生物活性玻璃修饰聚对苯二甲酸乙二醇酯对骨愈合的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
生物玻璃：主要由Si、Na、Ca及P氧化物组成，该材料与其他材料相比具有良好的生物相容性和生物活性，其化学组成与人体骨骼类似，容易与骨骼形成坚固的化学键，经过机体生物酶作用可降解为新的骨骼成分，使其更加接近人体骨骼，并且材料具备更高的生物活性。
聚对苯二甲酸乙二醇酯：是乳白色或前黄色高度结晶性的聚合物，表面平滑而有光泽。耐蠕变、耐抗疲劳性、耐磨擦和尺寸稳定性好，磨耗小而硬度高，具有热塑性塑料中最大的韧性，电绝缘性能好，受温度影响小，但耐电晕性差，无毒、耐气候性、抗化学药品稳定性好，吸水率低，耐弱酸和有机溶剂，但不耐热水浸泡，不耐碱。

背景：聚对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带材料具备优良的力学性能，但其生物相容性有待提高。
目的：观察生物活性玻璃修饰聚对苯二甲酸乙二酯对骨愈合的影响。
方法：①体外实验：将聚对苯二甲酸乙二酯(对照组)、生物活性玻璃-聚对苯二甲酸乙二酯复合物(实验组)分别与MC3T3-E1细胞共培养，培养3 d后，观察细胞形态；培养1，3，5 d后，检测细胞增殖及碱性磷酸酶活性；②体内实验：取24只新西兰大白兔，制备单侧膝关节韧带断裂模型，随机分为2组，实验组置入生物活性玻璃-聚对苯二甲酸乙二酯复合物，对照组置入聚对苯二甲酸乙二酯。置入后6，12周，对比移植部位生物力学及组织学变化。
结果与结论：①体外实验：培养3 d后，实验组细胞密度显著高于对照组；实验组培养3，5 d的细胞增殖及碱性磷酸酶活性显著性高于对照组(P < 0.05)；②体内实验：实验组置入后6，12周的最大轴向拔出力显著大于对照组(P < 0.05)。置入后6周，对照组存在明显缺损，且缺损部位存在大量炎性细胞；实验组新骨形成界面形成骨小梁，瘢痕组织较少，界面宽度狭小。置入后12周，对照缺损部位模糊，存在明显炎性细胞，骨面上存在新骨；实验组缺损部位存在较多的新生组织，缺损部位可见少许炎性细胞；③结果表明：生物活性玻璃修饰的聚对苯二甲酸乙二醇酯具有良好的细胞相容性、生物力学，可促进骨愈合。

ORCID: 0000-0001-8999-4141(翟昕元)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 生物活性玻璃, 聚对苯二甲酸乙二酯, 运动学, 骨愈合, PET纤维, 58-S-PET复合材料, 单侧半关节移植物-骨愈合模型, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Polyethylene terephthalate (PEA) holds good mechanical properties, but its biocompatibility needs to be improved.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bioactive glass modified PEA on bone healing.
METHODS: In vitro experiment: PEA (control group) and bioactive glass modified PEA (experimental group) were respectively co-cultured with MC3T3-E1 cells. The cell morphology was observed at 3 days of culture, and the cell proliferation and alkaline phosphatase activity were detected at 1, 3 and 5 days of culture. In vivo experiment: 24 New Zealand white rabbits were enrolled, modeled into unilateral knee ligament rupture, and then randomly allotted to two groups. Bioactive glass modified PEA and PEA were implanted into experimental and control groups, respectively. Biomechanics and histological changes were compared between groups at 6 and 12 weeks after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: In vitro experiment: the cell density in the experimental group was significantly higher than that in the control group after 3-day culture (P < 0.05); the cell proliferation and alkaline phosphatase activity were significantly higher than those in the control group at 3 and 5 days of culture (P < 0.05). In vivo experiment: the maximum axial pull-out strength in the experimental group was significantly greater than that in the control group at 6 and 12 weeks after implantation (P < 0.05). In the control group, the defect was obvious and there were a large number of inflammatory cells at 6 weeks after implantation; the defect region became fuzzy, abundant inflammatory cells existed and new bone formed on the surface at 12 weeks after implantation. In the experimental group, there were newly formed bones and trabeculae formed on the interface, the scar tissue became less, and the interface width was narrow at 6 weeks after implantation; numerous new tissues were observed, and only a few inflammatory cells observed in the defect region at 12 weeks after implantation. These results indicate that the modified PEA with bioactive glass possesses good biocompatibility and biomechanics, which can promote bone healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone-Patellar Tendon-Bone Graft, Biomechanics, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

翟昕元，林小风. 生物活性玻璃修饰聚对苯二甲酸乙二醇酯对骨愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 854-858.

Zhai Xin-yuan1, Lin Xiao-feng2 . Bioactive glass modified polyethylene terephthalate promotes bone healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 854-858.

图/表（结果） 7

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引言

膝关节前交叉韧带断裂将会直接引起关节不稳，间接造成关节软骨退变，严重者甚至会引起骨关节损伤^[1]。随着人们生活方式及交通的不断发达，导致膝关节前交叉韧带运动损伤发生率呈现上升趋势^[2]。数据报道显示，美国膝关节前交叉韧带年发病率超过25万，每年用于膝关节前交叉韧带重建费用超过70亿^[3]。目前，临床上交叉韧带重建修复材料较多，包括自体肌腱、异体肌腱及人工韧带3种，3种材料各有其优缺点^[4]。自体移植是最为理想的材料，但容易出现供区并发症，如移植区疼痛、活动受限等。同种异体韧带容易出现免疫排斥反应、疾病传播等问题^[5]。人工韧带时近年来使用较多的膝关节前交叉韧带修复材料，能避免自体移植物供区并发症，降低潜在风险。但临床上对于人工韧带材料的选择、使用尚缺乏统一的标准。目前，临床上常用的人工韧带主要以LARS(Ligament Advanced Reinforcement System)人工韧带为主，其主要材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terphthalate，PET)，该人工韧带具备优良的力学性能和生物相容性，具有良好的短期效果^[6]。相关学者对159例LARS人工韧带重建患者进行研究，随访4年显示7%患者移植失败，主要表现为螺钉退出、韧带在骨道内松动^[7]。出现这种现象的原因是多方面的，可能与手术技术、PET材料疏水性等关系密切，而退行性骨关节炎可能与PET材料生物相容性有关^[8]。

生物玻璃是临床上常用的生物材料，该材料主要由Si、Na、Ca及P氧化物组成，该材料与其他材料相比具有良好的生物相容性和生物活性，其化学组成与人体骨骼类似，容易与骨骼形成坚固的化学键，经过机体生物酶作用可降解为新的骨骼成分，使其更加接近人体骨骼，并且材料具备更高的生物活性^[9]。与羟基磷化石相比，生物玻璃成分能根据需要在较大范围内调节，与人的体液反应过程中，在其表面能析出磷灰石结构，比人工合成的磷灰石更加接近人体骨骼。此外，羟基磷灰石需数天才能与人体骨骼产生键合，而生物玻璃仅需要数小时，具备更好的生物活性。将生物玻璃置入人体骨缺损部位，能与骨组织直接结合，诱导骨修复与再生，将生物玻璃置入机体缺损部位能与骨组织相互结合，诱导骨的修复、再生，起到修复组织、恢复期功能作用，并且生物玻璃能与其他材料进行修饰，获得良好的生物活性的复合修复材料，促进运动学骨愈合^[10]。

实验将新型人工韧带运用于大兔单侧半关节移植物-骨愈合中，探讨生物活性玻璃修饰PET的制备方法及对运动学骨愈合的影响。

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材料方法

1.1 设计材料修复对比实验。

1.2 时间及地点实验于2013年6月至2016年2月在三峡大学医学院完成。

1.3 材料

实验动物：24只SPF级新西兰大白兔，雄雌不拘，体质量1.2-3.6 kg，由长江大学医学院动物中心提供，许可证号：SCXK2007-0010，随机分为对照组(n=12)和观察组(n=12)。将新西兰大兔常规饲养，自由摄食、饮水。对动物的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》规则^[11]。动物房温度21-23 ℃，相对湿度40%-60%。

主要细胞、试剂与仪器：鼠成骨细胞MC3T3-E1(日本RkenCeU Bank，Ibaraki)；PET膜片(中国苏州市华盛复合包装厂)；LARS韧带(法国Orthomedic公司)；明胶(中国新成明胶公司)；PBS(美国Invirtrogen)；DMEM培养基(美国Sigma公司)；细胞计数仪(美国BIO-RAD公司)；台式离心机(德国eppendorf公司)；24 孔培养板(美国Corning公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；LEICA硬组织切片机(德国徕卡公司)；CO₂培养箱(日本SANYO公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 复合材料的制备将LARS韧带骨道端(PET纤维)(图1)剪成24孔板大小，选择透光性较强的PET膜片制备成24孔板大小进行实验，将2种材料浸泡在体积分数75%乙醇中4 h，采用等离子水清洗，在37 ℃烘箱中烘干，并将LARS韧带骨道端(PET纤维)与明胶混合(浓度配比1∶4)，在磁力搅拌5 min，干燥后经过等离子溅射仪完成表面喷金处理，利用扫描电镜观察材料表面特性，涂层后获得生物玻璃58S-PET复合材料，经过环氧乙烷消毒，备用^[12-13]。

1.4.2 生物玻璃58S-PET复合材料的体外实验

细胞培养：将购置的鼠成骨细胞MC3T3-E1接种在含完全培养液的培养瓶中，在37 ℃、体积分数5%CO₂下培养，调整细胞浓度为2×10⁷ L^-1，备用。将合成的生物玻璃58S-PET复合材料(实验组)与未经处理的PET膜(对照组)放置在24孔培养板中，加入鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养，每2 d换液1次，3 d后观察细胞形态^[14]。

细胞计数：第1，3，5天，随机选择4个培养孔进行细胞计数，差异Trypsin-EDTA3min消化后加入血清培养终止液，800 r/min离心5 min，取少许细胞悬液采用细胞计数仪完成细胞计数^[15]。MTT检测细胞增殖：培养第1，3，5天，两组各随机选择4个培养孔，加入40 μL MTT，放入培养箱后4 h孵育，取出后去除培养基，加入400 μL DMSO振荡20 min，在480 nm下测定吸光度值^[1⁶^]。

碱性磷酸酶活性测定：培养第1，3，5天，两组各随机选择4个培养孔进行碱性磷酸酶活性测定。相关操作步骤严格遵循碱性磷酸酶试剂盒说明书进行，采用酶标仪在405 nm下测定吸光度值^[17]。

1.4.3 体内实验

单侧半关节移植物-骨愈合模型建立及分组处理：将新西兰大白兔称质量后，戊巴比妥钠进行耳缘静脉麻醉，常规消毒铺巾，取兔右侧胫骨平台1 cm下做一个长为3 cm的切口，逐层分离，充分暴露胫骨骨干，采用直径为3 mm克氏针在胫骨平台下2 cm处做一骨隧道，隧道长度到达膝关节，建立单侧半关节移植物-骨愈合运动学模型，X射线下照射显示韧带断裂表示模型成功。对照组置入PET膜，实验组置入生物玻璃58S-PET复合材料，术后肌肉注射40×10⁴ U青霉素，连续注射3 d^[18-19]。

骨愈合指标测定：置入后6，12周，每组取6只兔进行生物力学及组织学测定。①生物力学：取右侧缺损部位，剔除骨膜及软组织，在Instron材料测试机上完成最大拔出力测定；②苏木精-伊红染色：取标本后，放入10%EDTA溶液中脱钙，利用乙醇梯度脱水，制备5 μm切片，放入苏木精染色中染色5 min，在倒置显微镜下观察结果^[¹⁹^-²⁰^]。

1.5 主要观察指标生物活性玻璃修饰PET纤维的细胞相容性与生物相容性。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理，计数资料采用n/%表示，行卡方检验；计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

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讨论

LARS人工韧带属于是一种新型的支架型PET人工韧带，该韧带采用独特的结构设计，其关节内段属于平行纵向排列游离纤维，避免韧带纤维磨损，并且能预先外旋扭转。相关学者研究显示，LARS人工韧带具备抗拉伸、抗弯曲及抗扭转的力学性能，人工韧带设计时游离的纤维进入股骨隧道内1 mm，更加有利于减少韧带内部之间纤维及韧带与骨隧道之间的磨损^[21]。同时，LARS人工韧带整体结构设计较好，具备良好的力学性能，使用寿命也相对较长^[22]。文献报道对159例LARS人工重建前交叉韧带患者进行4年随访，结构显示移植失败率为7%，3例发生螺钉松动，3例人工韧带内固定断裂，1例膝关节滑膜炎^[23]。出现这种现象的原因是多方面的，由于韧带表面分布不均匀，再加上细胞增殖能力较差，引起人工韧带受力分布不均匀，增加移植失败。

涂层技术是近年来使用较多的一种新型技术，该方法能整合材料与涂层材料，实现不同材料之间的优势互补，并且涂层后效果大于2种单独材料的效果。研究中采用生物玻璃与明胶作为混合溶液，再此基础上构建以生物玻璃(58S)为涂层的PET复合材料，通过涂层技术以明胶作为载体将生物玻璃涂覆在PET材料表面，获得的58S-PET复合材料具备良好的生物相容性，能促进自体组织再生和愈合，从而能取得理想远期疗效。生物玻璃是一种人造骨移植材料，该材料具备生物活性，能在体内形成羟基磷灰石而广泛运用于骨缺损的治疗。同时，生物玻璃具备亲水性、骨诱导性和骨传导性。研究中，成骨细胞培养3 d后58S-PET复合材料细胞密度显著高于PET膜(P < 0.05)。提示：58S-PET复合材料对细胞无毒性，利于细胞的增殖、生长。其机制可能是由于58S-PET复合材料作为硅酸盐生物玻璃所具有的亲水性，使得成骨细胞在其表面具备生长性能，能在体内形成羟基磷灰石表层，具有更好的仿生性。同时，58S-PET复合材料形成的成骨细胞能能附着的表面积，促进移植物-骨愈合进程。骨缺损愈合及骨折愈合主要经过4步：①血肿形成：运动学愈合由于骨髓、骨膜及周围软组织血管断裂出血，形成血凝块，伤后4-8 h能在两断端形成血肿；②血肿机化：骨折后二三天，骨折周围软组织出现急性炎性反应，导致血管扩张，血浆渗出，造成炎细胞浸润，导致中性粒细胞、肥大细胞，使得血肿进一步机化；③骨痂形成：骨折后一二周后，机化的血块被纤维血管组织所替代，通过成骨细胞和多种内源性生长因子的作用，从而形成骨痂；④骨痂改建：运动损伤2周后，骨样组织会出现钙盐沉积，并且会逐渐钙化形成坚实的骨组织，通过较长时间的骨质吸收、重建，从而恢复其正常功能。研究中，对照组置入后6周存在明显的缺损部位，且缺损部位存在明显的炎性细胞；置入后12周缺损部位模糊，存在明显的炎性细胞，骨面上存在新骨，实验组置入后6周新骨形成界面形成骨小梁，瘢痕组织较少，界面宽度狭小；12周缺损部位存在较多的新生组织，缺损部位可见少许炎性细胞。由此看出，生物玻璃-PET复合材料能增加骨细胞增殖活性，抑制炎症反应，在一定程度上可以减少移植带来的排斥反应，为宿主细胞、移植物接触提供较好的内环境，为复合材料更好的与宿主细胞融合创造良好的环境，促进新生骨生成，为促进移植物与骨愈合提供参考和依据。

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