锌转运蛋白1 siRNA转染骨髓间充质干细胞对肿瘤坏死因子α信号成脂通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 1986-1991.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.004

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锌转运蛋白1 siRNA转染骨髓间充质干细胞对肿瘤坏死因子α信号成脂通路的影响

章晓云¹，黎金焕¹，袁振中¹，陈跃平¹，夏天²，卓映宏²，冯洋²，蓝佼²，董盼锋¹，赵斌²

¹广西中医药大学附属瑞康医院骨科，广西壮族自治区南宁市 530011；²广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530011

修回日期:2017-03-20 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 陈跃平，博士，主任医师，广西中医药大学附属瑞康医院骨科，广西壮族自治区南宁市 530011
作者简介:章晓云，男，1986年生，江西省人，汉族，2015年广西中医药大学毕业，硕士，主治医师。
基金资助:
广西自然科学基金课题(2015GXNSFAA139136)；广西高校青年教师基础能力提升项目(KY2016YB204)；广西卫生厅重点课题(S201419-05)；广西中医药大学校级科研项目(2015LX027)；2016年研究生教育创新计划资助项目立项课题(YJS201650)；2014年广西中医药大学校级培育学科-骨外科学建设项目[J13167(7)]

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transfected by Zrt/Irt-like protein 1 on adipogenic differentiation via tumor necrosis factor alpha signaling pathway

Zhang Xiao-yun¹, Li Jin-huan¹, Yuan Zhen-zhong¹, Chen Yue-ping¹, Xia Tian², Zhuo Ying-hong², Feng Yang², Lan Jiao², Dong Pan-feng¹, Zhao Bin²

¹Department of Orthopedics, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; ²Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2017-03-20 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Chen Yue-ping, M.D., Chief physician, Department of Orthopedics, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang Xiao-yun, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2015GXNSFAA139136; the Basic Ability Improvement Project of Young Teachers in Guangxi Colleges and Universities, No. KY2016YB204; the Major Project of Guangxi Health Department, No. S201419-05; the Scientific Research Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2015LX027; 2016 Postgraduate Education Innovation Program, No. YJS201650; 2014 Discipline Construction for Orthopedic Surgery in Guangxi University of Chinese Medicine, No. J13167(7)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
锌转运蛋白家族蛋白：即锌铁调控蛋白，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物。绝大多数锌转运蛋白含有8 个跨膜结构域，其氨基和羧基末端均位于细胞膜外或细胞器膜内，该区域被证实具有潜在的结合金属离子的能力，表明该区域很可能具有结合、调控和转运锌离子的功能。
基因转染技术的特点：是指通过物理或生物方法将目的基因导入到真核细胞的基因组中，使其调控靶细胞向特定的方向表达。常用的方法分非病毒方法和病毒载体方法，非病毒方法有微粒子轰击法、脂质体转染法、电穿孔法等，病毒方法有反转录病毒法、慢病毒法、腺病毒法及腺相关病毒法。

摘要
背景：课题组前期研究已经证实乙醇能促进骨髓间充质干细胞成脂分化，上调肿瘤坏死因子α成脂通路蛋白PPARγ，aP2的表达。锌转运蛋白1(Zrt/Irt-like Protein 1，ZIP1)作为ZIP蛋白家族的成员与骨代谢和成骨分化有密切的关系。
目的：观察ZIP1 siRNA转染的骨髓间充质干细胞对肿瘤坏死因子α信号成脂通路的影响。
方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞，使用0.03，0.09，0.15，0.21 mol/L乙醇进行培养，再使用ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞，同时对兔骨髓间充质干细胞进行ZIP1转染培养。
结果与结论：①aP2，PPARγ蛋白的表达：不同浓度乙醇培养aP2，PPARγ蛋白表达均较明显升高(P < 0.05)；除0.03 mol/L乙醇组之外，其他浓度乙醇组三酰甘油水平明显升高(P < 0.05)；沉默ZIP1基因转染乙醇培养的骨髓间充质干细胞后，各乙醇浓度组aP2，PPARγ蛋白的表达量及三酰甘油水平均明显升高(P < 0.05)，而骨髓间充质干细胞经ZIP1表达载体转染后，aP2，PPARγ蛋白表达明显降低(P < 0.05)；②结果表明：沉默ZIP1表达能激活骨髓间充质干细胞的肿瘤坏死因子α信号成脂通路的表达，从而发挥促进细胞的成脂分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2572-0229(章晓云)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 锌转运蛋白, 成脂通路, 股骨头坏死, 三酰甘油, 过氧化物酶体增殖物激活受体γ, 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白, 蛋白免疫印迹, 乙醇, 广西壮族自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed that ethanol can promote adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), and up-regulate the expression of PPARγ and aP2 in the tumor necrosis factor α (TNF-α) signaling pathway. As a member of the ZIP protein family, Zrt/Irt-like protein 1 (ZIP1) is closely related to bone metabolism and osteogenic differentiation.
OBJECTIVE: To study the effect of BMSCs transfected by ZIP1 on TNF-α signaling pathway in the process of adipogenic differentiation.
METHODS: The BMSCs from rabbits were isolated and cultured under different concentrations of alcohol (0.03, 0.09, 0.15, 0.21 mol/L), followed by transfection by ZIP1 siRNA and ZIP1 expression vector.
RESULTS AND CONCLUSION: After culture in alcohol, the expression levels of aP2 and PPARγ proteins were both significantly increased (P < 0.05), and the level of triglyceride was increased in all alcohol groups except for 0.03 mol/L alcohol group (P < 0.05). After siRNA transfection, the expression levels of aP2 and PPARγ as well as the level of triglyceride were increased significantly in all the alcohol groups (P < 0.05); however, ZIP1 transfection decreased the expression levels of aP2 and PPARγ proteins (P < 0.05). To conclude, ZIP1 siRNA could promote the adipogenic differentiation of BMSCs through the activation of TNF-α signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Femur Head Necrosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

章晓云，黎金焕，袁振中，陈跃平，夏天，卓映宏，冯洋，蓝佼，董盼锋，赵斌. 锌转运蛋白1 siRNA转染骨髓间充质干细胞对肿瘤坏死因子α信号成脂通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 1986-1991.

Zhang Xiao-yun, Li Jin-huan, Yuan Zhen-zhong, Chen Yue-ping, Xia Tian, Zhuo Ying-hong, Feng Yang, Lan Jiao, Dong Pan-feng, Zhao Bin. Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transfected by Zrt/Irt-like protein 1 on adipogenic differentiation via tumor necrosis factor alpha signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 1986-1991.

图/表（结果） 2

2.1 细胞生长状态 将兔骨髓间充质干细胞常规培养1，2，3 d后观察细胞生长情况，可见细胞逐渐增多，形态由梭形变为细长梭形，详见图1。

2.2 油红O染色成脂鉴定结果 用定向成脂诱导液诱导30 d后，可见大量被染为红色的较标准的脂滴，表明骨髓间充质干细胞成脂分化能力正常，详见图2。

2.3 ZIP1 siRNA序列筛选结果 ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞24 h后，ZIP1 siRNA空序列组，ZIP1 siRNA序列1，2，3组中ZIP1 mRNA表达量分别为(1.00±0.32)，(0.41±0.18)、(1.96±0.08)，(0.11±0.07) mmol/L，与ZIP1 siRNA空序列组比较，序列1组与3组中的ZIP1 mRNA表达量明显降低，序列2组ZIP1 mRNA表达量明显升高(P < 0.05)；ZIP1 siRNA序列3组与ZIP1 siRNA序列1组比较ZIP1 mRNA表达含量有略低，差异无显著性意义(P > 0.05)。结果显示，ZIP1 siRNA序列3为最佳抑制序列，能够明显抑制ZIP1 mRNA的表达。

2.4 不同乙醇浓度下骨髓间充质干细胞中aP2，PPARγ蛋白的相对表达量及三酰甘油水平 0.03，0.09，0.15，0.21 mol/L乙醇组aP2，PPARγ蛋白表达明显升高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；0.03 mol/L乙醇组三酰甘油水平略升高，但与正常对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；0.09，0.15，0.21 mol/L乙醇组三酰甘油水平明显升高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；详见表1。

2.5 ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞在同一乙醇浓度诱导下aP2，PPARγ蛋白的相对表达量及三酰甘油水平0.21 mol/L乙醇组，0.21 mol/L乙醇+ZIP siRNA组中aP2，PPARγ蛋白表达及三酰甘油水平较正常对照组明显升高(P < 0.05)；0.21 mol/L乙醇+ZIP siRNA组中aP2，PPARγ蛋白表达及三酰甘油水平明显升高，与0.21 mol/L乙醇组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。详见表1。

2.6 ZIP siRNA和ZIP1转染骨髓间充质干细胞对aP2，PPARγ蛋白的相对表达量的影响 ZIP1表达组aP2，PPARγ蛋白表达明显降低，与正常对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，ZIP1 siRNA组aP2，PPARγ蛋白表达明显升高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；ZIP1表达组aP2，PPARγ蛋白表达降低，与ZIP1 siRNA组差异有显著性意义(P < 0.05)，详见表2。

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引言

近年来，随着对股骨头坏死机制研究的不断深入，干细胞移植治疗股骨头坏死逐渐引起了人们的重视，利用骨髓间充质干细胞显著的成骨及成血管作用，抑制成脂分化，直接作用于股骨头坏死病灶部位，达到治愈早期股骨头坏死的目的，是目前治疗早期股骨头坏死的热点^[1]。课题组前期研究结果也证实骨髓间充质干细胞具有成骨分化能力，促进股骨头坏死修复^[2-3]。骨髓间充质干细胞移植可为治疗早期股骨头缺血性坏死提供新方法，使患者避免晚期的关节置换，减轻患者的经济和精神痛苦，改善其生活质量，具有很好的社会经济效益，大幅度降低医疗成本。虽然骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头坏死取得了重大的进展，然而骨髓间充质干细胞在移植治疗的过程中仍然存在着诸多的问题^[4]，移植的骨髓间充质干细胞受到股骨头坏死病理损伤的影响，炎性因子对移植的骨髓间充质干细胞的存活和分化都有极大的影响^[5]，这也间接地减弱了骨髓间充质干细胞移植效果。如何提高移植的骨髓间充质干细胞对生存分化的体外环境的适应能力，减少病理状态对细胞的损害就成为目前研究的内容和方向。

在骨髓间质干细胞成骨分化和抑制成脂分化过程中，必须要通过机体相关的信号通路发挥其效能，人体内的电子传递、基因调控表达、酶的活性都对其有或多或少的关系，而金属元素如铁、锌和铜等是所有生物体的必需营养素，在体内这些生物化学过程中均发挥着重要作用^[6-7]。锌转运蛋白(Zrt/Irt-like protein，ZIP)蛋白家族能够促进锌离子从细胞外或细胞器的内室涌入到细胞质中^[8-9]。ZIP1作为ZIP蛋白家族的成员，其与骨代谢和成骨分化有密切的关系^[10]。过表达ZIP1的骨髓间充质干细胞可以促进向成骨细胞转化^[11-12]。

课题组前期研究已经证实乙醇能促进骨髓间充质干细胞成脂分化，上调肿瘤坏死因子α成脂通路，促进PPARγ，aP2蛋白的表达^[2-3]，但目前ZIP1转染骨髓间充质干细胞在酒精性股骨头坏死的病理情况下对肿瘤坏死因子α信号成脂通路的影响尚未清楚。实验通过使用ZIP1转染骨髓间充质干细胞对酒精性股骨头坏死过程中肿瘤坏死因子α信号成脂通路的影响研究，评估骨髓间充质干细胞经ZIP1转染后对酒精性股骨头缺血坏死的干预作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间与地点 于2014年1月至2015年6月在广西中医药大学动物实验室完成。

1.3 材料 成年雄性新西兰兔10只，平均体质量3.2 kg，由广西中医药大学动物实验室提供，许可证号：SYXK(桂) 2003-0001。

1.4 实验方法

1.4.1 兔原代骨髓间充质干细胞的提取、培养及传代 兔全身麻醉后，用18号硬膜外穿刺针接5 mL注射器，将0.1 mL含3 000 U/mL的肝素穿入髓腔，抽出骨髓血约2 mL；用平衡液洗涤2次后，离心沉淀用HAM F12-体积分数10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17 mol/L饱和NH₄Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，以800 r/min的转速离心5 min；弃去上清后，加入HAM F-12培养液，即可进行原代培养接种用。用体积分数0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液分离消化已贴壁的细胞，然后按照比例为1∶3进行骨髓间充质干细胞传代接种培养，隔日换液。

1.4.2 分组及干预 将兔骨髓间充质干细胞进行培养及传代后，取第3代细胞，计数完毕后以1×10⁷ L^-¹细胞浓度分别接种于6孔培养板中。将兔骨髓间充质干细胞分为3组，正常对照组未经任何处理正常培养；模型组使用不同浓度乙醇浓度进行培养，浓度分别为0.03，0.09，0.15，0.21 mol/L；转染组(0.21 mol/L乙醇+ZIP1 siRNA组)使用ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞后再用不同浓度乙醇进行培养，同模型组，每组在37 ℃的CO₂培养箱中进行培养，培养时间均为6 h，每组重复实验3次。

1.4.3 ZIP1 siRNA转染骨髓间充质干细胞 以5×10⁴/孔的密度将骨髓间充质干细胞接种在6孔板上，然后将其充分摇晃均匀，用含有PBS及青链霉素的完全培养基培养细胞。培养3 d观察细胞融合度达到体积分数40%后使用ZIP1 siRNA转染，按以下具体步骤进行转染：①将完全培养基吸弃，同时用PBS洗涤细胞2次，每孔加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM高糖培养基；②A管使用RNAase-free的去离子水溶解ZIP1 siRNA，直至浓度达到20 nmol/L，然后将其溶于500 μL opti-MEM中，充分摇匀后，在室温下放置5 min；③B管使用500 μL opti-MEM溶解5 μL Lipofectamine^TM RNAiMAX，充分混匀后室温下放置5 min；④将A管与B管轻轻摇匀，室温下放置20 min，从而形成复合物siRNA/Lipofectamine™RNAiMAX；⑤各孔中加入复合物siRNA/Lipofectamine™ RNAiMAX，培养过程中来回轻柔地摇晃培养板，在37 ℃的CO₂培养箱中温育细胞。⑥培养4-6 h后，将培养基吸弃，用PBS洗涤细胞2遍，在每孔中加入2 mL完全培养基；⑦转染后24 h，再次将完全培养基吸弃，各孔均加入Trizol共1 mL，用定量RT-PCR方法检测ZIP1基因表达的情况明确各组siRNA的干扰抑制效率。

1.4.4 ZIP1表达载体转染骨髓间充质干细胞 开始转染的前1 d对细胞株进行传代培养，使其汇合度达到70%- 80%后再进行转染，采用Lipofectamine 2000 (invitrogen，Cat.No. 11668019)转染试剂进行转染，并使用Opti-MEM(invitrogen，Cat.No.31985070)培养基进行培养。转染过程中使用24孔板，将1 μg的ZIP1表达重组质粒加入至各孔中，稀释到100 μL Opti-MEM培养基，将其标注为A液，然后将1 μL的Lipofectamine^TM 2000溶解在Opti-MEM培养基中并将其标注为B液，待充分混匀B液5 min后，再充分混合A液与B液，室温下静置20 min后再将其平铺至细胞培养板中；孵育4-6 h后将细胞生长培养基更换，并在36-48 h后开始进行收样和检测。

1.4.5 骨髓间充质干细胞成脂分化能力鉴定 对细胞株进行传代培养，使其汇合浓度达到90%后将兔骨髓间充质干细胞成脂诱导液加入，继续培养30 d后对其进行油红O染色，染色具体按以下步骤操作进行：①按0.5 g∶100 mL的比例将油红O干粉与异丙醇进行充分溶解摇匀，静置后避光保存；②使用油红O混合液的时候，取6 mL混合液并用4 mL超纯水对其进行稀释，然后将其静置8 min，用滤纸对稀释后的混合液进行过滤，除去杂质后放置备用；③取出兔骨髓间充质干细胞的培养皿，将培养基完全吸弃，在培养皿使用适量的多聚甲醛对细胞进行固定；④在培养皿中加入一开始配置好的油红O混合液，直至混合液将整个培养皿底板覆盖，室温下静置25 min；⑤用体积分数65%的异丙醇洗涤细胞2次，大概3 min，直至将油红O染料去除；⑥油红O染料去除干净后使用苏木精对其进行为时3 min的复染，最后使用PBS洗涤细胞2次后，使用显微镜对其进行观察。

1.4.6 ZIP1对正常骨髓间充质干细胞成脂分化的检测 以5×10⁴/孔的密度将骨髓间充质干细胞接种在6孔板上，然后将其充分摇晃均匀，用含有PBS及青链霉素的完全培养基培养细胞。

将骨髓间充质干细胞分为3组，分别为正常对照组、ZIP1表达组及ZIP1 siRNA组。其中正常对照组未进行任何处理常规培养，ZIP1表达组为使用ZIP1表达载体骨髓间充质干细胞后进行培养，ZIP1 siRNA组为使用ZIP1 siRNA序列转染骨髓间充质干细胞后进行培养，对每组均进行6 h的培养后用Western blot检测PPARγ、aP2蛋白。

1.4.7 三酰甘油水平检测 细胞进行培养6 h后，将培养基吸弃，用PBS将细胞洗涤2遍，然后用细胞收刮器将细胞收集，充分稀释采集的细胞并使其处于悬浮状态，当细胞浓度达到1×10⁹ L^-1的时候，在室温下以2 000 r/min的转速对其进行离心，时间为5 min，结束后吸弃上清液，将沉淀的细胞收集备用，将细胞放在细胞裂解液中让其充分裂解以释放出细胞内成分。最后在室温下以3 000 r/min的转速对其进行离心，时间为10 min，收集上清液。按三酰甘油试剂盒上的操作步骤测定TC的含量。实验过程中分空白管，标准管及测定管，其中空白管中仅使用300 μL工作液；标准管中在空白管基础上再加入3 μL校准品；测定管在空白管基础上加入上清液3 μL；将各管充分摇晃均匀，然后将其放入37 ℃水中5 min，在波长为546 nm的情况下进行比色，以空白管校零，用酶标仪对各管吸光度值进行读取，然后使用公式计算三酰甘油水平。

1.4.8 Western blot检测PPARγ及aP2蛋白的表达 用EP管收集细胞裂解液，BCA法对蛋白样品初步定量测定，经12% SDS-PA GE分离电泳后，用甲醇将PVDF膜预处理3-5 s后，然后用转印液将其浸润0.5 h，低温条件下，100 V恒压60-120 min转移至PVDF膜。取出杂交膜使用TBST漂洗5 min，反复3次，然后使用将膜放入脱脂牛奶溶液中，在室温下封闭1 h后，分别加入1∶1 000稀释的鼠抗兔PPARγ、aP2多克隆抗体(用TBST稀释)，在37 ℃恒温下孵育2 h，加入1∶1 000稀释的羊抗鼠 IgG稀释溶液，在37 ℃恒温下孵育1 h，漂洗5 min×3次，加入化学荧光底物，使其充分反应5 min，最后吸去杂交膜表面的底物溶液将其放于暗室中显影。

胶片使用扫描仪进行扫描，使用Quantity One软件对扫描后得到的图片进行分析，统计灰度值，目的样品的灰度值与内参样品的灰度值之比即为蛋白表达量，得到比值后再进行统计分析。

1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞生长状态及油红O染色成脂鉴定情况；PPARγ、aP2蛋白的相对表达量及三酰甘油水平。

1.6 统计学分析 计量资料均采用x(_)±s表示，采用SPSS 17.0统计学软件对多组间数据差异进行单因素方差分析检测，组间数据两两比较用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

股骨头缺血性坏死经常发生于中青年，是骨科临床上常见的一种致残性疾病,由于其发病机制尚未完全阐明，因此治疗比较困难^[13-15]，造成了患者的经济和精神痛苦，形成了一定的社会负担，所以阐明酒精性股骨头坏死的发病机制并早期给予针对性的治疗，从而减轻患者的经济负担就具有非常重要的临床意义。

已有大量实验证明乙醇是导致骨髓间充质干细胞成脂分化的重要诱因，用乙醇诱导培养骨髓间充质干细胞，可使细胞中的成脂基因的表达明显升高^[16-17]，实验也证实了乙醇能够促进骨髓间充质干细胞成脂分化能力。不同于以往的实验均在单一浓度下对乙醇诱导培养进行研究，实验通过在0.03，0.09，0.15及0.21 mol/L共4种不同乙醇浓度下进行诱导培养，结果表明，随着乙醇浓度的升高，骨髓间充质干细胞成脂分化能力加强。成脂分化过程中炎症细胞因子肿瘤坏死因子α的水平升高是比较常见的，特别是慢性疾病和骨骼肌肉系统疾病中，具有非常重要的病理学意义，酒精性股骨头坏死发生时，肿瘤坏死因子α信号成脂通路上调，成骨分化能力下降，骨吸收增加^[18-20]。PPARγ参与脂肪分化整个过程，PPARγ基因高表达还是受到抑制，直接影响成脂细胞的分化，与脂肪细胞和脂质的形成呈正相关性，Zhuang等^[21]研究表明上调PPAR-γ活性导致骨丢失，其中促进成脂分化，而下调的PPAR-γ活性导致骨量升高，抑制成脂分化。田健健等^[22]研究表明骨髓间充质干细胞成脂分化能力增强后，PPARγ蛋白表达量也会相应提高。PPARγ全程参与脂肪分化的过程，尤其在早期表现非常活跃，逐渐增高直至分化为成熟的脂肪细胞时其含量表达达到最高值。aP2是目前确定的主要在脂肪组织中表达的基因，在参与脂质代谢过程中主要表现在脂肪酸的摄取、转运及代谢调节，脂滴储存，影响其他信号通路转导，其中脂肪酸的结合及转运是aP2的基本功能，也是主要的功能^[23]。三酰甘油是脂肪中的主要成分，其含量变化是脂肪形成与减少的风向标。TC与PPAPγ、aP2两者之间有着非常密切的关系，PPARγ、aP2表达的高低与TC的形成呈正比例关系。Ertunc等^[24]研究结果表明aP2分泌增加时，脂肪分解增加，TC及脂肪细胞计数明显升高。吴洁等^[25]研究表明脂肪aP2沉默后能够抑制TC和内脂素的形成。实验结果同样表明乙醇能够增加骨髓间充质干细胞中aP2，PPARγ蛋白的表达量，研究结果同时表明随着乙醇浓度的增加aP2，PPARγ蛋白的表达也随之增加。

锌是骨骼生长发育的重要元素，近年来已逐渐得到认识。正常的锌营养可以促进骨骼的健康发育，而锌缺乏时，骨骼的生长会受到抑制，骨密度会降低^[26-27]。因此，锌离子代谢的稳态平衡对酒精性股骨头坏死后的治疗修复过程中关重要。研究表明ZIP1对锌离子的稳态平衡有着非常重要的作用，锌离子不能自由通过细胞内的膜结构，必须通过特定的转运蛋白和膜通道才可以在细胞内正常代谢^[28-31]。ZIP1能加速细胞外锌离子的内流从而激活与成骨分化相关的通路，加速骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化，但其是否抑制成脂有关的通路尚未明确。实验通过沉默ZIP1基因转染骨髓间充质干细胞后，aP2，PPARγ蛋白的表达量及三酰甘油水平均明显升高，而骨髓间充质干细胞经ZIP1表达载体转染后，aP2，PPARγ蛋白表达明显降低，与正常对照组比较差异有显著性意义，研究结果表明ZIP1表达载体能抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化能力，而沉默ZIP1则促进其成脂分化能力。

综上所述，乙醇能够促进骨髓间充质干细胞成脂分化能力，乙醇浓度增加，其成脂分化能力增强，ZIP1表达载体能抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化能力，而沉默ZIP1则促进其成脂分化能力。ZIP1还能通过抑制成脂通路，间接促进成骨分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

锌转运蛋白1 siRNA转染骨髓间充质干细胞对肿瘤坏死因子α信号成脂通路的影响

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transfected by Zrt/Irt-like protein 1 on adipogenic differentiation via tumor necrosis factor alpha signaling pathway

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