长链非编码RNA NR_033474对C3H10T1/2间质干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.019

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
间质干细胞：具有自我更新和多向分化潜能，在体外不同因素诱导下可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞、心肌细胞和造血支持基质细胞等中胚层细胞系分化。因其具有良好的向成骨细胞分化的潜能，而成为组织工程、再生医学和细胞移植、基因治疗研究领域的理想种子细胞。
长链非编码RNA：是一类转录本长度超过200 bp的RNA分子，但因其成熟的转录本中存在众多终止密码子而不具有编码蛋白质能力。随着对长链非编码RNA研究的深入，人们逐渐意识到长链非编码RNA在许多生理过程中起到重要的调控作用，如细胞周期、细胞分化、剂量补偿和染色体印迹调控。但目前关于长链非编码RNA与干细胞增殖研究主要局限在肿瘤干细胞方面，研究表明多个长链非编码RNA如lncCAMTA1、ROR、BACE1-AS、MALAT1等分别参与调控肝癌干细胞、胃癌干细胞、卵巢癌干细胞和神经胶质瘤干细胞增殖。关于长链非编码RNA对正常干细胞增殖调控，目前只有少数几篇文献涉及。

摘要
背景：最近研究发现，长链非编码RNA可调控干细胞的增殖与分化，但关于长链非编码RNA NR_033474在干细胞增殖及细胞周期调控中的作用，目前尚不清楚。
目的：通过在C3H10T1/2间质干细胞中过表达NR_033474，观察NR_033474对C3H10T1/2细胞增殖和细胞周期的影响，进一步分析NR_033474影响间质干细胞C3H10T1/2增殖的可能作用机制。
方法：通过慢病毒载体在C3H10T1/2细胞中过表达NR_033474，应用Real-time PCR检测其表达效率，以转染空载体慢病毒的C3H10T1/2细胞为对照，利用细胞计数法绘制生长曲线，观察过表达NR_033474后C3H10T1/2细胞的生长变化；PI染色流式细胞仪检测细胞周期改变；通过Western蛋白印迹法检测过表达NR_033474后，细胞周期相关蛋白(P53、Cyclin B1、CDK1、Cyclin D1)的表达。
结果与结论：①与对照组比较，感染NR_033474慢病毒后的C3H10T1/2间质干细胞NR_033474表达上调约100倍(P < 0.01)；②与对照组比较，过表达NR_033474后的C3H10T1/2细胞增殖能力明显降低(P < 0.05)；③与对照组比较，过表达NR_033474后的C3H10T1/2间质干细胞阻滞于G2/M期；④与对照组比较，过表达NR_033474后的C3H10T1/2间质干细胞Cyclin B1和CDK1蛋白表达下调，P53、Cyclin D1蛋白水平无明显变化；⑤结果表明，NR_033474可能通过下调 Cyclin B1及CDK1蛋白表达水平，抑制C3H10T1/2间质干细胞的增殖生长能力，使细胞阻滞于G₂/M期。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-5513-4343(汪宗桂)

关键词: 干细胞, 分化, 间质干细胞, 长链非编码RNA, 慢病毒感染, 细胞增殖, 细胞周期, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have found that long non-coding RNAs (lncRNAs) can regulate stem cell proliferation and differentiation. But it is unclear that how lncRNA NR_033474 regulate stem cell proliferation and cell cycle.
OBJECTIVE: To investigate the effect of lncRNA NR_033474 on the proliferation and cell cycle regulation in C3H10T1/2 mesenchymal stem cells after the NR_033474 overexpressed by lentivirus, and to study the possible regulation mechanism of NR_033474 on mesenchymal stem cells.
METHODS: LncRNA NR_033474 was cloned into a lentivirus vector. Lentivirus particles were infected into C3H10T1/2 cells to upregulate the expression of NR_033474. The NR_033474 expression level was detected by real-time PCR. Compared with the empty lentivirus vector, the proliferation of C3H10T1/2 cells which overexpressed NR_033474 was detected by cell counting assay and cell cycle was detected using flow cytometry. The expression of cell cycle-associated proteins such as CDK1, Cyclin B1, Cyclin D1 and P53 were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, lncRNA NR_033474 in C3H10T1/2 cells which overexpressed NR_033474 was increased by about 100 times (P < 0.01), and the proliferation of C3H10T1/2 cells was significantly inhibited after NR_033474 overexpression by lentivirus (P < 0.05). In addition, flow cytometry showed that C3H10T1/2 cells overexpressing NR_033474 were arrested in G2/M phase compared to the control group. Western blot showed that the expression levels of CDK1 and Cyclin B1 were downregulated, while there were no changes in Cyclin D1 and P53 expression. To conclude, these findings suggest that the NR_033474 overexpression significantly inhibits the cell growth of C3H10T1/2 cells, at least in part, through induction of cell cycle arrest at G₂/M phase.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Cell Cycle, Cell Cycle Proteins, Flow Cytometry, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

2.1 长链非编码RNA NR_033474编码蛋白性能鉴定 根据CPAT软件分析结果，NR_033474序列是长度为1 334 bp的RNA分子，其编码蛋白的概率得分为0.059 7，远低于蛋白编码阈值0.44(当编码蛋白的概率≥0.44，表明其为编码序列；而当编码蛋白的概率<0.44时，表明其为非编码序列)，表明是非编码序列，属于长链非编码RNA。

2.2 qRT-PCR鉴定NR_033474在C3H10T1/2间质干细胞生长过程中的时序表达模式 qRT-PCR结果显示，细胞生长汇合后长链非编码RNA NR_033474表达逐渐增加，与对数生长期比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 长链非编码RNA NR_033474过表达对C3H10T1/2间质干细胞生长的影响 以2^-^??Cq法统计lncRNA NR_033474的相对含量，以β-actin为内参基因。与对照组相比，实验组长链非编码RNA NR_033474表达量约上调100倍(P < 0.01)，见图2。

将对照组和实验组稳定株种植6孔板，从生长第3 天开始，实验组稳定株生长速度明显受到抑制，第3，5天细胞生长与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3，表明过表达长链非编码RNA NR_033474具有抑制C3H10T1/2间质干细胞增殖的作用。

2.4 长链非编码RNA NR_033474过表达对C3H10T1/2间质干细胞周期的影响 与对照组比较，实验组能够使G2/M期细胞数由7.48%增加到15.94%，相应处于S期的细胞则从38.77%降到33.35%(P < 0.05)，见图4。

2.5 过表达NR_033474对C3H10T1/2间质干细胞周期相关蛋白表达水平的影响 与对照组相比，实验组G₂/M期调控蛋白Cyclin B1和CDK1表达水平下调，G₀/G₁期调控蛋白P53和Cyclin D1表达水平无变化，见图5。实验结果从蛋白水平揭示，长链非编码RNA NR_033474通过减少Cyclin B1和CDK1蛋白的表达诱导C3H10T1/2间质干细胞出现G₂/M期阻滞，并未对C3H10T1/2细胞的G₀/G₁期产生影响。

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引言

间质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在体外不同因素诱导下可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞、心肌细胞和造血支持基质细胞等中胚层细胞系分化^[1-2]。因其具有良好的向成骨细胞分化的潜能，而成为组织工程、再生医学和细胞移植、基因治疗研究领域的理想种子细胞^[3-5]。但是，与肿瘤细胞可不受控制的分裂增殖不同，干细胞的增殖及分化过程均存在不同程度的调控机制^[6-7]。因此，如何适当调控细胞的增殖与分化比例，这是将干细胞应用于临床治疗所面临的首要问题。

近年来，大量研究发现非编码RNA分子能够调控干细胞的增殖和分化过程。依据转录本的大小，非编码RNA可分为短链非编码RNA和长链非编码RNA^[8]。短链非编码RNA也叫做微小RNA，是一类转录长度为19-25 nt的内源性非编码RNA，在干细胞生长、发育、增殖及分化等方面起到重要作用^[9]。如缺失Dicer1或Dgcr8的胚胎干细胞增殖能力明显降低，而miR-290家族则被证明能促进胚胎干细胞增殖^[10]。Mizuno等^[11]证明在间质干细胞成骨分化时，miR-125b可在分化早期抑制细胞增殖，从而抑制成骨分化过程。汪阳明^[12]教授研究组发现miR-294/302簇点的微小RNA主要导致胚胎干细胞的细胞周期G₁限制点的缺失，增加胚胎干细胞的增殖能力，并且证明这些微小RNA是通过抑制另一种细胞周期关键蛋白Rb家族的基因表达而起到调节作用。毛晨熙等^[13]研究发现miR-193可通过增强CDK2的表达而达到促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用。越来越多的微小RNA被发现参与调控干细胞的增殖过程^[14-17]，但关于占基因组大多数的非编码RNA在干细胞增殖中的作用却少见报道。

长链非编码RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)是一类转录本长度超过200 bp的RNA分子，但因其成熟的转录本中存在众多终止密码子而不具有编码蛋白质能力^[18]。目前为止，在人类基因组中已发现9 640多种长链非编码RNA，其中仅有约100种的功能被报道^[19-20]。根据长链非编码RNA相对于编码蛋白质基因的位置，可将其分为5类，即正义长链非编码RNA、反义长链非编码RNA、双向长链非编码RNA、基因内长链非编码RNA和基因间长链非编码RNA^[21-22]。长链非编码RNA最初被认为是“转录噪音”，随着对长链非编码RNA研究的深入，人们逐渐意识到其在许多生理过程中起到重要的调控作用，如细胞周期，细胞分化，剂量补偿和染色体印迹调控^[23-26]。但目前关于长链非编码RNA与干细胞增殖研究主要局限在肿瘤干细胞方面，研究表明多个长链非编码RNA如lncCAMTA1、ROR、BACE1-AS、MALAT1等，分别参与调控肝癌干细胞、胃癌干细胞、卵巢癌干细胞和神经胶质瘤干细胞增殖^[27-30]。关于长链非编码RNA对正常干细胞增殖调控，目前只有少数几篇文献涉及。如：Hu等^[31]研究表明长链非编码RNA AK015322主要富集在睾丸组织，其可通过调控microRNA-19b-3p(miR-19b-3p)的表达进而调控精源干细胞增殖。长链非编码RNA H19作为多个microRNA的前体，参与调控多潜能干细胞的增殖^[32]。转录因子SOX4通过结合到长链非编码RNA DANCR启动子区增加其表达，从而促进滑膜间质干细胞增殖及软骨形成^[33]。

NR_033474是小鼠11号染色体2810433D01Rik基因编码的长链非编码RNA，序列全长1 334 bp，目前功能未知。课题组在C3H10T1/2间质干细胞生长过程中发现，长链非编码RNA NR_033474在细胞处于对数生长期(即细胞100%汇合前1 d)，静止期(即细胞汇合后1 d及汇合后4 d)等不同时间点的表达水平，随着时间点的增加而呈现逐渐增高趋势。基于此现象，作者认为过表达NR_033474可能参与调控间质干细胞的生长。实验通过慢病毒过表达NR_033474，探索C3H10T1/2间质干细胞增殖和细胞周期改变情况。

材料方法

1.1 设计 细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2016年10月于广东医科大学东莞校区科研平台完成。

1.3 材料 小鼠C3H10T1/2间质干细胞购自中国科学院上海细胞库；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、青/链霉素(美国Gibco公司)；Cyclin D1抗体(Abcam)；p53抗体、Cyclin B1抗体(Cell Signaling Technology)；Tubulin抗体(碧云天科技生物公司)；CDK1抗体(Proteintech)；定量PCR及反转录试剂盒(日本TaKaRaa公司)；PCR引物(上海生工合成)；LV-Control及长链非编码RNA NR_033474重组慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson)；CO₂培养箱、Real Time PCR System (Thermo Scientific)。

1.4 实验方法

1.4.1 C3H10T1/2间质干细胞的培养 将C3H10T1/2间质干细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。每3 d更换1次培养基。待细胞生长至80%融合后，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液消化，进行细胞传代培养。

实时定量RT-PCR：取适量Trizol裂解液裂解，收集处于对数生长期(即细胞100%汇合前1 d)、静止期(即细胞汇合后1 d及汇合后4 d)的细胞，提取细胞中的总RNA，运用核酸蛋白检测仪检测RNA的纯度和浓度，取800 ng RNA，按PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒说明书进行反转录反应操作，以生成的cDNA作为模板，进行Real-time PCR 反应，反应体系为：SYBR Premix EX TagⅡ5 μL，PCR Forward Primer 0.4 μL，PCR Reverse Primer 0.4 μL，cDNA 0.5 μL，dH₂O 3.7 μL，混匀，按下列反应条件进行扩增：95 ℃，预变性7 min；95 ℃，变性5 s；60 ℃，退火30 s，共40个循环。以β-actin为内参，按2^-^??Cq公式计算目的基因的相对表达量。

1.4.2 NR_033474非编码性鉴定 由于以前部分数据库注解非编码和编码基因存在差异，将少数非编码转录本错误注解为编码基因，同时部分编码基因被错误注解为非编码RNA。CPAT软件能够精确敏感区别转录本编码性能^[34]。实验采用CPAT软件对NR_033474编码性能进行重新鉴定。

1.4.3 过表达慢病毒细胞株感染和筛选 取24孔细胞板，每孔接种1×10⁴个C3H10T1/2间质干细胞，于37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养24 h，根据预实验结果分别加入感染复数MOI为20的对照组LV-Control重组慢病毒和实验组LV-NR_033474重组慢病毒，并且均加入8 mg/L的 polybrene感染细胞，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养8 h后，弃掉旧的培养基，更换新的DMEM继续培养。待72 h后加入3 mg/L嘌呤霉素进行筛选，待观察到未感染的正常细胞全部死亡，而感染病毒的细胞不再死亡时即得到稳定株，然后立即停止筛选，用于后续实验。

1.4.4 细胞计数检测细胞生长曲线 将LV-Control重组慢病毒(对照组)与LV-NR_033474重组慢病毒(实验组)分别感染C3H10T1/2间质干细胞后，接种于6孔板，2^-^??Cq法检测NR_033474表达量；接种后1，3，5 d，用体积分数0.25%胰蛋白酶/EDTA消化成单细胞悬液，采用血球计数板进行活细胞计数，绘制生长曲线。

1.4.5 细胞周期分析 将LV-Control重组慢病毒(对照组)与LV-NR_033474重组慢病毒(实验组)分别感染C3H10T1/2间质干细胞4 d后，用体积分数为0.25%的胰蛋白酶/EDTA消化成单细胞悬液，按1.5×10⁴/cm²的密度接种于21 cm²培养皿中，培养48 h后弃去旧的培养基，用1 mL PBS洗涤1次，再用体积分数为0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集细胞悬液，离心，弃上清液。用预冷的PBS洗涤2次，再用100 μL PBS重悬，缓慢加入4 ℃预冷的体积分数70%乙醇溶液重悬细胞，使细胞重悬为单个细胞悬液，4 ℃固定过夜。次日取出固定后的细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS洗涤1次，除去残留的乙醇。用50 μL含有10 g/L RNAase的PBS重悬细胞，加入适量PI，使其终浓度达到50 mg/L，将细胞悬液收集于流式管中避光孵育30 min，用流式细胞仪进行检测，每个样品获取1×10⁴个细胞进行检测。最后用ModFitLT3.2软件进行分析。

1.4.6 蛋白印迹(Western blot)检测 将LV-Control重组慢病毒(对照组)与LV-NR_033474重组慢病毒(实验组)分别感染C3H10T1/2间质干细胞24 h后，用含有PMSF的RIPA裂解液收集细胞蛋白质，用BCA试剂盒测定蛋白质的浓度，加入一定体积的蛋白上样缓冲液，于96 ℃沸水中煮5 min，使蛋白质充分变性。经SDS-PAGE进行电泳分离后，湿转至PVDF膜上，于5%脱脂奶粉中室温封闭80 min，加入稀释后的一抗，4 ℃冰箱中孵育过夜，1×TBST洗涤3次，10 min/次，洗涤后加入二抗稀释液室温孵育1 h，1×TBST洗涤3次，10 min/次，加入ECL强效发光液进行曝光，最后应用Image J 软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.5 主要观察指标 长链非编码RNA NR_033474过表达效率；C3H10T1/2间质干细胞周期及增殖情况；C3H10T1/2间质干细胞相关蛋白表达情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x(_)±s表示，两组间均数差异比较采用两样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞是一种具有自我更新能力，其子代细胞可向不同细胞谱系分化的多潜能细胞^[35]。但是在1960年，Hayflick等^[36]通过体外细胞实验发现，干细胞同其他的体细胞一样具有有限增殖能力，而这一现象被称为Hayflick现象。近年，也有研究者在长期的细胞培养过程中发现小鼠和人的干细胞增殖能力会随着代数的增加而呈现减少现象^[37]。那么，如何提高干细胞的增殖能力是提高细胞治疗效果的关键因素。

在干细胞研究领域，越来越多科学家发现长链非编码RNA在干细胞增殖和分化的调控过程中发挥重要作用。Jia等^[38]采用病毒感染法下调长链非编码RNA ANCR在牙周膜干细胞中的表达，发现抑制lncRNA DANCR的表达可以促进其增殖，并且可通过上调成骨分化相关标志基因DKK1、GSK3-β和β-catenin的表达，促进牙周膜干细胞的成骨分化，这为将干细胞用于口腔组织工程研究提供了新的研究方向。而长链非编码RNA-uc.167通过调节Mef2c基因的表达，阻滞P19细胞于G₀/G₁期而影响细胞周期的进程，故而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡^[39]。课题组研究发现，长链非编码RNA NR_033474在C3H10T1/2间质干细胞对数生长期、静止期时的表达水平逐渐升高。通过采用慢病毒载体在C3H10T1/2间质干细胞中过表达长链非编码RNA NR_033474，活细胞计数发现，与对照组比较，实验组细胞数目随着细胞生长时间的增加而逐渐减少。由于细胞种板后12 h才会贴壁生长，16-18 h进入对数生长期，故1 d计数两种细胞个数无显著差异，而随着生长时间延长至3，5d时差异逐渐明显。实验结果表明过表达长链非编码RNA NR_033474抑制了C3H10T1/2间质干细胞增殖。

用流式细胞仪检测细胞周期变化发现，与对照组比较，实验组G₀/G₁细胞数目基本不变，G₂/M期的细胞数从7.48%增加到15.94%，同时伴S期细胞数从38.77%降到33.35%，这说明细胞可能被阻滞于G₂/M期，抑制细胞的生长增殖。

细胞周期调控是一个复杂且庞大的网络，许多细胞周期调控子参与这个调控网络。参与细胞周期调控的分子机制主要包括：细胞周期蛋白Cyclins、细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子CKIs，其关键因素是CDKs蛋白活性的表达和调控^[40]。细胞周期的调控可分为外源性调控和内源性调控2类。外源性调控主要是由细胞因子及其他的外界刺激所造成的；内源性调控则是由Cyclin-CDK-CDI的调控网络来实现^[41-42]。Cyclin和CDK共同促使细胞周期从一个时相进入下一个时相。因此，有研究者将CDK分子比作细胞周期调节的“引擎”，而将Cyclin比作调节“引擎”的油门^[42]。

CDKs是调控细胞生长及增殖的主要蛋白家族，CDKs的时相性激活是细胞周期调控的核心。其中CDK1是G₂/M期的关键蛋白，CDK1的活化是M期启动和运行的重要条件^[43]。在细胞从G₂期向M期过渡时，CDK1与Cyclin B结合后被激活，使相应的底物磷酸化，促使细胞完成M期的各项事件，实现细胞的有丝分裂。CDK1的活性降低，细胞则不能进入M期或者完成M期的任务，故而这部分细胞的运行就停留在G₂/M期，引起G₂/M期阻滞。而Cyclin B1是特异的G₂/M期周期素，在S期晚期和G₂/M期被合成并累积到最大浓度，与CDK1形成促有丝分裂因子。研究表明，Cyclin B1和CDK1复合物的活化是启动有丝分裂的关键，同时也是G₂期进入M期的必要条件^[44-45]。实验结果显示，过表达长链非编码RNA NR_033474后可显著下调G₂/M期调控蛋白CDK1和Cyclin B1的蛋白表达水平，这也直接导致了CDK1和Cyclin B1复合物的减少^[46]。这提示过表达长链非编码RNA NR_033474，可通过下调CyclinB1和CDK1的蛋白水平，阻滞C3H10T1/2间质干细胞于G₂/M期。

野生型P53可以通过诱导p21的表达抑制CDK的活性，从而抑制pRb的磷酸化，阻滞细胞于G₁期，这就是P53介导G₁/S期调控的“P53通路”^[47]。Bennett等^[48]研究表明，在应激反应中，RAX/PACT-PKR可通过P53的SUMO修饰和磷酸化机制促进P53的转录激活，使细胞阻滞于G₁期。Cyclin D主要调节细胞G₁/S期的过渡，故而被称为G₁期周期蛋白。而Cyclin D1是较其他Cyclins更加敏感的调控细胞周期G₁期的重要蛋白^[49]。吕细林等^[50]研究发现长链非编码RNA H19通过促进miR-124-3p的表达，进而抑制其靶基因 Cyclin D1表达而达到抑制肝癌细胞增殖的作用。Cyclin D1是P53的下游基因，Cyclin D1和P53在基因水平和蛋白水平均具有高度相关性^[51]。实验检测了Cyclin D1和P53在C3H10T1/2间质干细胞中的表达水平，结果发现与对照组比较，实验组G₀/G₁期调控蛋白Cyclin D1和P53的蛋白水平并未出现差异性变化。蛋白检测结果与流式细胞周期检测结果相一致，表明过表达长链非编码RNA NR_033474后，并未引起C3H10T1/2间质干细胞产生G₀/G₁期阻滞。

综上所述，长链非编码RNA NR_033474通过下调 CyclinB1及CDK1蛋白的表达水平，阻滞C3H10T1/2间质干细胞于G₂/M期，这可能是长链非编码RNA NR_033474抑制C3H10T1/2间质干细胞增殖的机制之一。相信通过对长链非编码RNA在干细胞增殖中作用的研究，将有助于为探究干细胞在组织工程中的应用提供新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程