骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.005

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (9): 1334-1339.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.005

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骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力

周航宇，夏德林，甘生远，邵学磊

西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000

出版日期:2017-03-28 发布日期:2017-03-31
通讯作者: 夏德林，博士，教授，西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000
作者简介:周航宇，男，1984 年生，四川省泸县人，汉族，2011年泸州医学院附属口腔医院毕业，硕士，医师，主要从事口腔颌面外科肿瘤缺损修复的研究。
基金资助:
四川省科技厅应用基础研究资助项目(2008jy0014)

Ectopic osteogenesis of bone marrow stromal stem cells under bone morphogenetic protein 2/vascular endothelial growth factor 165 co-transfections

Zhou Hang-yu, Xia De-lin, Gan Sheng-yuan, Shao Xue-lei

Department of Oral and Maxllofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Online:2017-03-28 Published:2017-03-31
Contact: Xia De-lin, M.D., Professor, Department of Oral and Maxllofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Zhou Hang-yu, Master, Physician, Department of Oral and Maxllofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Applied Basic Research Fund of Sichuan Provincial Science and Technology Department, No. 2008jy0014

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165：骨形态发生蛋白2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一，已经用于体内诱导骨形成，有很好的临床应用前景。血管内皮生长因子是已知诱导血管再生作用最强的生长因子。血管内皮生长因子家族包括VEGF-A、B、C、D和胎盘形成因子，其中血管内皮生长因子A是研究较集中的因子，具有4种异构体，分别由121、165、189、206个氨基酸组成，血管内皮生长因子121含量最多，血管内皮生长因子165活性最强。
阳离子脂质体转染法：脂质体是磷脂分散在水中时形成双分子层，又称人工生物膜，可作为外源物质进入细胞，脂质体介导转染简便易行，成本适中，具有较高的转染率和较小的细胞毒性。

背景：应用骨形态发生蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)双基因转染骨髓基质干细胞诱导成骨，为组织工程骨的研究提供实验基础。

目的：探讨BMP2和VEGF165双基因转染大鼠骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力。

方法：4周龄SD大鼠4只，取股骨、胫骨骨髓，采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞，取第3代骨髓基质干细胞分为5组，分别为未转染组、空载质粒组、BMP2单基因转染组、VEGF165单基因转染组、BMP2和VEGF165双基因共转染组，转染后48 h通过Western Blot检测BMP2和VEGF165蛋白表达变化，转染后7d检测各组细胞的碱性磷酸酶活性。

结果与结论：①BMP2和VEGF165双基因共转染组和BMP2单基因转染组中有大量的BMP2分泌。BMP2和VEGF165双基因共转染组和VEGF165单基因转染组中有大量的VEGF165分泌。双基因共转染组中BMP2和VEGF165蛋白水平与单基因转染组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；②BMP2和VEGF165双基因共转染组中碱性磷酸酶活性最高，其次是BMP2单基因转染组，而VEGF165单基因转染组明显不如前两组，但是略高于空质粒转染组和未转染组。统计分析表明双基因共转染组与单基因转染组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，BMP2和VEGF165双基因转染促进骨髓基质干细胞异位成骨的能力更强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5861-6903(周航宇)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓基质干细胞, 双基因修饰, BMP2, VEGF165, 诱导成骨, 碱性磷酸酶, 脂质体

Abstract:

BACKGROUND: Double gene transfection using bone morphogenetic protein 2 (BMP2) and vascular endothelial growth factor 165 (VEGF165) for bone marrow stromal stem cells (BMSCs) to induce osteogenesis provides experimental basis for the study on tissue engineering bone.

OBJECTIVE: To investigate the ability of BMP2 and VEGF165 double gene modified rat BMSCs to induce osteogenesis.

METHODS: BMSCs were isolated from the femur and tibia of four 4-week-old Sprague-Dawley rats by whole bone marrow adherent culture. Passage 3 BMSCs were randomized into five groups: non-transfection group, empty plasmid group, BMP2 transfection group, VEGF165 transfection group, BMP2 and BMP2/VEGF165 transfection group (co-transfection group). Then, western blot assay was used to detect expression of BMP2 and VEGF165 at 48 hours after transfection, and the activity of alkaline phosphatase was detected in each group at 7 days after transfection.

RESULTS AND CONCLUSION: Highly expressed BMP2 in BMP2 and co-transfection groups and highly expressed VEGF165 in VEGF165 and co-transfection groups were found after transfection. The expression of BMP2 or VEGF165 in the co-transfection group was significantly higher than that in the BMP2 or VEGF165 transfection group after transfection, respectively (P < 0.05). Western blot results showed that the activity of alkaline phosphatase was ranked as: co-transfection group > BMP2 transfection group > VEGF165 transfection group > empty plasmid group and non-transfection group. There was a significant difference in the activity of alkaline phosphatase between co-transfection group and any of single gene transfection groups (P < 0.05). To conclude, BMP2/VEGF165 co-transfection promotes the ectopic osteogenesis of BMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Bone Marrow, Bone Morphogenetic Proteins, Vascular Endothelial Growth Factors, Alkaline Phosphatase, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

周航宇，夏德林，甘生远，邵学磊. 骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1334-1339.

Zhou Hang-yu, Xia De-lin, Gan Sheng-yuan, Shao Xue-lei. Ectopic osteogenesis of bone marrow stromal stem cells under bone morphogenetic protein 2/vascular endothelial growth factor 165 co-transfections[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1334-1339.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓基质干细胞形态 原代培养第4天就可以观察到细胞附壁，呈梭形，数量较多，局部呈多个散在分布的细胞集落(图1A)。第4-6天开始形成典型的均匀分布的簇状增殖灶，细胞数量增多，细胞呈长梭形，细胞紧密排列。第6天后细胞数量迅速扩增，细胞簇状增生灶数量增加，范围扩大。第7-9天细胞生长即可以达80%-90%融合，呈长梭形，紧密排列类似漩涡状。

传代细胞接种4 h后开始附壁铺伸，12 h活细胞基本完成贴壁，第3天迅速增殖，第7天即可达到80%-90%融合，呈现比原代更均匀的长梭形(图1B)。经成骨诱导7 d后，细胞逐渐汇合，呈现铺路石状。随着诱导时间的延长，局部细胞呈重叠生长，间充质逐渐堆积，间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14 d后，可见褐色点状矿化结节中心。

组间差异：未转染组、空载质粒组、VEGF165单基因转染组，在培养期间一直观察不到成骨细胞特征(图1C，D)。BMP2单基因转染组、BMP2和VEGF165双基因共转染组，均能观察到骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，且BMP2和VEGF165双基因共同转染组(图1F)的骨髓基质干细胞分化速度和强度均大于BMP2单基因转染组(图1E)。

2.2 Western Blot检测细胞中BMP2和VEGF165的表达 在BMP2和VEGF165双基因共转染组和BMP2单基因转染组中有大量的BMP2分泌位于上清中，见图2。在未转染组、VEGF165单基因转染组和空载质粒组中则只有很少。在BMP2和VEGF165双基因共转染组和VEGF165单基因转染组中有大量的VEGF165分泌于上清中，在未转染组、BMP2单基因转染组和空载质粒组中VEGF165分泌量很少。统计结果显示双基因共转染组和单基因转染组差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 各组细胞碱性磷酸酶活性 转染后7 d，收集细胞进行碱性磷酸酶活性检测。结果显示，在BMP2和VEGF165双基因共转染组中碱性磷酸酶活性最高，其次是BMP2单基因转染组，而VEGF165单基因转染组明显不如前两组，但是略高于空载质粒组和未转染组。统计分析表明双基因共转染组和单基因转染组差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2010年12月至2012年7月在西南医科大学附属口腔医院口颌面修复重建和再生实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4只SD大鼠，4周龄，雄性，平均体质量98 g，由西南医科大学动物房提供。

1.3.2 试剂和仪器 低糖DMEM培养基、胎牛血清(赛默飞世尔生物化学有限公司)；胰蛋白酶、二甲基亚砜(美国Sigma公司)；多聚赖氨酸(武汉博士德有限公司)；青霉素-链霉素溶液、Hank’s液(碧云天生物科技有限公司)；LIPOSOME试剂盒、RT-PCR试剂盒(长沙赢润生物有限公司)；PVDF膜(Milipore)；显影底物(Thermo)；碱性磷酸酶试剂盒(上海荣盛生物有限公司)。质粒构建由长沙赢润生物有限公司协助完成。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓基质干细胞的培养及转染 取4周龄SD大鼠颈椎脱臼处死，置于体积分数为75%乙醇缸中浸泡10 min消毒。取大鼠股骨、胫骨，用加入1 mL肝素的10 mL注射器反复抽吸骨髓腔，至骨质变白。用滴管混匀冲出的液体，移至离心管，将3 mL左右培养液加入离心管中，1 500 r/min离心5 min。取一次性培养皿加入10 mL培养液。吸去离心管中上清液，打匀剩下细胞，移至培养皿中，摇匀，放入培养箱。培养四五天后观察细胞没有污染而且形成较小的干细胞克隆，进行首次换液，以后每三四天换液1次，细胞80%长满时用胰蛋白酶消化法传代，培养至第3代。实验分为未转染组、空载质粒组、BMP2单基因转染组、VEGF165单基因转染组、BMP2和VEGF165双基因共转染组，将阳离子脂质体介导携带BMP2和VEGF165基因重组pYr-adshuttle-4质粒转染至第3代大鼠骨髓基质干细胞。

1.4.2 Western blot检测 细胞转染48 h后，将收集的细胞以2 000 r/min离心10 min，弃去大部分上清吹散重悬混匀。各取20 μL样品，加入10 μL 3×loading Buffer，混匀，沸水浴10 min，15 000 r/min离心5 min。取各组约1×10⁶个细胞用RIPA裂解，提取蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳，加入5%脱脂奶粉，加入适度的一抗，4 ℃封闭过夜，加入相应二抗，室温孵育1 h，1×TBST洗膜5 min×4次，将PVDF膜置于SuperSignal化学发光试剂中反应2 min，暗室中使X射线片曝光，常规方法显影定影。

1.4.3 碱性磷酸酶活性检测 细胞转染后第7天采用磷酸对硝基苯酯二钠盐比色法测定细胞内碱性磷酸酶的活性，每组重复3次。

1.5 主要观察指标 ①骨髓基质干细胞形态；②各组细胞中BMP2和VEGF165的表达；③各组细胞碱性磷酸酶活性。

1.6 统计学分析 所有参数均用x(_)±s表示，采用SPSS 14.0统计分析软件包分析，对各组数据比较进行成组设计的F 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 骨髓基质干细胞的培养方法骨髓基质干细胞的分离、纯化、培养方法目前主要以全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法为主。密度梯度离心法由于清除红细胞干净，视野清晰，便于动态观察细胞生长的变化。但由于骨髓中有核细胞种类很多，细胞密度各不相同，进行梯度离心时，梯度液的量、离心速度和时间以及骨髓的需要量等均不易把握恰当，很容易丢失，并且增加了污染的机会。全骨髓贴壁培养法是根据骨髓基质干细胞贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行分离，通过换液分离纯化骨髓基质干细胞，具有操作简便、快速实用、对细胞活性影响小等优点^[12-18]。实验中采用全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化骨髓基质干细胞，分离培养的骨髓基质干细胞具有很强的增殖能力，可使细胞保持稳定的表型特征及多向分化潜能。因此，作者认为全骨髓贴壁培养法可以更简便的体外分离、纯化和大量扩增骨髓基质干细胞，是比较理想的分离纯化方法。

3.2 BMP2和VEGF165双基因修饰骨髓基质干细胞异位诱导成骨 BMP是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白，属于转化生长因子β超家族，是较强的成骨因子，能刺激并促进间充质细胞向成骨细胞分化。BMP2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一。BMP2已经用于体内诱导骨形成，有很好的临床应用前景^[19-29]。实验在BMP2单基因转染组中观察到骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，Western Blot检测BMP2单基因转染组有大量BMP2分泌于上清液中，说明BMP2单基因转染骨髓基质干细胞具有异位诱导成骨的能力。虽然BMP单独应用即可拥有较强的成骨诱导活性，但骨修复是一个复杂的受多种细胞因子调控的过程，VEGF是机体内促进血管生长最重要的生长因子，对骨修复重建及骨折愈合过程中的血管形成发挥重要的作用。VEGF被认为是已知诱导血管再生作用最强的生长因子^[30-38]。VEGF家族包括VEGF-A、B、C、D和胎盘形成因子，其中VEGF-A是研究较集中的因子，具有4种异构体，分别由121、165、189、206个氨基酸组成，VEGF121含量最多，而VEGF165活性最强。实验在VEGF165单基因转染组中观察不到骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，Western Blot检测提示VEGF165单基因转染组中大量的VEGF165分泌于上清液中，说明VEGF165单基因转染骨髓基质干细胞具有促进血管再生的能力，并不具备异位诱导成骨能力。国内外研究发现，骨缺损局部利用BMP2和VEGF165双基因治疗，能持续稳定地产生BMP2和VEGF165，使单一作用效应放大，实现骨与血供的联合重建^[39-46]。

实验采用Western blot检测BMP2、VEGF165双基因和单基因转染骨髓基质干细胞中BMP2、VEGF165的表达，结果BMP2和VEGF165双基因转染组目的蛋白BMP2表达高于BMP2、VEGF165单基因转染组；而目的蛋白VEGF165的表达则是双基因转染组低于VEGF165单基因转染组。实验结果与既往研究结果一致，说明双基因修饰骨髓基质干细胞具有促进异位诱导成骨的能力。

3.3 碱性磷酸酶在成骨中的作用碱性磷酸酶能够直接反映成骨细胞早期分化的程度，是骨形成的特异性指标。研究发现，骨组织中含有大量的碱性磷酸酶^[47-49]，存在于成骨细胞周围及其表面，极易释放入血，因而当成骨细胞增殖、骨生长亢进时会出现血清碱性磷酸酶活性上升，故而未成熟动物的血清碱性磷酸酶活性较成熟动物高。在人体内，年龄越小，骨型碱性磷酸酶活性越高，常是成年人的数倍^[50-52]。实验通过检测细胞内碱性磷酸酶的活性对不同基因修饰的骨髓基质干细胞的成骨诱导能力进行了比较，发现VEGF165基因修饰对骨髓基质干细胞的增殖有一定的促进作用，也能够在一定程度上上调细胞内碱性磷酸酶的活性，但后期却没有明显的作用，这可能是由于VEGF基因的表达使骨髓基质干细胞向其他方向分化增强而向成骨方向分化减弱导致的。BMP2基因修饰既能促进骨髓基质干细胞增殖，又能提高细胞内碱性磷酸酶活性，BMP2的成骨活性主要体现在可以促进细胞向成骨细胞的表型转化，上调碱性磷酸酶活性。实验证明BMP2和VEGF165共同转染骨髓基质干细胞，无论是细胞增殖或细胞内碱性磷酸酶活性均超越任何一种基因单独转染。

综上所述，BMP2和VEGF165双基因转染骨髓基质干细胞和BMP2单基因转染骨髓基质干细胞均具有异位诱导成骨的能力，且双基因转染促进骨髓基质干细胞异位成骨的能力更强。

骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓基质干细胞的异位诱导成骨能力

Ectopic osteogenesis of bone marrow stromal stem cells under bone morphogenetic protein 2/vascular endothelial growth factor 165 co-transfections

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