佐剂性关节炎模型兔成纤维样滑膜细胞的培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.012

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
佐剂性关节炎：是由T细胞介导的慢性、系统性免疫性炎症。关节破坏分为软组织肿胀、骨侵蚀和关节间隙改变3个方面，其临床表现的主要评价指标为关节肿胀数、足爪肿胀度、踝关节病理、足爪X射线摄片等。X射线法诊断观察炎症早期主要表现为关节软组织肿胀，致炎后14-16 d骨质破坏最为显著，软组织肿胀达到高峰，出现关节间隙增宽。
成纤维样滑膜细胞：是介导类风湿关节炎炎症发生的主要细胞，其特征性标记物有波形蛋白、尿二苷磷酸葡萄糖脱氢酶、促衰变因子、血管细胞黏附分子1等。体外原代培养成纤维样滑膜细胞的方法主要有3 种：酶消化法、组织块贴壁法和滑液分离培养法。

摘要
背景：目前研究者多采用酶消化法从类风湿性患者和佐剂性关节炎大鼠的滑膜组织中分离培养成纤维样滑膜细胞，采用组织块贴壁法体外培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞较少见。
目的：建立佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞的培养方法并观察细胞的生物学特性。
方法：采用多点多次注射佐剂的方法制备佐剂性关节炎兔动物模型，取膝关节滑膜组织，用组织块贴壁法分离培养成纤维样滑膜细胞，观察细胞形态特征。采用CCK-8法检测细胞增殖情况，并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达。
结果与结论：倒置显微镜观察原代培养的关节炎兔滑膜细胞形态均为长梭状纤维样，符合成纤维样滑膜细胞的生长特征，且表达波形蛋白的细胞达98%。说明采用组织块贴壁法成功分离培养了佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6793-7963(张宜)

关键词: 组织构建, 组织工程, 佐剂性关节炎, 兔, 成纤维样滑膜细胞, 组织块贴壁法

Abstract:

BACKGROUND: Currently, fibroblast-like synoviocytes from the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis or adjuvant arthritis rats are isolated and cultured mainly using enzyme digestion method, but tissue explant adherent method is rarely reported in primary culture.
OBJECTIVE: To establish a culture method of fibroblast-like synoviocytes from adjuvant arthritis rabbits and to investigate cell biological characteristics.
METHODS: Rabbit models of adjuvant arthritis were prepared by injected with adjuvant at multiple sites and times, the knee synovial tissues were obtained, and fibroblast-like synoviocytes were separated and cultured by the tissue explant adherent method. Furthermore, the cell morphology was observed. The cell proliferation was measured using cell counting kit-8 assay, and the expression of Vimentin was detected by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: The primary cultured rabbit synoviocytes were long spindle fiber-like and coincided with the fibroblast-like synoviocytes. Moreover, cells were positive for Vimentin. In conclusion, fibroblast-like synoviocytes from rabbits with adjuvant arthritis are successfully isolated and cultured by the tissue explant method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Arthritis, Experimental, Synovial Membrane, animals, Fibroblasts, Cell Culture Techniques, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计细胞形态学观察。

1.2 时间及地点于2016年3至9月在中国人民解放军武汉总医院医学实验科完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性新西兰兔12只，清洁级，体质量(2.0±0.5) kg，每笼1只进行分笼喂养，由武汉市万千佳禾实验动物养殖有限公司提供[SCXK(鄂)2011-0011]，实验在中国人民解放军武汉总医院医学实验科动物实验设施内进行[SYXK(鄂)2014-0082]，饲养间室温18-24 ℃，相对湿度40%-60%。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.3.2 主要试剂及仪器弗氏完全佐剂(Sigma)；DMEM高糖培养基、PBS(Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青链霉素双抗、胰酶、CCK-8(碧云天)；兔Vimentin抗体、荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)；倒置显微镜、倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯)；CO₂细胞培养箱(日本SANYO)；细胞计数器(香港基因生物医学科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 佐剂性关节炎模型的建立^[9-11] 12只新西兰兔随机分为正常组和模型组，适应性喂养1周后，用脱毛剂脱去背部肩胛骨间及双膝关节以下的毛，每只新西兰兔右跖部皮下注射弗氏完全佐剂0.4 mL，同时背部注射4点，每点 0.2 mL。注射后7 d加强注射弗氏完全佐剂1次，每只兔右跖部皮下注射弗氏完全佐剂0.4 mL，背部任意注射2点，每点0.2 mL^[9]。造模24 d后观察足趾肿胀情况，随机抓取1只关节炎模型兔拍摄X射线片，出现软组织肿胀，则鉴定为造模成功^[12-15]。

1.4.2 佐剂性关节炎兔滑膜组织细胞的分离培养^[16-18] 造模24 d后，将兔经耳缘静脉注射空气处死。用体积分数为75%乙醇浸湿膝关节，于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，找出关节囊，用手术止血钳配合手术刀片轻轻刮离关节囊的滑膜层和纤维层，取出平滑光亮的滑膜层组织，去除脂肪、纤维等，将滑膜组织放入EP管中，用含双抗的PBS洗3次，剪成1.0-2.0 mm²大小，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-H培养液充分漂洗至洗液清透后，用弯头吸管吸取数个组织小块均匀排列在培养瓶的底壁上，轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上，置37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养2 h，使其贴壁，取出培养瓶加入预温的含体积分数为20%胎牛血清的DMEM-H培养液，使液体刚刚覆盖组织块为宜，再置37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中继续培养，待细胞达到90%融合时，用含0.25% EDTA的胰酶进行1∶2传代，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长形态并照相。

1.4.3 佐剂性关节炎兔滑膜组织细胞波形蛋白的表达^[19-20]取第3代关节炎兔的成纤维样滑膜细胞，按1×10⁵/孔接种到含有爬片的6孔板中，培养48 h后吸弃培养液；将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；40 g/L多聚甲醛于4 ℃固定爬片30 min， PBS浸洗3次，每次3 min；用含 0.5% Triton X-100的PBS室温通透20 min；PBS浸洗爬片3次，每次3 min，用吸水纸吸干，在爬片上滴加正常的山羊血清进行室温封闭30 min；用吸水纸吸掉爬片上的封闭液，滴加兔Vimentin一抗(1∶100稀释)4 ℃孵育过夜；PBST浸洗爬片3次，每次3 min，用吸水纸吸干，滴加稀释好的荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG(1∶100稀释)，在湿盒中20-37 ℃孵育1 h，再用PBST洗3次，每次3 min；滴加 DAPI避光孵育5 min，进行染核，PBST浸洗爬片4次，每次5 min，洗去多余的DAPI。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封固液封固，最后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.4.4 关节炎兔滑膜组织细胞增殖的检测取第3代关节炎兔成纤维样滑膜细胞，使用细胞计数器计数，按1×10³/孔接种到96孔培养板内，每组设置5个复孔，分别于培养1，2，3，4，5，6，7 d随机取出1组，用CCK-8法检测细胞吸光度值^[21-22]，绘制细胞第1-7天的生长曲线。
1.5 主要观察指标 ①佐剂性关节炎兔动物模型的鉴定；②原代及传代佐剂性关节炎兔滑膜细胞生长形态的变化；③第3代佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞的波形蛋白表达及增殖情况。

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讨论

类风湿关节炎是一种慢性炎症性疾病，其临床特点是滑膜成纤维细胞增生和骨侵蚀^[23-24]。成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎发病的各个环节均发挥着重要的作用^[25-26]，对细胞外基质和软骨的侵蚀性是它的重要特征^[27-28]。正常情况下，滑膜细胞有2个细胞类型：A细胞(巨噬样细胞)和B细胞(成纤维样细胞)^[29-30]。由于巨噬样细胞不具有增殖能力，在体外仅可存活10 d，随着培养时间的延长，细胞渐渐衰老至失去活性^[31]。

目前，临床样本比较宝贵，多以佐剂性关节炎大鼠滑膜组织分离的成纤维滑膜细胞做为研究对象，但其模型存在关节部位小，取材困难，分离细胞量少等缺点。因此，实验采用新西兰兔作为佐剂性关节炎模型动物，分离培养成纤维样滑膜细胞。

3.1 佐剂性关节炎兔模型建立佐剂性关节炎，又称弗氏佐剂性关节炎，是由细菌学家Freund于20世纪50年代创立。弗氏佐剂中的结核杆菌热休克蛋白(HSP65)与动物关节软骨的自身抗原(HSP60)有高度相似的保守序列，实验动物通过皮下注射弗氏佐剂进行分子模拟和交叉反应，激活处于实验动物体内针对Ⅱ型胶原为主的静态淋巴细胞克隆，从而引起实验动物自身免疫反应^[32]，进而引发关节炎。目前佐剂性关节炎动物模型的建立方法尚没有统一的规范标准^[33-34]，实验采用多点多次于新西兰兔右跖部皮下和背部注射弗氏完全佐剂造模，模型组关节炎兔足趾部表现为急性外周关节炎，严重致跛行。X射线片观察关节炎兔软组织明显肿胀，关节面较毛糙，这些临床表现与类风湿关节炎相近，是筛选和研究治疗类风湿关节炎药物的较理想的动物模型。

3.2 佐剂性关节炎兔关节滑膜组织取材在原代培养过程中，关节滑膜组织的取材直接影响是否能培养出细胞。从解剖学角度上讲，关节滑膜是紧贴于关节囊纤维层内表面的一层膜性结构，附着于关节软骨的周缘，关节的血管穿过纤维层，在关节面周围的滑膜内形成丰富的血管网^[35]。据相关文献报道提取大鼠膝关节滑膜组织大都是切开皮肤暴露出髌骨，以髌骨为固定轴，用有齿镊提起髌骨上下进行分离^[36]，然而在实验中作者发现若将髌骨暴露，完全打开关节腔，则难以辨认关节囊内外层组织的解剖关系，致使分离关节滑膜组织困难，取材时可能混有较多的其他组织。因此，分离肌肉，稍稍露出膝盖骨，沿膝盖骨继续向下分离，找出关节囊，用手术止血钳配合手术刀片轻轻刮离关节囊的滑膜层和纤维层，取出平滑光亮的滑膜层组织，体外培养出兔成纤维样滑膜细胞。

3.3 佐剂性关节炎兔关节滑膜组织细胞的分离培养采用经典的组织块贴壁法进行体外培养成纤维样滑膜细胞，利用其贴壁生长、贴壁能力较强、增殖速度较快等特性，传至第3代时，形态逐渐单一纯化，多为长梭形且均匀分布。通过CCK-8法显示培养出的兔关节炎组织成纤维样滑膜细胞具有很强的增殖能力。免疫荧光检测结果显示，组织块贴壁法分离得到的关节炎兔滑膜组织细胞可以表达中胚层组织特征性波形蛋白，且阳性率达98%。结论：采用组织块贴壁法从佐剂性关节炎兔滑膜组织中分离培养成纤维样滑膜细胞，并且具有以下优点：①模型建立方法可重复性高。实验采用多点多次注射佐剂的方法建立模型，可重复性高，其临床表现与类风湿性关节炎相似；②解剖结构简单。新西兰兔较之大鼠的踝关节大，取材相对容易，滑膜组织更多，分离细胞多；③细胞培养方法易操作。

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