白细胞介素12基因修饰骨髓间充质干细胞对卵巢癌细胞生长的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
重组腺病毒：腺病毒是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平表达shRNA或目的蛋白。重组腺病毒是从由侵染色斑组成单位(pfu)中分离获得的。一个单色斑是线性载体质粒转染后在20 cm×15 cm板上由293A细胞连续侵染后被挑选和扩增形成。重组腺病毒可通过超速离心纯化，并测定滴度及进行PCR鉴定。
基因转染技术：是指通过物理或生物方法将目的基因导入到真核细胞的基因组中，使其调控靶细胞向特定的方向表达。常用的方法有非病毒方法和病毒载体方法，非病毒方法有微粒子轰击法、脂质体转染法、电穿孔法等，病毒方法有反转录病毒法、慢病毒法、腺病毒法及腺相关病毒法。

摘要

背景：骨髓间充质干细胞具有来源广泛、免疫原性低等优点，尤其易于导入和表达外源基因，作为抗肿瘤基因治疗的载体具有明显优越性。

目的：探讨骨髓间充质干细胞负载白细胞介素12重组腺病毒对卵巢癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。

方法：腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞，RT-PCR和Western Blotting测定骨髓间充质干细胞中白细胞介素12 mRNA和蛋白的表达，ELISA法测定细胞上清液中白细胞介素12水平。将SKOV3卵巢癌细胞与白细胞介素12重组腺病毒转染的骨髓间充质干细胞上清液共培养，对照组为SKOV3细胞与未转染骨髓间充质干细胞上清液共培养，MTT法测定SKOV3细胞增殖活性，流式细胞仪检测SKOV3细胞周期和细胞凋亡率。

结果与结论：①腺病毒介导白细胞介素12基因成功转染到骨髓间充质干细胞中，转染后细胞有白细胞介素12 mRNA和蛋白的表达，空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞未检测到白细胞介素12表达；②培养48 h，白细胞介素12组骨髓间充质干细胞上清液中白细胞介素12水平为(68.78±12.35) μg/L，空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞上清液中未检测到白细胞介素12；③白细胞介素12转染组骨髓间充质干细胞上清液对SKOV3细胞增殖有抑制作用，细胞增殖抑制率随时间的延长而增加(P < 0.05)。转染组SKOV3细胞G₁期细胞比例高于对照组(P < 0.05)，G₂期细胞比例低于对照组(P < 0.05)。转染组SKOV3细胞凋亡率高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，转染白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞能够表达白细胞介素12，其培养上清液能够抑制卵巢癌细胞增殖并诱导其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8398-3350(张霞)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 白细胞介素12, 基因转染, 骨髓间充质干细胞, 卵巢癌, 增殖, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are characterized by wide sources and low immunogenicity. Especially, these cells are easy to import and express foreign genes, and thus have obvious superiorities as anti-tumor gene therapy vectors.

OBJECTIVE: To investigate the effects of interleukin-12 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells on the proliferation, cell cycle and apoptosis of ovarian cancer cells.

METHODS: Interleukin-12 recombinant adenovirus vector was used to transfect bone marrow mesenchymal stem cells. Then, the expression of interleukin-12 mRNA and protien in transfected bone marrow mesenchymal stem cells was detected by RT-PCR and western blot assay, respectively. The level of interleukin-12 in cell supernatant was determined by ELISA. The SKOV3 cells were co-cultured with the supernatant of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with (transfection group) or without (control group) interleukin-12 recombinant adenovirus vector. The proliferation of SKOV3 cells was determined by MTT assay. Flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis of SKOV3 cells.

RESULTS AND CONCLUSION: RT-PCR and western blot results showed that interleukin-12 mRNA and protein were expressed in transfected bone marrow mesenchymal stem cells, but not found in empty vector group and blank control group. ELISA results showed that the content of interleukin-12 in the supernatant of bone marrow mesenchymal stem cells was (68.78±12.35) μg/L in the interleukin-12 transfection group after 48 hours culture, and no interleukin-12 expression was detected in the empty vector group and the blank control group. Interleukin-12-transfected bone marrow mesenchymal stem cells significantly inhibited the proliferation of SKOV3 cells, and the proliferation inhibition rate was increased with time (P < 0.05). The proportion of G₁-phased SKOV3 cells was higher in the transfection group than in the control group (P < 0.05), and the percentage of G₂-phased SKOV3 cells was lower in the transfection group than in the control group (P < 0.05). The apoptosis rate of SKOV3 cells in the transfection group was higher than that in the control group (P < 0.05). Our experimental findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells transfected with interleukin-12 recombinant adenovirus vector can express interleukin-12, inhibit the proliferation and induce apoptosis of ovarian cancer cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Ovarian Neoplasms, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Interleukin-12, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张霞，都治香，王娜，孟亚丽. 白细胞介素12基因修饰骨髓间充质干细胞对卵巢癌细胞生长的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1346-1351.

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图/表（结果） 2

2.1 重组腺病毒的获得 重组质粒转染293细胞后48 h可见细胞内有绿色荧光，荧光随时间延长而增多，光镜下可见细胞变圆、聚集、脱落，出现细胞病变，经过多轮感染后，重组病毒的效价达10¹² pfu/L，见图1。

2.2 各组骨髓间充质干细胞中白细胞介素12 mRNA的表达 RT-PCR结果显示：白细胞介素12组骨髓间充质干细胞在632 bp处出现阳性条带，符合白细胞介素12扩增片段长度，说明转染后骨髓间充质干细胞内白细胞介素12基因在mRNA水平获成功表达，而空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞中均未检测到白细胞介素12 mRNA表达，见图2。

2.3 各组骨髓间充质干细胞中白细胞介素12蛋白的表达 Western Blotting结果表明：白细胞介素12组骨髓间充质干细胞有清晰条带出现，说明转染后骨髓间充质干细胞中白细胞介素12基因在蛋白水平获成功表达，而空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞均未检测到白细胞介素12蛋白表达，见图3和表1。

2.4 各组骨髓间充质干细胞上清液中白细胞介素12水平 ELISA结果显示：培养48 h后，白细胞介素12组骨髓间充质干细胞上清液中白细胞介素12质量浓度为(68.78± 12.35) μg/L，空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞上清液中未检测到白细胞介素12表达。

2.5 白细胞介素12转染组骨髓间充质干细胞上清液对SKOV3细胞增殖的影响 白细胞介素12转染组骨髓间充质干细胞上清液对SKOV3细胞增殖有抑制作用，细胞增殖抑制率随时间的延长而增加，培养第2天和第3天SKOV3细胞增殖抑制率高于培养第1天(P < 0.05)，培养第3天细胞增殖抑制率高于培养第2天(P < 0.05)，见表2。

2.6 白细胞介素12转染组骨髓间充质干细胞上清液对SKOV3细胞周期的影响 转染组SKOV3细胞G₁期细胞比例高于对照组(P < 0.05)，G₂期细胞比例低于对照组(P < 0.05)，两组S期细胞比例比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.7 白细胞介素12转染组骨髓间充质干细胞上清液对SKOV3细胞凋亡的影响 转染组SKOV3细胞凋亡率高于对照组[(8.98±1.21)%，(2.32±0.64)%，P < 0.05]。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2015年9月至2016年9月在河北医科大学实验室完成。

1.3 材料 人骨髓间充质干细胞、人胚胎肾上皮293细胞和人卵巢癌细胞株SKOV3细胞(上海拜力生物科技有限公司)；白细胞介素12重组腺病毒载体(上海复百澳生物科技有限公司)；RPMI 1640培养液、DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、兔抗鼠单克隆抗体(美国Sigma公司)；MTT、RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、白细胞介素12检测试剂盒(美国Gibco-bal公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞培养 将人骨髓间充质干细胞接种到含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，3 d后进行首次换液，以后每2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长情况，细胞培养至85%以上融合时加入胰蛋白酶进行消化，当细胞变圆时终止消化，离心，弃去上清液，加入培养液制成细胞悬液，进行传代培养。

1.4.2 人胚胎肾上皮293细胞的培养 将293细胞接种到DMEM培养液中培养，显微镜下观察细胞的生长情况，细胞达90%以上融合时加入胰蛋白酶消化，30 s后加入DMEM培养液终止消化并重悬细胞，进行传代培养。

1.4.3 人卵巢癌细胞株SKOV3细胞培养 将SKOV3细胞接种到RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至85%以上融合时加入胰蛋白酶进行消化，细胞聚集，收缩成球形时加入RPMI 1640培养液终止消化，用吸管吹打细胞，离心后稀释4倍，接种到培养瓶中培养，每2 d换液1次，细胞铺满瓶底时进行传代培养。

1.4.4 细胞冻存 将人骨髓间充质干细胞、293细胞和SKOV3细胞消化，吹匀，移入离心管离心5 min，弃去上清液，加入冻存液(二甲基亚砜︰胎牛血清︰1640培养基= 1︰2︰7的比例)吹匀，移入冻存管，在-4 ℃放置30 min，-20 ℃放置2 h，-80 ℃放置过夜，-160 ℃保存。

1.4.5 细胞复苏 将冻存的人骨髓间充质干细胞、293细胞和SKOV3细胞取出，放入37℃水浴中摇匀溶解，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入培养液吹匀，移入培养瓶培养。

1.4.6 转染扩增重组腺病毒 将293细胞原代培养至90%以上融合时进行传代培养，培养至3代后将细胞分散到12个培养瓶中，细胞生长至80%以上融合时加入扩增的病毒混合液，在荧光显微镜下观察绿色荧光表达，3 d后贴壁细胞变圆，细胞核浓缩和脱落，细胞内出现病毒空斑，将细胞吹打后移入离心管中离心10 min，弃去上清液，加入DMEM培养液重悬细胞，将重悬细胞移到Eppendorff管中，不断扩增至需要的病毒量，然后从-20 ℃→37 ℃冻融3次，离心10 min，取上清液，-160 ℃冻存备用。

1.4.7 骨髓间充质干细胞分组 将骨髓间充质干细胞分为白细胞介素12组、空病毒载体组、空白对照组。将骨髓间充质干细胞传代培养至第5代，细胞生长至75%融合，用白细胞介素12重组腺病毒载体和空病毒载体转染，设感染倍数(MOI)为100，转染24 h后加入含体积分数为10%新生牛血清的培养液继续培养，收集感染后的骨髓间充质干细胞为白细胞介素12组和空病毒载体组。空白对照组不进行病毒转染。

1.4.8 RT-PCR测定骨髓间充质干细胞中白细胞介素12 mRNA的表达 提取白细胞介素12组、空病毒载体组、空白对照组细胞的总RNA，测定260 nm和280 nm处的吸光度值确定各组RNA的纯度，琼脂糖凝胶电泳确定各组细胞RNA的完整性，反转录合成cDNA，PCR进行扩增，β-actin为内参照，扩增条件为94 ℃预变性3 min，96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃45 s，共30个循环，72 ℃延伸10 min。将各组RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。引物序列：白细胞介素12：forward，CCC TTG CCC TCC TAA ACC A；reverse，CTA AGA CAC CTG GCA GGT CCA；β-Actin：forward，GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA；reverse，CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC。

1.4.9 Western Blotting测定骨髓间充质干细胞中白细胞介素12蛋白的表达 收集白细胞介素12组、空病毒载体组、空白对照组细胞，将细胞在裂解缓冲液中匀浆1 min，离心后取上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转印至硝酸纤维素膜上，转印后用封闭液封闭，加入一抗过夜孵育，加入二抗孵育2 h，UVP分析仪对结果进行扫描分析，生成灰度值。

1.4.10 各组细胞上清液中白细胞介素12水平 白细胞介素12组、空病毒载体组、空白对照组细胞培养48 h后，收集上清液，采用ELISA法测定上清液中白细胞介素12水平，具体操作步骤按照ELISA说明书进行。

1.4.11 SKOV3细胞分组 将SKOV3细胞分为转染组和对照组，转染组SKOV3细胞接种到转染白细胞介素12重组腺病毒载体24 h后的骨髓间充质干细胞上清液中培养，对照组SKOV3细胞接种到培养24 h后的骨髓间充质干细胞上清液中培养。

1.4.12 MTT法测定SKOV3细胞增殖能力 将对数生长期的转染组和对照组细胞接种到96孔板中，每组设5个复孔，加入培养液悬浮细胞，每天观察细胞的生长情况，培养3 d后加入MTT溶液孵育4 h，离心弃上清液，加入二甲基亚砜振荡，酶联免疫检测仪上测定波长490 nm处吸光度值，计算SKOV3细胞增殖抑制率。增殖抑制率=(对照组吸光度值-转染组吸光度值)/对照组吸光度值。

1.4.13 采用流式细胞仪检测SKOV3细胞周期和凋亡率 培养72 h，将两组细胞用胰蛋白酶消化，加入预冷乙醇固定，加入PBS离心，取细胞悬液加入碘化丙啶染色，流式细胞仪测定两组细胞的细胞周期和凋亡情况。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞中白细胞介素12 mRNA和蛋白的表达；②ELISA法测定细胞上清液中白细胞介素12水平；③MTT法测定SKOV3细胞增殖活性；④流式细胞仪检测SKOV3细胞周期和细胞凋亡率。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行分析，多组均数比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着生物治疗技术的不断发展，卵巢癌患者的生物治疗也逐渐受到重视，卵巢癌的生物治疗成为放化疗和手术治疗的有力补充^[16-17]。白细胞介素12是有效的抗肿瘤细胞因子之一，具有抗免疫作用^[18-22]，包括白细胞介素12能够激活NK细胞，增强巨噬细胞、NK细胞的细胞毒活性，产生具有抗肿瘤效应的INF-γ，白细胞介素12通过INF-γ发挥抗肿瘤作用；在体内，白细胞介素12对血管生成有抑制作用，对肿瘤生长也有抑制作用；白细胞介素12能够诱导Th0细胞向Th1细胞分化，促进Th1细胞增殖并分泌白细胞介素12和INF-γ等细胞因子，通过对T细胞介导的细胞免疫进行调节发挥抗肿瘤作用^[23-24]。直接应用白细胞介素12毒副作用比较大，有研究发现可以利用白细胞介素12重组载体进行基因治疗。赵雯红等^[25]研究发现白细胞介素12修饰的人脐带间充质干细胞能够在蛋白及mRNA水平表达白细胞介素12基因，抑制SKOV3细胞增殖，抑制SKOV3移植瘤生长和血管生成，与化疗药物联用抑瘤作用增强。选择有效的基因载体是基因治疗成功的关键。王久香等^[26]进行的ELISA实验结果显示，经白细胞介素12基因转染的脐带间充质干细胞可稳定表达持续高水平的白细胞介素12；Transwell实验结果显示，与转染了LV-IL-12-GFP的脐带间充质干细胞共培养的胃腺癌细胞SGC-7901的侵袭能力明显下降(P < 0.05)，凋亡率明显增加(P < 0.05)；Cylinder柱实验结果显示，转染了LV-IL-12-GFP的脐带间充质干细胞向胃腺癌细胞SGC-7901的定向迁移能力明显下降(P < 0.05)。说明转染白细胞介素12基因的脐带间充质干细胞能够发挥肿瘤治疗作用。间充质干细胞在临床中被用于多种疾病的治疗。骨髓间充质干细胞是研究最多的干细胞，在细胞移植、基因治疗、组织工程方面发展迅速^[27-32]，是基因治疗的新型载体^[33-35]。白东等^[36]研究发现人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以抑制肝细胞的凋亡，并促进其增殖，具有改善肝细胞功能的作用；宋燕峰等^[37]研究发现碱性成纤维细胞生长因子转染的骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压能够保护血管内皮细胞，改善血流动力学水平，拮抗血管收缩。研究发现白细胞介素12能够成功转染骨髓间充质干细胞，白细胞介素12修饰的间充质干细胞在多种疾病的诊治中有一定作用^[38-42]。实验应用白细胞介素12重组腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞，结果发现，转染后的骨髓间充质干细胞能够在蛋白及mRNA水平表达白细胞介素12基因，空病毒载体组和空白对照组骨髓间充质干细胞未检测到白细胞介素12表达。

应用白细胞介素12重组腺病毒载体转染24 h后的骨髓间充质干细胞上清液培养SKOV3细胞，培养第2天和第3天SKOV3卵巢癌细胞增殖抑制率高于培养第1天，培养第3天细胞增殖抑制率高于培养第2天。转染组SKOV3细胞G₁期细胞比例升高，G₂期细胞比例降低。转染组SKOV3细胞凋亡率高于对照组。以上结果说明白细胞介素12重组腺病毒载体转染的骨髓间充质干细胞上清液能够抑制SKOV3卵巢癌细胞增殖，促进SKOV3卵巢癌细胞凋亡。该细胞系可应用于基因治疗肿瘤方面的研究，为卵巢癌的基因治疗提供了新的靶向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程