补肾活血方联用神经干细胞移植治疗大鼠耳鸣

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
耳鸣：是累及听觉系统的许多疾病不同病理变化的结果，病因复杂，机制不清，主要表现为无相应的外界声源或电刺激，而主观上在耳内或颅内有声音感觉。在临床上它既是许多疾病的伴发症状，也是一些严重疾病的首发症状(如听神经瘤)。病因主要有外耳外耳道耵聍栓塞、肿物或异物；中耳各种中耳炎、耳硬化症；内耳梅尼埃病、突发性聋、外伤、噪声性聋、老年性聋等。
5-羟色胺的生理作用：5-羟色胺是调节神经回路的中药单胺类递质，5-羟色胺参与了多种生理过程的调控作用，其中包括认知，感知、情绪和生理周期，它们主要集中在后脑中缝一个狭窄区域中，称中缝背核。5-羟色胺对神经元的发育形成也有重要的作用，大量的基础研究和临床研究发现，耳鸣的发生与5-羟色胺的功能有关。

摘要
背景：神经干细胞具有多向分化的潜能及自我维持和更新能力，其迁徙能力强大，补肾活血中药可减轻神经元损伤及促进神经细胞再生修复，实现神经功能重建，补肾活血方联合神经干细胞应用于水杨酸钠耳鸣大鼠模型的作用机制尚不清楚。
目的：探讨补肾活血方联合神经干细胞对耳鸣大鼠模型的影响。
方法：取SD大鼠60只随机等分为5组，正常对照组、模型组、补肾活血方组、神经干细胞组和联合组，后4组建立水杨酸钠耳鸣大鼠模型，造模15 d后，补肾活血方单组每天灌胃3 mL灌胃补肾活血方水煎液(2.592 g/mL)，连续7 d，神经干细胞组尾静脉注射1 mL神经干细胞培养液(1.0×10⁹ L^-1)；联合组则先通过混悬液灌胃给药后再进行尾静脉注射神经干细胞培养液。
结果与结论：①补肾活血方和/或神经干细胞治疗均能有效促进大鼠饮水抑制率的恢复，且饮水抑制率：联合组<补肾活血方组<神经干细胞组；②补肾活血方和/或神经干细胞治疗均能有效减轻大脑初级听皮质的病理损伤；③Western blot结果表补肾活血方组及联合组大鼠大鼠5-羟色胺表达水平较模型组增加，且补肾活血方组与联合组大鼠脑组织5-羟色胺表达水平高于神经干细胞组；④ELISA法检测结果与Western blot结果一致；⑤表明补肾活血方联合神经干细胞对水杨酸钠耳鸣大鼠模型有一定疗效，其作用机制可能与修复神经元损伤及5-羟色胺含量及其蛋白表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2582-8635(王荣国)

关键词: 干细胞, 移植, 补肾活血方, 神经干细胞, 耳鸣, 5-羟色胺, Rb, western-blot, ELISA, 病理形态

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells have multi-directional differentiation potential, self-sustaining and self-renewal capacity as well as have strong migration ability. Bushen Huoxue Recipe can reduce neuronal damage and promote nerve cell regeneration, to achieve neural function reconstruction. Underlying mechanisms of Bushen Huoxue Recipe combined with neural stem cell transplantation in rats with tinnitus induced by sodium salicylate are yet unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Bushen Huoxue Recipe combined with neural stem cell transplantation in rats with tinnitus induced by sodium salicylate.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were randomized into five groups (n=12): normal control group, tinnitus model group, Bushen Huoxue Recipe group, stem cell group and combined treatment group (Bushen Huoxue Recipe combined with neural stem cell transplantation). Animal models of tinnitus induced by sodium salicylate were made in all the groups except for the normal control group. Fifteen days after modeling, rats were given intragastric administration of Bushen Huoxue Recipe water decoction (3 mL, 2.592 g/mL) for consecutive 7 days in the Bushen Huoxue Recipe group, intravenous injection of neural stem cells (1 mL, 1.0×10⁹/L) in the stem cell group, or their combined treatment in the combined treatment group.
RESULTS AND CONCLUSION: Bushen Huoxue Recipe, neural stem cell transplantation and their combination all could effectively promote the recovery of drinking water inhibitory rate that was ranked as follows: combined treatment group < Bushen Huoxue Recipe group < stem cell group. Additionally, the above-mentioned methods could effectively reduce pathological damage of primary auditory cortex in the rat brain. Western blot results showed higher 5-serotonin levels in the Bushen Huoxue Recipe group and combined treatment group than in the stem cell group, which were identical to ELISA findings. Our experimental findings indicate that Bushen Huoxue Recipe combined with neural stem cell transplantation exhibit certain effects on tinnitus induced by sodium salicylate in rats, and the mechanism of action is associated with neuronal repair and expression of 5-serotonin at mRNA and protein levels.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tinnitus, Drugs, Chinese Herbal, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王荣国，皮丽宏，陈红耀，张海中. 补肾活血方联用神经干细胞移植治疗大鼠耳鸣[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 730-735.

Wang Rong-guo, Pi Li-hong, Chen Hong-yao, Zhang Hai-zhong. Effects of Bushen Huoxue Recipe combined with neural stem cell transplantation in rats with tinnitus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 730-735.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验所用动物数量为60只，在实验过程中并未有脱落情况。

2.2 动物耳鸣情况 如图1所示，各组大鼠训练后条件反射建立，其Rb值均小于0.2时，提示条件反射成功形成；各组大鼠在条件反射消减期即在适应“安静”期间，每只大鼠的Rb值也均恢复至0.5左右。补肾活血方组、神经干细胞组及联合组大鼠在条件反射消减期(7 d内)的反射抑制率Rb的均值相对于模型组均有不同程度降低(P < 0.05)，反映补肾活血方和/或神经干细胞对水杨酸钠造成耳鸣的症状有改善治疗作用，且补肾活血方组的Rb值恢复速度较神经干细胞组慢，且联合组Rb恢复速度慢于补肾活血方组及神经干细胞组，已与正常对照组接近，说明补肾活血方组效果较神经干细胞组佳，联合给药组效果最佳。

2.3 大脑初级听皮质病理形态 苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组大鼠的神经元细胞排列规则、紧密。模型组大鼠神经元细胞不均匀，部分出现皱缩，毛细血管弯曲变形，细胞膜呈空泡状；而补肾活血方组、神经干细胞组及联合组大鼠初级听皮质中神经元细胞均减轻程度有所不同，治疗后改善情况从强到弱为：联合组>补肾活血方组>补肾活血方组，且其中联合组形态接近正常对照组(图2)，说明该组治疗效果最佳，与动物耳鸣情况结果相符。

2.4 脑组织中5-羟色胺表达水平 Western blot结果显示，正常对照组大鼠脑组织5-羟色胺表达水平较高；与正常对照组相比，模型组大鼠脑组织5-羟色胺表达水平明显下降(P < 0.05)；与模型组相比，补肾活血方组及联合组大鼠脑组织5-羟色胺表达水平均有所上调(P < 0.05)，但单纯神经干细胞移植不改变脑组织5-羟色胺中表达水平(P ≥ 0.05)，且补肾活血方组与联合组大鼠脑组织5-羟色胺表达水平高于神经干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)，联合组大鼠脑组织5-羟色胺表达水平与正常对照组接近(P > 0.05；图3)。

ELISA法检测结果与Western blot结果一致(图4)。

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引言

耳鸣是指周围环境安静即无声源刺激，而患者的颅内或耳内有鸣响声的表现，或自觉有鸣响的主观感觉的听觉功能障碍^[1]。耳鸣影响人类健康，注意力无法集中睡眠困难，导致患者抑郁、焦虑、烦躁等心理，严重者致社会交往和正常生活严重干扰，甚至有自杀倾向^[2-3]。据统计耳鸣发生率为10%-18%，其中老年人群和听力障碍者更容易发生，部分人因耳鸣严重而需医治。随着人口老龄化、环境愈加嘈杂，耳鸣的发病率现逐年提升^[4-6]。因此，已成为临床上迫切需要解决而又难以攻克的顽症之一，发病的机制尚未明确，治疗方法虽多，疗效却并不理想^[7]，还需进一步深入研究。

历代中医诊治将耳鸣病机分为虚实两端，实证多因外感邪气或脏腑实火上扰耳窍而致，脏腑虚损多发虚症^[8]。中医认为虚证耳鸣以精气血不足，肾、脾虚弱为主。因肾为先天之本，主骨生髓，上通于脑，开窍于耳，肾精充则生血，化血功能健旺，肾精亏则精血无以化生；同时脾为后天之本，气血生化之源，脾胃虚弱，亦使肾精愈亏，久之则气虚血滞^[9]。据此治疗虚证耳鸣，应在补肾益气的基础上加强活血通窍的功能，即为补肾活血方。目前关于补肾活血方的药理药效及分子机制研究主要为关于膝关节骨关节炎的作用、排卵障碍不孕症、老年痴呆的防治、治疗男性精子异常型不育症的研究^[10-20]。

耳蜗损伤可导致耳鸣，而耳蜗损伤可能使感觉细胞突触同时去极化，听神经纤维的不正常放电，进而导致听觉感受发生异常，产生耳鸣^[21-22]。这种由耳蜗和听觉神经病变所致的耳鸣，可采用移植干细胞疗法。植入干细胞，使得受损的受体组织得以修复，恢复受体的部分功能。目前多用的干细胞包括骨髓基质干细胞、胚胎干细胞以及本研究所用的神经干细胞等。神经干细胞是指能够产生成年动物中枢神经系统内主要细胞类型的，能够进行自我更新的多潜能细胞^[23]。神经干细胞能分化为少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞，神经干细胞具有分化多向性的潜能，以及自我维持和自我更新的特性，又因为神经干细胞具良好的迁徙能力，易移植并能在耳蜗存活^[24-25]。良好的组织融合性使神经干细胞在移植后能迁移到神经病变部位，随即分化为特异性细胞，修复受损神经，改善耳鸣现象。

有研究报道，补肾中药有利于神经干细胞的增殖分化^[26]，还可减轻神经元损伤及促进神经细胞再生修复，实现神经功能重建^[27]。作者拟将补肾活血方和神经干细胞联用，对耳鸣大鼠进行治疗，观察其对耳部神经损伤的耳鸣大鼠的治疗效果。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验与2016年在河北省实验动物中心中完成。

1.3 材料

实验动物：①孕13-14 d SD胚胎大鼠；②SPF级雄性Wistar大鼠60只，体质量为(180±20) g，均由河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(冀)2016-1-005。自由进食，在实验动物中心中按标准进行适应性饲养。

药物：补肾活血方由葛根、黄芪、黄精、熟地、山药、山茱英、丹皮、红花、川芍、石葛蒲、陈皮、路路通、桃仁制成，上述药物均购自北京同仁堂饮片有限公司。按照成人公斤体质量的20倍折算，药方水煎液浓缩成混悬液，含药量为2.592 g/mL。

主要试剂与仪器：琼脂糖、碱性成纤维细胞生长因子购自Promega，美国；添加N-2的DMEM/F-12购自Gibco，美国；表皮细胞生长因子购自Pepro Tech，英国；生理盐水、PBS购自广州赛业生物技术有限公司；Maker购自美国Invertigen公司；β-actin(内参)、5-羟色胺抗体购自Cell Signaling Technology公司；ELISA试剂盒购自购自华美生物工程有限公司；光学显微镜购自日本Olympus公司；超低温冰箱购自美国 Forma Scientific公司；TGL-16C高速离心机购自上海安亭科学仪器厂；BS224S型精密电子分析天平购自德国SARTORIUS公司；垂直电泳仪、凝胶成像系统和酶标仪等购自购自美国Bio-rad公司。

1.4 方法

1.4.1 神经干细胞的培养 参考刘暌等^[28]的方法，取孕13-14 d的SD胚胎大鼠，取室下区细胞在含20%表皮细胞生长因子、12.5%碱性成纤维细胞生长因子和N-2添加剂的DMEM/F-12培养基中培养，细胞球体于7-10 d形成，消化后接种于预先放置经多聚赖氨酸处理的盖玻片的6孔培养板中，细胞贴壁后生长7 d，换为含体积分数10%胎牛血清培养基，继续培养7-10 d，制备成细胞浓度为1.0×10⁹ L^-¹的单细胞悬液。

1.4.2 动物分组 60只非条件反射Wistar大鼠随机等分为5组：正常对照组、模型组、补肾活血方组、神经干细胞组及联合组，各12只。

1.4.3 建立耳鸣大鼠模型 参照文献[29-30]的方法，大鼠在实验室适应性饲养1周后，禁水两三天，使动物体质量减少为原来的80%，导致动物处于干渴状态，环境始终有持续白噪音(柔和背景噪声，55 dB SPL)在特制的隔音室中训练饮水，每一次舔水都会被特殊的水管系统记录。训练过程中每当有背景白噪声中断(本底背景噪声< 20 dB SPL)，即给电刺激大鼠足部，二者交替多次，至动物在无背景噪声时饮水行为明显下降甚至停止，然后不给电刺激强化该行为，动物对安静环境恐惧的逐渐消退，于第3-5天起，大鼠均建立了稳定的条件反射，即进入条件反射消减期。在反射消减期每日给动物注射水杨酸钠，则在白噪声停止时大鼠会误认耳鸣声是部分安全信号，其条件反射消减过程快于正常对照组，造模持续时间为15 d，实验过程动物干渴时的饮水行为为非条件反射，饮水同时电刺激大鼠足底会抑制饮水动作，将无白噪声(安静)与电刺激多次交替后成为抑制饮水反应的条件反射，这样就形成无白噪声时动物中断饮水行为的抑制性条件反射，以无白噪声刺激时的观察指标为饮水抑制率(Rb)，Rb= B/(A+ B)，A为在刺激前1 min内的饮水总次数；B为在1 min持续刺激期间的饮水总次数。以Rb < 0.2为造模成功的标准，而Rb为0.5±0.1为饮水抑制消减至正常情况的标准。正常对照组大鼠每天注射生理盐水5 mL/kg。

1.4.4 药物干预 在造模15 d后开始进行药物干预。补肾活血方单组每天灌胃3 mL补肾活血方水煎液，连续7 d。神经干细胞组为造模后15 d尾静脉注射1 mL神经干细胞培养液(1.0×10⁹ L^-¹)；联合组则在造模后15 d先通过混悬液灌胃给药后再进行尾静脉注射神经干细胞培养液。

1.4.5 鼠的行为测试 喂养1周后，禁水2 d，在屏蔽室内进行条件反射建立实验，每只大鼠每天训练1次，15 min/次，在条件反射训练时大鼠有机会饮水，条件刺激为背景噪声，共出现4次，非条件反射是在背景噪声停止时，大鼠如果仍然饮水，则嘴部受到电击。条件反射期内大鼠饮水次数为B，条件反射后大鼠饮水次数为A，饮水抑制率R=B/(A+B)。当R小于0.2时，则条件反射建立，在造模及给药后，开始条件反射测试。

1.4.6 初级听皮质病理形态观察 大鼠造模15 d后进行行为测试，大鼠的行为测试结束之后，每组取3只，快速断头取脑，至于冰板上，选择大鼠颅骨表面前囟点、人字点、人字缝等解剖标志位点并确定大鼠大脑的对应部位^[30]，确认初级听皮质位置，切取初级听力皮质，用体积分数4%多聚甲醛溶液浸泡，4 ℃保存24-48 h。石蜡包埋，制成石蜡标本，备用。切取2 μm的该部位标本进行苏木精-伊红染色，观察病理结构的变化。

1.4.7 Western blot印迹检测5-羟色胺的变化 给药7 d后，每组别随机取6只大鼠，断头取脑后，置于冰板上，选择中缝背核位置的脑块，迅速转移至液氮中速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用，取出脑组织后加入预冷裂解液匀浆5 min，在冰盒中放置1 h，4 ℃离心，弃上清，然后用Bradford法检测蛋白含量，操作严格按照说明书进行，取样品30 μg总蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移，用脱脂奶粉封闭，按照实验目的加入大鼠抗体(5-羟色胺、β-actin)，低温过夜。最后用凝胶成像系统检测蛋白表达变化情况，将显影所到的条带用Quantity One软件进行分析灰度值。

1.4.8 ELISA法检测5-羟色胺含量 给药7 d后，每组随机取6只，断头取脑后，同法选取中缝背核位置，速冻后置于超低温冰箱保存备用，取出组织后用分析天平精密称重后，加入适量预冷生理盐水，低温匀浆，离心后取上清，用5-羟色胺含量测定的试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行检定5-羟色胺的含量变化。

1.5 主要观察指标 脑组织中5-羟色胺含量及初级听皮质病理形态。

1.6 统计学分析 统计软件为SPSS 13.0。所有数据均采用x(_)±s表示，采用单因素方差分析对多组间进行显著性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着人口老龄化的日渐加剧和环境越来越嘈杂，导致近年来耳鸣的发生率越来越高，耳鸣给有些人带来的痛苦和烦恼比耳聋更甚，现阶段学者认为耳鸣是一种听觉系统中异常过度放电的活动，其往往被错觉为一种声音^[32]，但临床观察和动物模型研究却较少获得其分子生物学机制的基础证据。作者参照文献[30-31]方法并加以改进，建立条件反射并用水杨酸钠造耳鸣模型，并用饮水抑制率Rb的恢复情况来评价药物的治疗效果，水杨酸钠造成的耳鸣声虽然可能和背景白噪声不完全一致，但相对于停止白噪声的绝对安静的环境，差别还是很大的，因此耳鸣大鼠不能辨别环境白噪声的变化，在白噪声中断时，饮水行为的抑制作用小于未造模的正常大鼠，即Rb的恢复至正常值0.5左右的速度会较快。然而，临床诱发耳鸣的发病机制可能有多种，以目前研究水平未能够阐明，但用饮水抑制率Rb的行为测试可以用于多种发病机制的耳鸣。

听觉系统的过度异常放电可能是由初级听皮质神经元损伤造成，有学者采用功能性磁共振和正电子发射断层成像技术研究发现^[33]，耳鸣患者的听皮质中枢神经活动显著上调，结果说明听皮质神经元在耳鸣发生过程中的重要作用，实验也采用了苏木精-伊红染色观察大鼠该部位的脑组织病理变化进行研究。

大脑中枢的5-羟色胺神经元分泌的5-羟色胺是调节神经回路的中药单胺类递质，5-羟色胺参与了多种生理过程的调控作用，其中包括认知，感知、情绪和生理周期，它们主要集中在后脑中缝一个狭窄区域中，称中缝背核。 5-羟色胺对神经元的发育形成也有重要的作用^[34，大量的基础研究和临床研究发现，耳鸣的发生与5-羟色胺的功能有关^[35-36]。

补肾活血中药可通过调节神经内分泌免疫网络发挥抗应激性损伤的作用，有利于神经干细胞的增殖分化，还可减轻神经元损伤及促进神经细胞再生修复，实现神经功能重建，故补肾活血方可能是起药效活性的重要部分，而拟采用神经干细胞给药是希望通过增加神经干细胞的修复作用及增加其分化为初级听皮质神经元，与补肾活血方相辅相成，改善神经元损伤的耳鸣症状。

实验用水杨酸钠耳鸣模型来观察补肾活血方和神经干细胞移植对大鼠耳鸣的作用，结果显示，各组大鼠在饮水抑制条件反射形成时候的Rb值均在0.2左右，恢复至约0.5的时间需要4 d以上，而模型组大鼠Rb值恢复至0.5的时间远短于正常对照组，补肾活血方组、神经干细胞组和联合组大鼠Rb恢复至正常水平的速度有不同程度减缓，为联合组<补肾活血方组<神经干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)；初级听皮质病理形态观察结果显示，模型组大鼠初级听皮质的神经元细胞不规则，部分出现皱缩，毛细血管弯曲变形，细胞膜成空泡状；而各治疗组神经元细胞病理状态减轻程度不同，联合组的神经细胞病理形态改善明显优于神经干细胞组，且形态接近正常对照组，说明该组治疗效果明显。Western blot结果显示补肾活血方和/或神经干细胞干预后5-羟色胺表达水平较模型组有所上调，且补肾活血方组与联合组结果均强于神经干细胞组，其中联合组结果与正常对照组接近；ELISA测定结果与Western blot结果一致。

终上所述，补肾活血方联合神经干细胞对于治疗水杨酸钠的耳鸣大鼠模型有显著疗效，中药复方研究也可以借鉴西药的研究方法加以改进，相互结合，不管是临床研究，还是实验动物动物体内药效学和耳鸣模型实验研究均表明，补肾活血方治疗耳鸣的机制是多方面的，通过改善微循环、抗疲劳作用、耐缺氧、增强免疫功能、抗应激、恢复5-羟色胺含量和修复神经元等环节达到治疗耳鸣的目的，丰富了治疗耳鸣基础研究的实验数据同时也为临床研究提供一定的参考价值。