
国家自然科学基金(81271103)；陕西省社发攻关课题(2012K16-10-01)

Calcitonin gene-related peptide, a sensory neurotransmitter, promotes proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomized rats

Chen Jie^{1, 2}, Ding Yu-xiang¹, Liu Yan-pu¹, Ma Ge¹, Liu Wei¹

¹State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Oral Surgery, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; ²Departmen of Maxillofacial Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Revised:2017-03-24 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Ding Yu-xiang, M.D., Associate chief physician, State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Oral Surgery, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Chen Jie, M.D., Attending physician, State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Oral Surgery, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; Departmen of Maxillofacial Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81271103; the Special Project of Social Development and High Technology in Shaanxi Province, No. 2012K16-10-01

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓间充质干细胞分化：骨髓间充质干细胞分化的实质是骨髓间充质干细胞内基因的选择性表达，导致新的、特异性的蛋白质合成变化，进而引起生化、结构及功能上的改变。诱导因素和抑制因素的相互制约、激素及多种细胞信号分子形成的信号网络以及细胞本身所处微环境等，都会诱导相关基因在序列上发生改变，促使骨髓间充质干细胞向不同类型的细胞分化，或者分化能力受到影响。自人们首次发现大鼠骨髓间充质干细胞在体外培养条件下能形成钙化的骨样组织以来，围绕着骨髓间充质干细胞的成骨能力出现了大量的研究，而且骨髓间充质干细胞也作为一种组织工程的种子细胞来源得以广泛应用。目前诱导骨髓间充质干细胞成骨的方法多是采用含有地塞米松、β-甘油磷酸以及维生素C的条件培养液。
降钙素基因相关肽的分布：降钙素基因相关肽来源于脊髓后根神经节内的中小感觉神经元，并通过轴突传送到感觉神经末梢。虽然含有降钙素基因相关肽的感觉神经广泛分布于骨组织中，但它在骨组织中的不同部位其分布的密度是不同的，分布密度最高的地方在骨干骺端的骨小梁。在干骺端的骨表面，降钙素基因相关肽的神经纤维形成膨隆，内含丰富的分泌囊泡。而在血管旁分布的是含SP和TH的神经纤维。另外，从分布中可以看出含降钙素基因相关肽的神经纤维终止在骨骺处，表明其传导的目的地即为成骨、破骨细胞。

摘要
背景：研究发现降钙素基因相关肽能够增强成骨细胞的生物学活性，实验拟进一步检测降钙素基因相关肽对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
目的：探讨外源性降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨能力的影响。
方法：切除雌性SD大鼠双侧卵巢建立骨质疏松模型，并通过micro-CT验证。从假手术和去势大鼠股骨中提取骨髓间充质干细胞，培养液中添加不同浓度降钙素基因相关肽，MTT法检测细胞增殖能力。对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，在诱导液中添加不同浓度降钙素基因相关肽，成骨诱导7 d，采用Real time RT-PCR和Western blot检测成骨特异性蛋白Runx2，Osterix的表达，成骨诱导21 d进行茜素红染色。
结果与结论：①切除雌性大鼠双侧卵巢可成功建立骨质疏松模型；②不同浓度的降钙素基因相关肽可增强去势大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化能力，且具有剂量依赖性；③结果表明，降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力有直接促进作用，从而有利于骨形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4015-869X(陈杰)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 骨质疏松, 成骨分化, 降钙素基因相关肽, Runx2, Osterix, 细胞增殖, 成骨诱导, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Calcitonin gene-related peptide can promote the biological activity of osteoblasts. Here, we attempt to further study the effect of calcitonin gene-related peptide on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To observe the effects of exogenous calcitonin gene-related peptide on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomized rats.
METHODS: An ovariectomized osteoporosis model in female Sprague-Dawley rats was employed, which was testified by micro-CT. Bone marrow mesenchymal stem cells were obtained from the femur of rats undergoing sham operation and ovariectomy, and then cultured and induced in the culture medium and osteogenic medium containing different concentrations of calcitonin gene-related peptide, respectively. The cell proliferation was detected using MTT method. After 7 days of osteogenic induction, real-time RT-PCR and western blot were used to detect Runx2 and Osterix expression at mRNA and protein levels. After 21 days of osteogenic induction, the osteogenic differentiation potentials of the cells were detected using alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The osteoporosis model was successfully established by bilateral ovariectomy in the female rats. The proliferative and osteogenic differentiation potentials of bone marrow mesenchymal stem cells were dose-dependently enhanced by the different concentrations of calcitonin gene-related peptide. To conclude, the calcitonin gene-related peptide can increase bone formation by promoting the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells directly.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Calcitonin Gene-Related Peptide, Osteoporosis, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈杰，丁宇翔，刘彦普，马戈，刘伟. 感觉神经递质降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 1980-1985.

Chen Jie, Ding Yu-xiang, Liu Yan-pu, Ma Ge, Liu Wei. Calcitonin gene-related peptide, a sensory neurotransmitter, promotes proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomized rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 1980-1985.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年9月至2014年12月在解放军第四军医大学口腔医院军事口腔医学国家重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年雌性SD大鼠30只，体质量(200± 20) g，由解放军第四军医大学动物中心提供。所有动物均在相同条件下自由摄水食，分笼饲养于解放军第四军医大学口腔医院实验动物中心万级净化饲养间，饲养间温度在24-28 ℃。

1.3.2 主要试剂 α-MEM培养基、胎牛血清、青链霉素、胰蛋白酶、CGRP、MTT、茜素红(Sigma公司)；抗鼠Runx2抗体、抗鼠Osterix抗体、抗鼠β-actin抗体(Abcom公司)；兔抗鼠二抗(博士德公司)。

1.3.3 主要仪器 micro-CT系统(Siemens)；YJ-875 型超净台(苏州净化设备)；二氧化碳恒温孵箱(Forma)；倒置相差显微镜及照相系统(Olympus)；分光光度仪(Eppendorf)；电泳仪(BIO-RAD)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物模型建立及检测 30只成年SD雌性大鼠，随机分为去势组(25只)和假手术组(5只)。去势组行双侧卵巢切除术，假手术组仅打开腹腔，找到卵巢，切除周围脂肪。分笼饲养3个月后，行micro-CT检测大鼠股骨骨小梁显微结构变化，确定是否建模成功。

1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养 将上述2组SD大鼠进行脱颈处死，取大鼠双侧股骨，用体积分数为75%乙醇浸泡20 min。在加入缓冲液的无菌培养皿内，剔除大鼠股骨表面的肌肉，剥离干净后用无菌缓冲液冲洗2遍，剪断股骨两侧骨骺，用吸取α-MEM培养液的注射器反复冲洗骨髓腔，冲洗液加入离心管1 000 r/min离心5 min，去上清，加入含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基，反复吹打后接种于25 cm²培养瓶中，待细胞长满培养瓶壁时传代培养，传至第2代时用差速贴壁法除去成纤维细胞，然后再培养传代至第3代。

1.4.3 MTT法检测骨髓间充质干细胞增殖能力 取第3代骨髓间充质干细胞，加入胰蛋白酶消化，用含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基稀释成5×10⁴的细胞悬液，以每孔200 μL接种于96孔培养板，培养24 h，去势组更换为含有不同浓度CGRP(0，10^-⁶，10^-⁸，10^-¹⁰ mol/L)的培养基，假手术组培养基不变。培养48 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，在37 ℃培养箱中孵育4 h，吸除孔内培养基并加入150 μL二甲基亚砜，振荡处理10 min，使用ELISA检测仪测量吸光度值(波长=490 nm)。

1.4.4 骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化 取第3代骨髓间充质干细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2× 10⁸ L^-¹，接种于6孔培养板内，待细胞融合达到70%以上时，去势组更换为含有不同浓度CGRP(0，10^-⁶，10^-⁸，10^-¹⁰ mol/L)的成骨培养液，假手术组仅更换成骨培养液。成骨培养液包括α-MEM培养基，体积分数为10%胎牛血清，10 mol/L地塞米松，50 mg/L抗坏血酸及10 mmol/L β-甘油磷酸钠。

1.4.5 成骨能力检测 ①茜素红染色：成骨诱导21 d，弃培养上清液，PBS冲洗三四遍，加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗，加入茜素红于37 ℃染色20 min，倒去染色液，PBS冲洗，倒置显微镜观察，最后应用Neat Image进行定量分析；②Real time RT-PCR检测：成骨诱导7 d，提取细胞RNA，反转录后检测成骨相关基因Runx2和Osterix的表达，引物序列见表1；③Western blot检测：成骨诱导7 d，加入裂解液裂解细胞获得总蛋白，分析成骨诱导后成骨特异性蛋白Runx2，Osterix的表达，应用Image-Pro Plus 6.0进行定量分析。

1.5 主要观察指标 ①micro-CT检测结果；②MTT法检测大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力；③茜素红染色结果及定量分析；④RT-PCR及Western blot检测Runx2及Osterix的mRNA和蛋白水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示。组间比较采用t 检验。

讨论

骨质疏松，尤其是绝经后的老年妇女骨质疏松，是一个全球性的棘手问题，严重影响人类的生活质量。目前认为如何增强骨再生能力是治疗这类疾病的关键^[11]，而在这个关键之中骨髓间充质干细胞又是其重要的核心部分。骨髓间充质干细胞对于治疗骨丢失性疾病骨质疏松具有重要的意义。

CGRP是一种在骨组织中广泛分布且对骨组织代谢调节产生影响的重要神经肽^[12-13]。虽然含有CGRP的感觉神经广泛分布于骨组织中，但它在骨组织中的不同部位其分布的密度不同，骨干骺端骨小梁部位分布密度最高^[14]。大量研究发现CGRP对成骨细胞产生直接的影响，这种影响可能是通过一种受体产生，研究人员证实每个成骨细胞中至少含有3 000-3 500个这样的CGRP受体^[15]。

实验通过手术干预方式摘除SD大鼠双侧卵巢(即去势)，建立与绝经后妇女相似的动物模型，并通过micro-CT验证摘除卵巢大鼠确实存在骨质疏松。研究表明，神经系统分泌的神经肽CGRP在骨形成和骨吸收的平衡中起调节作用。那么对于已经发生骨质疏松疾病的老年妇女，是否能够通过增加其CGRP水平，来改变骨髓间充质干细胞的成骨能力，纠正骨质疏松呢？

实验将去势组和假手术组SD大鼠进行脱颈处死，取双侧股骨骨髓，分离培养获得骨髓间充质干细胞，在第3代骨髓间充质干细胞培养基内添加不同浓度CGRP进行干预，初步发现随着培养液内CGRP浓度的升高，骨髓间充质干细胞的增殖能力明显增强。同样也有学者发现，由人成骨细胞产生的CGRP能使第二信使-环磷酸腺苷(cAMP)的含量提高30-50倍^[16]。Michelangeli等^[17]对鸡、大鼠、小鼠成骨细胞的研究中发现，其成骨细胞产生的CGRP同样能使cAMP升高数十倍。这些结果提示CGRP可直接调节成骨细胞的增殖活性。

骨髓间充质干细胞增殖能力的强弱并不能对骨组织的骨含量产生重要影响^[18]。对骨组织内骨含量产生核心影响的是骨髓间充质干细胞的成骨分化能力^[19-22]。1998年Kawase等^[23]证明了CGRP可刺激大鼠成骨细胞中对ATP敏感的钾离子通道，导致急性钾离子外流和超极化，从而改变成骨细胞的形态和功能。1996年Vigneery等^[24]通过实验发现CGRP通过增强胰岛素样生长因子1的自分泌作用即诱导内源性胰岛素样生长因子1基因表达来间接调节成骨细胞活性，从而发挥成骨效应。研究显示，骨密度降低与雌激素、胰岛素样生长因子1水平降低及白细胞介素6增加等多种因素共同参与密切相关^[25]。Machwate等^[26]同样也发现胰岛素样生长因子1对骨组织有一定的保护作用。以上这些研究表明CGRP在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及细胞分泌骨基质的活动中起着极为重要的作用。实验对两组骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，去势组培养基中加入不同浓度的CGRP，成骨诱导21 d进行茜素红染色，可见去势组成骨能力较假手术组明显减弱，随着CGRP浓度的增加，去势后的骨髓间充质干细胞成骨能力得到明显提升。为了验证这一结果，于成骨诱导7 d，通过real time RT-PCR检测Runx2及Osterix的mRNA水平，Western blot检测Runx2及Osterix的蛋白水平。Runx2能激活并启动骨髓间充质干细胞向成骨细胞系分化，调节成骨细胞的成熟，是成骨细胞特异性转录因子和成骨细胞分化的关键因子。Osterix是继Runx2之后最新被发现的一种含锌指结构的成骨分化关键转录因子，可能在Runx2下游对骨形成发生作用^[27]。结果可见，去势后Runx2及Osterix的mRNA和蛋白水平明显降低，加入CGRP可以提高Runx2及Osterix的mRNA和蛋白水平，且呈明显的剂量依赖性。

综上所述，去势后大鼠雌激素水平下降，影响骨髓间充质干细胞的增殖和分化，从而影响骨组织的成骨能力；给予不同浓度CGRP干预，可以提高骨髓间充质干细胞的增殖及成骨能力，且呈明显的剂量依赖性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

感觉神经递质降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨能力的影响

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