海藻酸盐结合骨髓间充质干细胞修复脊柱结核模型的力学性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脊柱结核：其原发病为肺结核、消化道结核或淋巴结核等，经血循环途径造成骨与关节结核。脊柱结核占全身骨关节结核的首位，其中以椎体结核占大多数。在整个脊柱中，腰椎活动度最大，腰椎结核发生率也最高，胸椎次之，颈椎更次之，至于骶、尾椎结核则甚为罕见。
海藻酸钠：一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、黏性和安全性。1881年，英国化学家E.C.Stanford首先对褐色海藻中的海藻酸盐提取物进行科学研究，发现它具有浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力。

背景：外科手术是治疗脊柱结核的重要手段。但考虑脊柱位置的特殊性，承受机体应力及需拆除内固定所致二次损伤是外科治疗的局限所在。组织工程为各种疾病的治疗带来了新的思路和希望。理想生物材料代替传统内固定材料，具有明显无毒害及明显免疫排斥反应。
目的：探究海藻酸盐结合骨髓间充质干细胞修复脊柱结核的力学性能。
方法：将40只新西兰兔等分为对照组、脊柱结核组、海藻酸盐组与钛合金组。对照组不予以任何处理，其他组于L5近椎间盘处钻孔填充明胶海绵，注射结核菌混悬液0.1 mL(菌量5 g/L)，建立脊柱结核模型。2个月后，后2组模拟L _4-5脊柱结核切除，植入复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料和钛合金内固定材料。
结果与结论：钛合金组1只新西兰兔出现局部感染、红肿；海藻酸盐组未出现局部感染、红肿等不良反应。海藻酸盐组及钛合金组前屈、后伸及侧弯距离及最大轴向拔出力均优于脊柱结核组，均接近于对照组。结果说明复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后与机体生物相容性较好，且复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后脊柱稳定性与钛合金接近，具有良好的脊柱稳定性。

ORCID: 0000-0002-9648-944X(余华伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 海藻酸盐, 骨髓间充质干细胞, 脊柱结核, 损伤修复, 生物相容性, 力学性能

Abstract:

BACKGROUND: Although considerable progress has been made in spinal tuberculosis surgery, considering the particularity of the spine position, the surgical treatment is limited by the body stress and secondary injury due to removal of the internal fixation. Tissue engineering for the treatment of various diseases has brought new
ideas and hope. Ideal biomaterials instead of traditional internal fixation materials are characterized by non-toxic and non-immune rejections.
OBJECTIVE: To explore the biocompatibility and mechanical properties of alginate combined with bone marrow mesenchymal stem cells for repair of spinal tuberculosis.
METHODS: Forty New Zealand rabbits were divided into four groups, 10 rats in each group: control group, spinal tuberculosis group, alginate group and titanium alloy group. The control group received no treatment, and in the other groups, boreholes were drilled in the fifth lumbar intervertebral disc and filled with gelatin sponge, and Mycobacterium tuberculosis suspension 0.1 mL (the amount of bacteria, 5 g/L) was then injected to make spinal tuberculosis models. Two months after modeling, simulated L4-5 spinal tuberculosis surgery was performed in the latter two groups, and alginate combined with bone marrow mesenchymal stem cells and titanium alloy internal fixation material were implanted, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: One rabbit in the titanium alloy group had local infection and swelling. No rabbit in the alginate group had adverse reactions, such as swelling and local infection. Anteflexion, rear protraction, lateral bending distance and maximum axial pullout force in the alginate group and titanium alloy group were superior to those in the spinal tuberculosis group (P < 0.05), which were close to normal levels (P > 0.05). The above results showed that the alginate gel combined bone marrow mesenchymal stem cells has good biocompatibility with the body after implantation, and the post-implantation spinal stability is good and close to that after implantation of the titanium alloy.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tuberculosis, Spinal, Internal Fixators, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

余华伟，张戈. 海藻酸盐结合骨髓间充质干细胞修复脊柱结核模型的力学性能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1565-1570.

Yu Hua-wei, Zhang Ge. Alginate combined with bone marrow mesenchymal stem cells for repair of spinal tuberculosis: biocompatibility and mechanical properties[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1565-1570.

图/表（结果） 5

2.1 成功建立兔脊柱结核模型造模后2个月X射线片示新西兰兔椎体轻微骨质破坏，L₄_-₅椎体间隙消失，腰大肌不对称肿胀，肌肉内模糊的低密度区(图1A)。术后显露的椎体可见不同程度虫噬样改变(图1B)。组织学检测显示，坏死灶形成、含较多炎症细胞、淋巴细胞、类上皮样细胞聚集(图1C)。以上结果提示，已成功建立新西兰兔脊柱结核模型。

2.2 骨髓间充质干细胞的培养及鉴定结果光镜下示第3代骨髓间充质干细胞呈漩涡式生长，呈成纤维状生长(图2A)，流式细胞术检测CD29和CD90呈阳性表达，而CD45呈阴性表达(图3)。同时培养的细胞能够进行成脂、成骨及成软骨分化(图2B-D)。说明培养的细胞为骨髓间充质干细胞。

2.3 实验动物数量分析动物实验中所涉及全部新西兰兔均进入结果分析，无任何脱落。

2.4 生物相容性比较结果对照组未出现感染、红肿等不良反应；脊柱结核组10只新西兰兔出现局部感染、红肿等不良反应；钛合金组1只新西兰兔出现局部感染、红肿；海藻酸盐组未出现局部感染、红肿等不良反应。提示复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后与机体生物相容性较好。

2.5 生物力学结果

2.5.1 脊柱稳定性海藻酸盐组和钛合金组前屈、后伸及侧弯距离均显著低于脊柱结核组(P < 0.05)，均接近于对照组(P > 0.05；表1)。提示复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后脊柱稳定性与钛合金接近，具有良好的脊柱稳定性。

2.5.2 脊柱轴向拔出力海藻酸盐组及钛合金组最大轴向拔出力明显高于脊柱结核组(P < 0.01)，均接近于对照组(P > 0.05；图4)。说明复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后更加稳定。

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引言

脊柱结核占全身骨关节结核的首位，约占骨结核50%以上^[1-4]。根据病灶形态，脊柱结核可以分为中心形、边缘型及骨膜下型^[5-7]。随着病灶的发展可出现不同程度的畸形，极大程度上限制了患者的运动，并且病变的进展极大可能压迫相关神经，造成患者偏瘫^[6]。据统计因脊柱结核而引起的神经并发症约占20%以上^[7]。因此，针对脊柱结核的治疗具有重要的社会及医学意义。

目前，在抗痨药物的基础上，外科手术切除患处以彻底清除病灶并替代钛合金材料内固定是治疗脊柱结核的重要手段^[8-11]。脊柱结核治疗应用植骨、内固定材料的适应证为：①脊柱结核对椎体已造成非常严重的破坏，甚至导致椎体的塌陷，在行病灶清除后必须以植骨修复骨缺损以及恢复椎间高度者；②脊柱稳定性在病灶清除后有明显损害者；③脊柱后凸畸形需要矫正者。然而考虑脊柱位置的特殊性，承受机体应力及需拆除内固定所致二次损伤等问题，选择修复快速、损伤较少的生物材料是目前的研究热点。

近年来，组织工程的出现及不断发展为各种疾病的治疗带来了新的思路和希望，并取得了理想的效果。理想生物材料首先必须具备对机体无毒害作用及无明显免疫排斥反应^[12]，其次，植入后逐渐生物降解更是最佳选择^[13]。传统不锈钢材料存在组织生物相容性差、植入后材料与骨质膨胀系数不同，术后并发症较高的缺点。因此，寻找组织生物相容性较高的生物材料具有重要的价值。

目前组织工程最有希望的种子细胞即骨髓间充质干细胞，其来源丰富，取材方便，具有多向分化潜能及低免疫原性等特点，而且众多实验研究表明，骨髓间充质干细胞在体内外均具有较强的成骨活性^[14-16]。海藻酸盐是目前生物材料中一类研究较为热点的无机物^[16]，具有可塑性强、可降解、组织低排异度以及X射线透视不显影等优势^[17]。因此，实验选择海藻酸盐做为新型骨替代材料，结合新西兰兔骨髓间充质干细胞修复脊柱结核，对比分析钛合金与海藻酸盐材料修复新西兰兔脊柱结核在生物相容性与力学性能方面的差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年6月在泸州医学院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级雄性健康成年新西兰兔43只，兔龄50-60 d，体质量2-4 kg，购买于四川大学华西医学院动物实验中心，动物许可证号：SYXK(川)2016-039。所有实验均按照四川大学《关于善待实验动物条例》。

主要试剂和仪器：钛合金内固定材料购买于天津市华剑骨科器械有限公司，为Ti₆Al₄V钛合金。人型结核分枝杆菌H37Rv标准菌株获赠于四川大学华西医学院微生物实验室。α-MEM完全培养、0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；藻酸钠、无菌氯化钙溶液、青霉素、链霉素、20%乌拉坦、碱性磷酸酶染液购自碧云天公司；克氏针与医用明胶海绵均购买于上海浦东金环医疗用品有限公司；红霉素软膏购买于哈药集团制药总厂。倒置显微镜购自Olympus公司；万能试验机与电子拉力试验机购买于济南东特试验机厂；流式细胞仪购自美国Beckman Coulter 公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养取3只新西兰兔，耳缘静脉注射20%乌拉坦行全身麻醉，体积分数为75%乙醇消毒，无菌条件下取出双侧股骨、胫骨和肱骨，去除软组织，切除包括骺板在内的两侧骺端，用注射器抽取细胞完全培养液，反复冲洗骨髓腔，将骨髓液收集到无菌培养皿中，用玻璃吸管反复吹打混匀，培养于含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM完全培养基，置于相对湿度95%，温度37℃、体积分数为5%CO₂的恒温培养箱中，每2 d或3 d更换新鲜培养液，除去未贴壁细胞，待细胞融合80%-90%时进行传代培养。吸出旧培养液，PBS轻洗1次，加入胰酶消化，当细胞变圆并接近脱离瓶壁时，加入一定量的血清终止消化，用吸管轻缓反复吹打，使细胞充分脱壁，收集细胞悬液，离心、重悬和计数，此为第1代细胞，贴壁细胞传至第3代进行鉴定。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定流式细胞术检测间充质干细胞表面标志CD90、CD29、CD45的表达情况。

取第3代骨髓间充质干细胞，提前1 d以100%的细胞密度种植于6孔板中，次日更换成脂分化诱导体系，诱导分化14 d后，油红O染色检测成脂分化能力^[18]。

取第3代骨髓间充质干细胞，提前1 d以30%的细胞密度种植于6孔板中次日更换骨分化诱导体系，诱导分化20 d后，碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力^[18]。

取第3代骨髓间充质干细胞，提前1 d以100%的细胞密度种植于6孔板中，次日更换成软骨分化诱导体系，诱导分化20 d后，阿利新蓝染色检测成软骨分化能力^[18-19]。

1.4.3 海藻酸盐凝胶的制备及体外骨髓间充质干细胞复合体构建将海藻酸钠用生理盐水配置成12 g/L溶液，高温、高压消毒备用。将2 mL骨髓间充质干细胞悬液(1×10⁸个细胞)与海藻酸钠溶液混匀后慢慢滴入200 mmol/L氯化钙溶液，待成凝胶状后，轻柔塑形为椎间盘形状。

1.4.4 实验动物分组将另40只新西兰兔分为4组，对照组、脊柱结核组、海藻酸盐组与钛合金组，各10只。

1.4.5 新西兰兔脊柱结核模型的制备将人型结核分枝杆菌H37Rv标准菌株在罗氏培养基进行扩增两三周后取生长良好的菌落，分装于离心管，1 200 r/min离心20 min，用生理盐水配成菌悬液(5 g/L)备用。

新西兰兔耳缘静脉注射20%乌拉坦全身麻醉，常规消毒铺巾，经后方入路显露L_4-5椎体，使用克氏针于L₅椎体上部近椎间盘处由右前方向左后方，与椎体远端呈45°进入钻孔，进针深度约为0.5 cm，骨孔道止血后填入医用明胶海绵，在明胶海绵上用注射器缓慢浸注H37Rv结核菌悬液 0.1 mL。丝线间断关闭切口，涂抹红霉素软膏，无菌纱布覆盖切口。对照组骨孔内填塞为浸注0.1 mL生理盐水的明胶海绵。

1.4.6 材料植入造模2个月后，对海藻酸盐组与钛合金组新西兰兔耳缘静脉注射20%乌拉坦全身麻醉，常规消毒铺巾，经后方入路显露L_4，5椎体。以L₅椎体棘突为中心，做4.0-5.0 cm纵向切口，完全暴露L₄_-₆椎体，模拟L₄_-₅脊柱结核切除，切除L_4/5椎间盘，植入复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料和钛合金内固定材料。2种内固定材料均模拟正常椎间盘结构，尽量上下吻合。钛合金金属片直接放置在病灶，未做钢板螺钉固定上下2个椎体。生理盐水洗净伤口后逐层缝合，术后清洁级环境下单笼饲养。对照组和脊柱结核组不进行任何处理。所有感染脊柱结核的新西兰兔，均常规行抗结核治疗。治疗方案为2HRZS/7HRZ ，即：前2个月为强化阶段，联合应用异烟肼(H)、利福平(R)、吡嗪酰胺(Z)及链霉素(S)；后7个月为巩固阶段，联合应用异烟肼、利福平及吡嗪酰胺。

1.4.7 取材植入1个月后，处死新西兰兔，取完整L_4/5椎间盘，切除高度为2 cm，包括前柱、部位中柱、保留完整的椎弓根连接部位，以及完整的后纵韧带、棘间韧带、棘上韧带和椎间小关节。

1.4.8 生物相容性检测大体观察新西兰兔有无感染、红肿、免疫排斥反应。

1.4.9 生物力学测试

稳定性测试：采用偏心加载，模拟腰椎前屈、后伸及侧弯运动，最大载荷定为500 N，采用0-8 N•m连续加载，测试过程中喷洒生理盐水保持标本湿润状态，加载速度为 2 mm/min，每次加载前先进行预载(速度为2 mm/min，载荷100 N)，以消除标本的松弛、蠕变等时间效应的影响，然后开始正式测试。

轴向拔出实验：将标本前部用牙托粉包埋固定于特制的固定用夹具，确保不发生撬拨和位移，并安置在万能试验机上。测试前将拔出力的初始数据归零，以免产生正向及负向的初始力，以3 mm/min的速度拉伸椎间盘进行拔出试验，拉伸8 mm后即终止实验，通过计算机自带软件直接得出最大轴向拔出力。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的鉴定；②植入物的生物相容性；③修复脊柱的力学特性。

1.6 统计学分析数据使用Graph Pad 6.0软件进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

脊柱结核是骨结核中最常见的病变部位，其原发病为肺结核、消化道结核或淋巴结核等，经血循环途径造成骨与关节结核。基于该病发病机制较为复杂、临床早期早期症状较不明显，使得该病发病率逐年上升^[5-11]。药物筛选、疗效分析等基础研究均离不开结核杆菌的动物模型。兔对结核杆菌的敏感性与人类相当，且适合基本手术操作，是较好的动物模型，结核分枝杆菌H37Rv标准株有较高侵袭性和传染性，抗原性与临床上的结核病致病菌相近，可将其培养扩增，用于结核模型的致病微生物^[7]。采用在新西兰兔椎体直接种植结核杆菌致局部感染从而建立结核模型，2个月后X射线片示新西兰兔椎体轻微骨质破坏，L_4-5椎体间隙消失，腰大肌不对称肿胀，肌肉内模糊的低密度区^[20-24]。

目前大多数脊柱结核患者就诊时多以脊柱后凸及神经压迫等为主要临床症状。脊柱结核在化学药物治疗的基础上，实施病灶清除植骨内固定，可以显著提高脊柱结核的治愈率，降低其复发率^[25-31]。内固定器材越来越多地被应用于脊柱结核手术中，近期国外有学者报道，病椎切除后应用自体肋骨或髂骨填充钛网加内固定治疗脊柱结核，钛网在恢复和维持脊柱生物力线、维持脊柱稳定、减少术后植入骨的移位和增加融合率等方面有优势^[32-34]。Ha等^[35]研究表明，钛合金生物相容性好，结核杆菌对金属异物的亲和力小，并且产生的生物膜即小又薄，为结核病灶中使有内固定提供了理论基础。

可代谢吸收材料是指在体内可以在一定时间内分解或降解，并由体内代谢排出体外的一类材料，由于可吸收材料不必二次手术取出，同时又不会在人体内形成长期存在的异物，极大程度上可降低术后并发症发生及患者不适，所以得到许多研究人员的重视，近年来得到了迅猛发展。海藻酸是从褐藻中提取的一种酸性多糖，由古洛糖醛酸与甘露糖醛酸组成的嵌段聚合物，可与二价金属离子络合形成网状开放晶格的水凝胶，其酶解产物对人体无毒害作用，而且该水凝胶具有很好的亲水性，营养物质易于渗透扩散^[14-16]。由于其生物相容性良好和凝胶过程温和等特点，使之在生物工程、组织工程及医药领域得到了广泛的应用，目前已经开始应用于骨组织工程^[36-44]。较多的研究是将海藻酸钠水溶液与细胞混合，再加入Ca²⁺制备为凝胶后立即移植入体内^[45-47]。研究表明骨髓间充质干细胞在海藻酸支架上能够很好地黏附和扩增，海藻酸钠凝胶还能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，是良好的骨组织工程支架材料^[48-49]。海藻酸盐载体材料负载体外扩增诱导分化后的自体骨髓间充质干细胞移植于关节软骨损伤区， 6周后软骨损伤区域即由类似透明软骨样修复组织填充。修复组织内细胞形态类似于透明软骨细胞，细胞周围有软骨陷窝形成。

作者选择海藻酸盐做为新型骨替代材料，结合骨髓间充质干细胞修复脊柱结核，对比分析钛合金与海藻酸盐材料修复新西兰兔脊柱结核在生物相容性与力学性能方面的差异。结果显示，钛合金组1只新西兰兔出现局部感染、红肿，海藻酸盐组未出现局部感染、红肿等不良反应，提示复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后与机体生物相容性较好，而结核分枝杆菌对钛合金材料的低黏附性可能是临床脊柱结核内固定安全的隐患之一。进一步评价材料的生物力学性能结果显示，复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后脊柱稳定性和最大轴向拔出力与钛合金接近，具有良好的脊柱稳定性。从实验中可以得出，复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料在生物相容性、抗压强度、稳定性等方面均与钛合金相近，适用于脊柱结核修复。

综上所述，复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料具有良好的生物相容性，能够恢复和维持脊柱稳定性，具有较高的临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程