缺氧培养下M2型巨噬细胞上清液及杜仲总黄酮对成骨细胞生物行为学的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.003

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (12): 1819-1825.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.003

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缺氧培养下M2型巨噬细胞上清液及杜仲总黄酮对成骨细胞生物行为学的影响

张文博1，张贤2

1南京中医药大学，江苏省南京市 210023；2南京中医药大学无锡附属医院骨科，江苏省无锡市 214071

收稿日期:2017-02-23 出版日期:2017-04-28 发布日期:2017-05-16
通讯作者: 张贤，硕士，主任医师，南京中医药大学无锡附属医院骨科，江苏省无锡市 214071
作者简介:张文博，男，1989年生，河南省开封市人，汉族，南京中医药大学在读硕士，研究方向为中医骨伤科(脊柱病研究)。
基金资助:
江苏省“333”工程资助项目(BRA2012031)

Influence of M2 macrophage supernatant combined with Eucommia flavonoids on the biological behavior of osteoblasts under hypoxic conditions

Zhang Wen-bo, Zhang Xian

1Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopaedics, Wuxi Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Wuxi 214071, Jiangsu Province, China

Received:2017-02-23 Online:2017-04-28 Published:2017-05-16
Contact: Zhang Xian, Master, Chief physician, Department of Orthopaedics, Wuxi Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Wuxi 214071, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Wen-bo, Studying for master’s degree, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Supported by:
a grant from the “333” Program of Jiangsu Province, No. BRA2012031

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
M2型巨噬细胞：即替代活化巨噬细胞，由白细胞介素4、白细胞介素13诱导，可使甘露糖受体及转谷氨酰胺酶2表达上调。M2型巨噬细胞及其分泌因子可以促进组织修复，通过旁分泌功能作用于周围细胞，提高血管内皮细胞、成纤维细胞的生物活性，有助于组织再生和修复。
杜仲总黄酮：指杜仲提取物中黄酮类化合物总称，包括山奈酚、槲皮素、紫云英苷、陆地锦苷、芦丁等。杜仲总黄酮是中药材杜仲的主要有效成分。杜仲具有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任、固经安胎的功效。研究表明杜仲总黄酮可以调整局部物质代谢，调节免疫功能，促进细胞增殖。

摘要
背景：含成骨细胞成分的组织工程材料在骨科领域广泛应用，如何提高成骨细胞对缺氧条件的耐受能力，改善缺氧条件下成骨细胞的生物学行为，是组织工程的重要研究目标。
目的：探究M2型巨噬细胞上清液和杜仲总黄酮对缺氧环境培养下的成骨细胞生物学行为的影响，为组织工程研究提供基础。
方法：复苏MC3T3?E1细胞，分离、诱导及培养M2型巨噬细胞提取上清液，分别为空白对照组、M2型巨噬细胞上清液组、杜仲总黄酮组及M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组。空白对照组细胞不进行干预。M2型巨噬细胞上清液组、杜仲总黄酮组及M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组分别加入M2型巨噬细胞上清液和/或100 mg/L杜仲总黄酮。
结果与结论：M2型巨噬细胞上清液组、杜仲总黄酮组及M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组细胞活性明显高于对照组，且M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组S期和G2/M期细胞百分比显著高于对照组。M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组Runx2蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶相对mRNA水平、碱性磷酸酶相对活性以及矿化钙离子相对浓度均显著高于其他各组。提示M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮能够促进缺氧条件下成骨细胞的增殖和分化，维持成骨细胞正常矿化功能和成骨作用，提高成骨细胞对缺氧条件的耐受能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-3668-9295(张文博)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 缺氧, M2型巨噬细胞, 杜仲, 总黄酮, 成骨细胞, 细胞增殖, 成骨分化, 矿化作用

Abstract:

BACKGROUND: Tissue-engineered materials containing osteoblasts have been widely used in the treatment of orthopedic diseases. How to improve hypoxic tolerance and the biological behavior of osteoblasts under hypoxic conditions is an important goal of the research on tissue engineering.
OBJECTIVE: To explore the effect of M2 macrophage supernatant and Eucommia flavonoids on the biological behavior of osteoblasts under hypoxia to pave ways for tissue engineering.
METHODS: After MC3T3E1 cells were resuscitated, and M2 macrophages were isolated, induced and cultured, all cells were divided into control, M2 macrophage, Eucommia flavonoids and combination groups. The control group received no intervention. Cells in the M2 macrophage, Eucommia flavonoids and combination groups were exposed to M2 macrophages or/and 100 mg/L Eucommia flavonoids, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell viability in the M2 macrophage, Eucommia flavonoids and combination groups was significantly higher than that in the control group. The percentage of cells in the S and G2/M phases in the combination group was significantly higher than that in the control group. The relative mRNA expression levels of Runx2, collagen type I and alkaline phosphatase, alkaline phosphatase activity and relative concentration of calcium ions in the combination group were significantly higher than those in the other three groups. To conclude, M2 macrophage supernatant combined with Eucommia flavonoids can promote osteoblast proliferation and differentiation under hypoxic conditions, maintain normal mineralization and osteogenesis of osteoblasts, and improve the tolerance ability of osteoblasts to hypoxia.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Anoxia, Macrophages, Eucommiaceae, Flavones, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张文博，张贤 . 缺氧培养下M2型巨噬细胞上清液及杜仲总黄酮对成骨细胞生物行为学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(12): 1819-1825.

Zhang Wen-bo1, Zhang Xian2. Influence of M2 macrophage supernatant combined with Eucommia flavonoids on the biological behavior of osteoblasts under hypoxic conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(12): 1819-1825.

图/表（结果） 2

2.1 细胞增殖活性空白对照组细胞活性百分比为(100±5.2)%，M2型巨噬细胞上清液组细胞活性百分比为(121.3±9.2)%，杜仲总黄酮组细胞活性百分比为(123.7±7.4)%，M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组细胞活性百分比为(168.4±16.2)%，经方差分析，4组细胞增殖活性差异有显著性意义(P=0.000)。空白对照组细胞活性明显低于其他3组(P < 0.05)。

2.2 细胞形态空白对照组细胞形态异常，细胞骨架染色较弱，细胞质较少，细胞核出现固缩。M2型巨噬细胞上清液组和杜仲总黄酮组成骨细胞形态正常，大小均匀，细胞骨架形态均质性好，增殖状况良好。M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组细胞形态多形性较多，多数细胞具有伪足结构，细胞增殖旺盛，多数细胞内见大量分泌颗粒。细

胞骨架染色良好，细胞质饱满(图1)。

2.3 细胞周期流式细胞仪检测结果经卡方检验显示，4组细胞周期构成比差异有显著性意义(P < 0.05)。其中M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组S期和G2/M期细胞百分比显著高于空白对照组(P < 0.05；图2)。

2.4 成骨转录基因及蛋白表达水平 RT?PCR检测结果显示，72 h及第7天时，M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组Runx2蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶相对mRNA水平较空白对照组高(P < 0.05；图3)。

Western Blot结果与RT?PCR检测结果趋势较为一致。72 h时，M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组Runx2蛋白和I型胶原蛋白的表达水平较空白对照组高(P < 0.05)。第7天时各组Runx2蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶、骨钙蛋白表达水平，经方差检验，组间差异均具有显著性意义(P < 0.05)，其中Ⅳ组Runx2蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶表达水平显著高于其他3组，Ⅲ组各蛋白表达水平低于Ⅱ组(P < 0.05；图4)。

2.5 成骨效果细胞培养至第7天时，碱性磷酸酶染色结果显示，M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组碱性磷酸酶表达较好。经方差分析，4组细胞碱性磷酸酶活性差异有显著性意义(P=0.000)。细胞培养至14 d，茜素红染色提示4组矿化程度不同，钙结节为红棕色，空白对照组钙结节生成较少，M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组钙化程度最高，经方差分析，组间差异具有显著性意义(P < 0.05)，其中M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组矿化钙离子相对浓度显著高于其他组(图5，6)。

参考文献

[1] Cox SC, Thornby JA, Gibbons GJ, et al. 3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2015;47:237-247.

[2] Melinte P R, Dragoi G S, Croitoru R. Anatomic phenotyping of osseous progenitor cells. Implications in tissue engineering and bone remodeling. Rom J Leg Med. 2015;23(1):61-68.

[3] Venkatesan J, Bhatnagar I, Manivasagan P, et al. Alginate composites for bone tissue engineering: a review. Int J Biol Macromol. 2015;72:269-281.

[4] Farshid B, Lalwani G, Shir Mohammadi M, et al. Boron nitride nanotubes and nanoplatelets as reinforcing agents of polymeric matrices for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2017;105(2):406-419.

[5] de la Croix Ndong J, Stevens DM, Vignaux G, et al. Combined MEK inhibition and BMP2 treatment promotes osteoblast differentiation and bone healing in Nf1Osx -/- mice. J Bone Miner Res. 2015;30(1):55-63.

[6] Baik SW, Park BS, Kim YH, et al. Effects of Remifentanil Preconditioning on Osteoblasts under Hypoxia-Reoxygenation Condition. Int J Med Sci. 2015;12(7): 583-589.

[7] Dickson G, Buchanan F, Marsh D, et al. Orthopaedic tissue engineering and bone regeneration. Technol Health Care. 2007;15(1):57-67.

[8] Abdallah BM, Jafari A, Zaher W, et al. Skeletal (stromal) stem cells: an update on intracellular signaling pathways controlling osteoblast differentiation. Bone. 2015;70:28-36.

[9] Mills CD. Anatomy of a discovery: m1 and m2 macrophages. Front Immunol. 2015;6:212.

[10] Zhu D, Mackenzie NC, Shanahan CM, et al. BMP-9 regulates the osteoblastic differentiation and calcification of vascular smooth muscle cells through an ALK1 mediated pathway. J Cell Mol Med. 2015;19(1):165-174.

[11] Chang HY, Lee HN, Kim W, et al. Docosahexaenoic acid induces M2 macrophage polarization through peroxisome proliferator-activated receptor γ activation. Life Sci. 2015; 120:39-47.

[12] 李三华,陈全利,何志全,等.杜仲总黄酮对大鼠成骨细胞护骨素表达的影响[J].安徽农业科学,2011,39(25):15279-15280.

[13] 李三华,何志全,陈全利,等.杜仲总黄酮对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响[J].西北药学杂志,2011,26(4):272-274.

[14] Reiner, Neil E. Macrophages and Dendritic Cells. Humana Press, 2009.

[15] Lalwani G, Gopalan A, D'Agati M, et al. Porous three-dimensional carbon nanotube scaffolds for tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2015;103(10): 3212-3225.

[16] Liu Y, Chan JK, Teoh SH. Review of vascularised bone tissue-engineering strategies with a focus on co-culture systems. J Tissue Eng Regen Med. 2015;9(2):85-105.

[17] Lv H, Che T, Tang X, et al. Puerarin enhances proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells via a nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate signaling pathway. Mol Med Rep. 2015; 12(2):2283-2290.

[18] 赵光宗,方军,丁刚,等.拉喹莫德抑制成骨细胞中缺氧诱导因子2α的表达及其功能[J].中国组织工程研究,2016,20(7):917-924.

[19] Furukawa S, Moriyama M, Tanaka A, et al. Preferential M2 macrophages contribute to fibrosis in IgG4-related dacryoadenitis and sialoadenitis, so-called Mikulicz's disease. Clin Immunol. 2015;156(1):9-18.

[20] Brenner C, Franz WM, Kühlenthal S, et al. DPP-4 inhibition ameliorates atherosclerosis by priming monocytes into M2 macrophages. Int J Cardiol. 2015;199:163-169.

[21] Kambara K, Ohashi W, Tomita K, et al. In vivo depletion of CD206+ M2 macrophages exaggerates lung injury in endotoxemic mice. Am J Pathol. 2015;185(1):162-171.

[22] Satoh T, Takeuchi O, Vandenbon A, et al. The Jmjd3-Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection. Nat Immunol. 2010;11(10): 936-944.

[23] R?szer T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators Inflamm. 2015;2015:816460.

[24] Vi L, Baht GS, Whetstone H, et al. Macrophages promote osteoblastic differentiation in-vivo: implications in fracture repair and bone homeostasis. J Bone Miner Res. 2015; 30(6):1090-1102.

[25] 肖静,李三华,莫宁萍,等.杜仲总黄酮对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响[J].遵义医学院学报,2008,31(3):238-240.

[26] 杜鹏,肖润梅,陈勇.淫羊藿总黄酮、杜仲总黄酮对维甲酸所致小鼠骨质疏松的实验研究[J].湖北大学学报:自然科学版,2005, 27(4):392-394.

[27] Lin L, Qiu Q, Zhou N, et al. Dickkopf-1 is involved in BMP9-induced osteoblast differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells. BMB Rep. 2016;49(3):179-184.

[28] Kang IH, Jeong BC, Hur SW, et al. MicroRNA-302a stimulates osteoblastic differentiation by repressing COUP-TFII expression. J Cell Physiol. 2015;230(4):911-921.

[29] Huang Y, Zheng Y, Jia L, et al. Long Noncoding RNA H19 Promotes Osteoblast Differentiation Via TGF-β1/Smad3/HDAC Signaling Pathway by Deriving miR-675. Stem Cells. 2015;33(12):3481-3492.

[30] Kang IH, Jeong BC, Hur SW, et al. MicroRNA-302a stimulates osteoblastic differentiation by repressing COUP-TFII expression. J Cell Physiol. 2015;230(4):911-921.

[31] Sowmya S, Chennazhi KP, Arzate H, et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue Eng Part C Methods. 2015;21(10):1044-1058.

引言

材料方法

1.1 设计细胞水平随机对照研究。

1.2 时间及地点实验于2015至2016年在南京中医药大学基础实验室完成。

1.3 材料 C57BL/6小鼠4只，8-12周龄，体质量约25 g，雌雄各半，购自苏州汇欣诺安医药科技有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2013-0003。

MC3T3?E1 细胞购自美国ATCC公司。

杜仲总黄酮使用乙醇分段法从杜仲(购自北京同仁堂公司)原药中提取^[12]，有效浓度70%(由江苏省中药药效与安全性评价重点实验室鉴定)。

主要试剂及仪器：α?MEM培养基购自美国Corning公司；胎牛血清购自中国四季青生物工程材料有限公司；白细胞介素4、0.25%胰酶-EDTA、青链霉素双抗、抗坏血酸、β-磷酸甘油、茜素红试剂、FITC-鬼笔环肽、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、戊二醛购自美国Sigma公司；Western Blot试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒购自碧云天生物公司；AlamarBlue细胞活性检测试剂购自美国Molecular Probes公司；抗体均购于美国Santacruz公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；酶标仪购自美国Molecular Devices公司；低氧细胞培养罐购自广州尤德生物科技有限公司；细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司；FACS流式细胞仪、细胞匀浆机购自美国BD公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞准备取冻存的MC3T3?E1 细胞，37 ℃水浴1 min，解冻后用等量完全培养液(含体积分数5%胎牛血清、及1%青、链霉素双抗的α?MEM)稀释细胞悬浮液，室温离心3 min，转速 800 r/min。离心后弃上清，用10 mL完全培养液重悬后，接种至直径10 cm无菌培养皿内，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱培养。

按照Victor等^[14]的方法从小鼠骨髓组织中提取单核细胞诱导为M2型巨噬细胞，收集M2型巨噬细胞换液24 h时培养基上清液储存在-80 ℃备用。

1.4.2 细胞分组及干预将培养的MC3T3?E1 细胞分为4组：空白对照组、M2型巨噬细胞上清液组、杜仲总黄酮组及M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组。空白对照组：细胞不作任何干预；M2型巨噬细胞上清液组：将成骨培养基中α?MEM培养基全部替换为M2型巨噬细胞上清液；杜仲总黄酮组：培养基中加入100 mg/L杜仲总黄酮^[13]；M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组：将成骨培养基中α?MEM培养基全部替换为M2型巨噬细胞上清液后，加入100 mg/L杜仲总黄酮。所有组别细胞均在5%低氧细胞培养罐内培养72 h后，常规培养条件下(37 ℃、体积分数5%CO₂)进行检测。

1.4.3 细胞增殖活性检测细胞接种于Corning96孔细胞培养板，细胞浓度为5.0×10⁷L^-1，每孔100 µL，每组设6个重复孔。根据实验分组进行培养，72 h后移除细胞培养液，更换为100 µL完全培养液+10 µL AlamarBlue，培养箱避光孵育4 h，吸取100 µL反应后的液体于黑色Corning 96孔板内，酶标仪检测荧光强度。激发光波长为560 nm，发射光波长为600 nm。荧光强度越高，提示细胞活性越好。以空白对照组细胞荧光强度为100%标准，计算其余各组荧光强度与空白对照组百分比，表示相对细胞活性。

1.4.4 细胞形态学观察各组细胞缺氧培养后72 h后，置于光学显微镜下观察。移除细胞培养液，PBS清洗3次。2.5%戊二醛室温固定30 min。PBS清洗3次后，FITC-鬼笔环肽工作液室温避光孵育90 min。PBS清洗3次，DAPI工作液室温避光孵育10 min。在倒置荧光显微镜下观察，蓝色激发光下可见的绿色的细胞骨架结构，紫外激发光下可见的蓝色的细胞核。

1.4.5 细胞周期检测取细胞种植于培养瓶中，根据实验分组进行培养，72 h后移除细胞培养液，PBS重悬固定，用FACS流式细胞仪检测各组细胞周期的细胞数量构成比。

1.4.6 Western Blot检测分别检测各组细胞Runx2蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶的表达水平。根据实验分组进行培养72 h及7 d后收集细胞悬液，应用RIPA裂解液低温提取总蛋白，BCA法测定总蛋白量。经制胶、电泳、转膜、封闭后，一抗孵育过夜，二抗孵育，取出PVDF膜，化学发光法获得胶片后进行图像采集，目标带吸光度值采用Quantity One凝胶图像软件(美国Bio-Rad公司)分析，以目标条带吸光度值/β-actin条带吸光度值来分析蛋白表达水平。将所得数值以空白对照组数值为基准标准化。

1.4.7 实时定量PCR检测根据实验分组进行培养72 h及7 d后收集细胞悬液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度；进行RNA反转录，根据与β-actin mRNA测定值的比例，计算Runx2、碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原mRNA的相对浓度，将各组所得数值以空白对照组数值为基准标准化。引物序列如表1所示。

目的RNA	上游引物(5’-3’)	下游引物(5’-3’)
Runx2	TCA TTC AGT GAC ACC ACC AGG	TGT AGG GGC TAA AGG CAA AA
Ⅰ型胶原	GAC ATG TTC AGC TTT GTG G AC CTC	GGG ACC CTT AGG CCA TTG TGT A
碱性磷酸酶	GAG ATG GTA TGG GCG TCT C	GTT GGT GTT GTA CGT CTT GGA
骨钙素	GAC AAG TCC CAC ACA GCA ACT	GGA CAT GAA GGC TTT GTC AGA

表1 实时定量PCR使用的引物序列

Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.4.8 碱性磷酸酶染色将MC3T3?E1细胞以5×10⁷L^-1的细胞浓度种植于六孔板中，根据实验分组进行培养72 h后移入常规环境培养，每2 d更换一次培养基。培养至第7天时移除培养基，PBS冲洗后重悬细胞，使用细胞匀浆机溶解细胞，离心取上清，利用碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性，并按照总蛋白量将检测结果标准化。

1.4.9 茜素红染色将MC3T3?E1细胞以5×10⁷L^-1的细胞浓度种植于六孔板中根据实验分组进行培养72 h后移入常规环境培养，每2 d更换一次培养基。培养至第14天时移除培养基，PBS冲洗，体积分数4%的甲醛固定10 min。加入茜素红染液，37 ℃染色30 min。观察后使用PBS冲洗3遍，加入10%西吡氯铵，室温孵育1 h，在540 nm处检测上清液吸光度，与标准曲线对比测定钙离子浓度，并按照总蛋白量将检测结果标准化。

1.5 主要观察指标细胞增殖、形态、细胞周期比例及相关蛋白基因的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0(美国IBM公司)统计软件进行分析。计量资料以x(_)±s表示；计数资料比较采用卡方检验；多组计量资料比较时，先进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析，认为组间均数按检验水准有差异者，进一步用LSD进行均数多重比较。检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

作者通过对比不同干预措施对成骨细胞缺氧条件下生物学行为的影响，发现M2型巨噬细胞培养基上清液联合杜仲总黄酮可以有效提高成骨细胞对缺氧条件的耐受能力，在缺氧恶性环境中维持细胞增殖能力和正常细胞功能。

组织工程材料广泛应用于各学科领域，尤其在矫形外科、皮肤科及口腔科等学科应用居多。组织工程材料概念较为宽泛，从临床应用已久的人工纳米骨材料到还处于研究阶段的人造器官都可以成为组织工程材料^[15]。现代组织工程研究认为组织工程材料具备种子细胞、材料支架以及细胞因子等基本要素^[16]。间充质干细胞、脂肪干细胞、内皮细胞以及成骨细胞等是较为常见的种子细胞，在植入材料中定向分化增殖，形成所需组织成分。组织工程材料广泛应用于较为复杂的骨科疾病治疗中，如骨延迟愈合、骨坏死、感染性疾病中，既往研究提示包含细胞的组织工程材料在植入后，由于植入环境存在微生物、缺氧、缺血等较为恶劣复杂条件，未经特殊处理的种子细胞会在植入后1周内大量坏死、凋亡，导致植入失败^[16-17]。因此，如何提高种子细胞对复杂微环境的耐受能力，是组织工程研究急需解决的难题。实验以体外实验模拟体内缺氧环境，将成骨细胞在缺氧环境中干预培养3 d。体内试验研究表明组织缺氧缺血时，新生毛细血管长入时间为72 h左右^[18]。因此缺氧处理时间可以较好地模拟体内实际环境。在后续研究中将成骨细胞与血管内皮细胞共培养研究，进一步明确组织工程材料植入过程的具体机制。

实验结果提示M2型巨噬细胞培养基上清液具有一定的促增殖分化能力，可以维持成骨细胞的缺氧处理下的正常细胞功能。M2型巨噬细胞是巨噬细胞的一种极化形态^[19]，与常见的M1型巨噬细胞不同，其分泌炎性因子和吞噬能力较弱，但是可以大量分泌白细胞介素10、血管内皮细胞因子、转化生长因子β等细胞因子^[20]，具有促进细胞增殖、组织修复及血管生成等作用^[21]。肿瘤学研究提示巨噬细胞从M1型到M2型的被动转化可能是免疫逃逸的机制之一。M2型巨噬细胞在缺血缺氧组织周围分布密集，可以修复组织血供^[22]。M2型巨噬细胞培养基上清液中含有M2型巨噬细胞分泌的细胞因子以及外泌体等成分^[23]，可以作用成骨细胞相关受体及通路^[24]。在缺氧条件下，细胞内乏氧反应导致细胞能量供应下降，细胞增殖及成熟障碍，成骨相关蛋白合成下降。M2型巨噬细胞可以提高成骨细胞对缺氧的耐受能力，在细胞活性调控中起到非常关键的作用。

实验结果发现杜仲总黄酮可以提高缺氧条件下成骨细胞增殖能力，但是对于成骨细胞功能障碍无显著作用。杜仲总黄酮，作为传统中药杜仲的有效成分，可以改善细胞代谢、抗氧化应激及调节血管功能^[25]。杜仲可补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任，很多补骨方剂中含有杜仲^[26]。研究提示杜仲总黄酮可以促进成骨细胞增殖，但是不能提高成骨细胞分泌Ⅰ型胶原能力。与既往研究一致，实验结果提示杜仲总黄酮对于缺氧处理后的成骨细胞，不能提高后者分化能力及分泌碱性磷酸酶作用。

实验结果提示M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮可以有效地促进成骨细胞增殖，改善缺氧处理后成骨细胞的分化及细胞功能。Alamerblue染色结果提示M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组细胞增殖能力明显高于其他组，而空白对照组成骨细胞由于缺氧处理，导致细胞增殖能力显著下降。细胞骨架形态染色结果提示联合干预组成骨细胞形态良好，细胞骨架饱满，细胞质丰富，而在空白对照组细胞核质比增高，大部分细胞形态异常。M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮可以有效改善缺氧损伤后成骨细胞形态。

Western Blot及实时定量PCR结果提示联合干预组中成骨细胞转录分化基因Runx2以及骨钙素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶等基因和蛋白表达增高，提示联合干预可以改善成骨细胞分化能力。值得注意的是，杜仲总黄酮组成骨细胞分化基因和蛋白的表达量较低，与既往研究较为一致。成骨细胞定向分化受多种因素调控^[27-28]，通过不同信号通路共同作用形成分化事实。Runx2基因在成骨细胞基因转录分化过程中重要的标志基因^[29]。另外，成骨细胞的重要功能是分泌成骨基质，促进骨质形成^[30]。这一功能需要碱性磷酸酶，其活性增强是成骨细胞细胞功能正常的特征^[31]。实时定量PCR及碱性磷酸酶染色结果提示M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮组细胞碱性磷酸酶活性较高。茜素红钙结节染色结果直接提示该组细胞矿化程度较高，而空白对照组矿化率较低，该组细胞出现明显功能障碍。结果提示M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮在基因转录、蛋白表达和矿化率形成方面都具有促成骨作用，可以提高成骨细胞耐受能力。

实验存在以下不足：使用细胞来源于小鼠颅骨，与组织工程材料需要使用的人类细胞有所差别，但由于伦理学原因，上述实验未在人成骨细胞上开展，需要进一步研究证实结论；其次实验为体外实验，未能进行材料组合方面实验，在下步实验中将成骨细胞装载于高分子材料上，进一步验证上述干预措施的作用。

综上所述，M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮能够促进缺氧条件下成骨细胞的增殖和分化，维持成骨细胞正常矿化功能和成骨作用，提高成骨细胞对缺氧条件的耐受能力。M2型巨噬细胞上清液联合杜仲总黄酮培养成骨细胞有望发展成为组织材料工程的辅助手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

缺氧培养下M2型巨噬细胞上清液及杜仲总黄酮对成骨细胞生物行为学的影响

Influence of M2 macrophage supernatant combined with Eucommia flavonoids on the biological behavior of osteoblasts under hypoxic conditions

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[1]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[5]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[6]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[7]	胡维帆, 郑力, 李大地, 孙阳, 赵凤朝. 过表达miR-25通过 NFATc1信号通路调控钛颗粒诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 682-687.
[8]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[9]	莫伟彬, 黄天昌, 曾智伟, 燕林博. 葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 736-741.
[10]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[11]	杨斯迪, 王倩, 许诺, 王榕焓, 靳传奇, 陆颖, 董明. 上调骨形态发生蛋白2促进成骨细胞增殖分化的硅酸钙类材料Biodentine[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 516-520.
[12]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[13]	冯冬菲, 何洪旭, 谢琪, 张立立, 周惠, 李威. 牙周重建生物功能与调节通路关键基因的筛选[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 253-259.
[14]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.
[15]	吴赛璇, 张咪, 董明, 陆颖, 牛卫东. 骨稳态过程中Keap1/Nrf2/ARE信号通路的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 271-275.