肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因沉默CD24-CD44+人喉鳞癌干细胞生物学特性的改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
干细胞自我更新：自我更新是干细胞典型的特性，其主要反映干细胞在动态环境中维持自我稳定的能力。其在分化过程中，可通过不对称分化，一个细胞分化为次级细胞；另一个细胞分裂为与母代细胞相同的细胞。
肿瘤坏死因子受体相关蛋白1：是热休克蛋白90家族内一重要的成员。正常表达肿瘤坏死因子受体相关蛋白1可抵御氧化损伤所致的细胞凋亡以及维持线粒体结构与功能的稳定。

摘要
背景：肿瘤坏死因子受体相关蛋白1的异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关。因此靶向抑制肿瘤坏死因子受体相关蛋白1的表达成为治疗或干预肿瘤生长的重要靶点。
目的：观察肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因沉默对人喉鳞癌干细胞生长及凋亡的影响。
方法：采用流式细胞技术特异性分离出CD24^-CD44⁺喉鳞癌干细胞。设计及合成肿瘤坏死因子受体相关蛋白1的siRNA序列，脂质体TM2000转染CD24^-CD44⁺喉鳞癌干细胞。流式细胞仪、MTT实验、细胞克隆形成实验、TUNEL凋亡实验评价沉默肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因对CD24^-CD44⁺喉鳞癌干细胞增殖、凋亡的影响。
结果与结论：①相关因子表达：相比于CD24⁺CD44^-的人喉鳞癌细胞，CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞内干性基因OCT4，SOX2，NANOG，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1的表达均上调(P < 0.05)。RNA干扰后，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1的表达显著降低(P < 0.05)；②细胞周期及增殖：肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因沉默后人喉鳞癌干细胞的生长速度明显减慢(P < 0.05)，细胞停滞在G₀/G₁期，在S期细胞数减少(P < 0.05)，M期细胞无明显变化。肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因沉默后人喉鳞癌干细胞的增殖受到明显的抑制(P < 0.05)；③细胞克隆形成能力：相比于未经转染的人喉鳞癌干细胞，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因沉默后人喉鳞癌干细胞克隆形成能力显著下调(P < 0.05)；④细胞凋亡：相比于未经转染的人喉鳞癌干细胞，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因沉默后人喉鳞癌干细胞的凋亡基因BAD及BAX表达上调(P < 0.05)；⑤结果表明，特异性干扰肿瘤坏死因子受体相关蛋白1基因表达可抑制人喉鳞癌干细胞增殖并促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6659-4388(薛海涛)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肿瘤坏死因子受体相关蛋白1, 人喉鳞癌, 化疗耐药, 基因沉默, 细胞数量, 克隆形成, 细胞增殖, 细胞凋亡, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Studies have indicated that the abnormal expression of tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1) is closely related to the occurrence and development of a variety of tumors. Therefore, targeted inhibition of TRAP1 expression has become an important target for the treatment or intervention of tumor growth.
OBJECTIVE: To explore the effect of the TRAP1 gene silencing on the proliferation and apoptosis of human laryngeal squamous cell carcinoma stem cells.
METHODS: CD24^-CD44^- human laryngeal squamous cell carcinoma stem cells were isolated by flow cytometry. Interfering RNA (siRNA) sequences for small molecule TRAP1 gene was designed and transferred into human laryngeal cancer stem cells by Lipofectamine^TM 2000. Flow cytometry, MTT assay, cell clone formation assay and TUNEL apoptosis assay were used to evaluate the effect of silencing TRAP1 gene on the proliferation and apoptosis of CD24^-CD44⁺ laryngeal cancer stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with CD24⁺CD44^- cells, CD24^-CD44⁺ cells upregulated OCT4, SOX2, NANOG and TRAP1 expression levels (P < 0.05). However, the expression of TRAP1 protein in human laryngeal squamous cell carcinoma was significantly decreased after RNA interference (P < 0.05). The growth rate of TRAP1 gene silenced human laryngeal squamous cell carcinoma was significantly reduced (P < 0.05), the cell arrest was in the G₀/G₁ phase, the number of cells in the S phase was decreased (P < 0.05), and there was no significant change in the M phase. TRAP1 gene silencing significantly inhibited the proliferation of human laryngeal squamous cell carcinoma stem cells (P < 0.05). Compared to the non-transfected cells, the TRAP1 gene silencing significantly reduced the clone formation ability of transfected human laryngeal squamous cell carcinoma stem cells (P < 0.05), and TRAP1 gene silenced-human laryngeal squamous cell carcinoma stem cells were more easy to trigger apoptosis by upregulating BAD and BAX expression levels (P < 0.05). Overall, our experimental results indicate that the specific interference of TRAP1 gene expression could inhibit the proliferation and promote apoptosis of human laryngeal squamous cell carcinoma stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Laryngeal Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Cell Proliferation, Apoptosis, RNA, Small Interfering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

2.1 人喉鳞癌干细胞的分离及筛选 体外培养人喉鳞癌细胞，待细胞处于生长对数期时，胰酶消化为单细胞生长体系，流式细胞筛选出CD24^-CD44⁺的人喉鳞癌细胞。为进一步鉴定上述细胞的干细胞特性，采用Western blot实验检测了与干性相关基因(OCT4，SOX2及NANOG)的表达。结果显示，相比于CD24⁺CD44^-的人喉鳞癌细胞，CD24^-CD44⁺人喉鳞癌细胞内OCT4上调(9.0±1.1)倍，SOX2上调(6.0±1.2)倍，NANOG上调(4.0±0.6)倍(P < 0.05；图1)。以上结果提示，实验已成功建立体外人喉鳞癌干细胞培养体系。

采用Western Blot检测TRAP1在CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞和CD24⁺CD44^-人喉鳞癌细胞中的表达情况。结果显示，相比于非肿瘤干细胞，CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞中TRAP1蛋白的表达明显上调(8.1±1.2)倍(P < 0.05；图2)。

2.2 siRNA抑制人喉鳞癌干细胞TRAP1表达 Western Blot实验结果显示，RNA干扰后，人喉鳞癌干细胞内TRAP1蛋白表达显著降低(图3)。

2.3 siRNA对人喉鳞癌干细胞周期的影响 与对照组(未转染组)比较，TRAP1基因沉默后人喉鳞癌干细胞的生长速度明显减慢，细胞停滞在G₀/G₁期，在S期细胞数减少(P < 0.05)，M期细胞无明显变化，见表1。

2.4 siRNA对人喉鳞癌干细胞增殖的影响 TRAP1基因沉默后人喉鳞癌干细胞的增殖受到明显的抑制，与对照组(未转染组)比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.5 siRNA对人喉鳞癌干细胞克隆形成能力的影响 相比于未经转染的人喉鳞癌干细胞，TRAP1基因沉默后人喉鳞癌干细胞克隆形成能力显著下调(图4A)。为进一步探究TRAP1对人喉鳞癌干细胞自我更新能力影响的具体机制，采用Western blot实验结果显示，相比于未经转染的人喉鳞癌干细胞，TRAP1基因沉默后人喉鳞癌干细胞内OCT4，SOX2，NANOG表达下调(图4B)。

2.6 siRNA对人喉鳞癌干细胞凋亡的影响 TUNEL法实验结果显示，相比于未经转染的人喉鳞癌干细胞，TRAP1基因沉默后人喉鳞癌干细胞更易于凋亡(图5A)。Western Blot实验结果显示，相比于未经转染的人喉鳞癌干细胞，TRAP1基因沉默后人喉鳞癌干细胞内凋亡基因BAD及BAX表达上调(图5B)。以上研究显示，TRAP1可促进人喉鳞癌干细胞凋亡。

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引言

喉癌是影响世界居民健康的一重要呼吸道恶性肿瘤^[1]。随着目前经济的发展，空气污染的日益加重，该疾病发病率呈现明显的上升趋势。喉癌患者临床症状不典型，大多患者意识到呼吸声音的变化，多以进展致晚期^[2]，因肿瘤已扩散至远处器官，大多已丧失了最佳手术治疗时机^[3]。因此，化疗成为其主要的治疗手段。然而，随着化疗的进展，多数患者可出现化疗耐药^[4-5]。换言之，患者对化疗药物的敏感性显著降低。因此，寻找合理有效降低化疗耐药的手段，具有重要临床意义。

肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1，TRAP1)是热休克蛋白90家族内一重要的成员^[6]。正常表达TRAP1可抵御氧化损伤所致的细胞凋亡以及维持线粒体结构与功能的稳定^[7]。多项研究显示，异常表达TRAP1与多种肿瘤的发生与发展密切相关^[8]，包括肺癌、喉癌、鼻咽癌等^[9]。高表达TRAP1可促进肿瘤细胞增殖，并提高其侵袭与转移的能力^[10]。特异性干预TRAP1的表达可显著降低癌细胞的恶性程度。

肿瘤干细胞是肿瘤细胞内部的一类特殊的群体，具有多向分化及自我更新能力，是肿瘤发生与发展、化疗耐药及复发的重要因素。研究显示，顺铂干预体外培养的喉癌干细胞呈现较强耐药能力，并且体内裸鼠成瘤再给予化疗处理，结果显示该区域细胞呈现较强干性^[11-12]。扰乱维持肿瘤干细胞自我更新的信号通路和微环境，或诱导肿瘤干细胞的分化，或针对肿瘤干细胞所表达的区别于正常干细胞的表面标志的靶向治疗都是可行的策略^[13]。但未针对肿瘤干细胞的靶向治疗，未有研究显示具有显著的靶向特性^[14-17]。因此，实验结合TRAP1在喉癌中表达的特异性以及肿瘤干细胞在肿瘤发生发展中扮演的重要角色，通过观察TRAP1基因沉默对人喉鳞癌干细胞生长及凋亡的影响，为喉癌的治疗提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞分子生物学实验

1.2 时间及地点 实验于2015年12月至2016年8月在河北医科大学第一医院耳鼻喉科实验室完成。

1.3 材料 人喉鳞癌细胞株(TU212)购买于美国ATCC公司。

1.4 方法

1.4.1 应用流式细胞仪分选喉鳞癌干细胞 人喉鳞癌细胞常规培养、传代至细胞数量为(1.0-2.0)×10⁷个，消化后用PBS冲洗2次，然后用PBS重悬细胞，加入CD24，CD44抗体，在4 ℃条件下孵育30 min。之后取出试管，用500 μL PBS重悬细胞，上流式分选仪分选CD24^-CD44⁺人喉鳞癌细胞和CD24⁺CD44^-的人喉鳞癌细胞，将收集的细胞继续培养。

1.4.2 Western blot实验检测干性相关基因(OCT4，SOX2及NANOG)和TRAP1蛋白的表达 收集培养细胞，PBS洗涤，裂解液裂解细胞获得总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。采用15%SDS凝胶进行电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗免抗人单克隆抗体(OCT4，SOX2，NANOG，TRAP1，BAD及BAX；1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，ECL化学发光显色，GAPDH作为内参，凝胶成像系统拍照成像。

1.4.3 siRNA的设计、合成及细胞转染 设计的TRAP1基因的siRNA序列由美国Santa Cruz公司合成。TRAP1的siRNA序列：正义链：5’-GAC TGG ACC TGA GTT ACG TCA TTC AAT AAA CCT GAA GTT CCT TAC TAT ATG TCC TTT TTT G-3’；反义链：5’-CTG ACT ATA AAG AAG CCA AGG AAG TTG TTC TCT CTT CAA GGA ATG ACG TAC ACG TGG CTC C-3’，片段长度178 bp。

选择对数生长期的CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞，PBS洗涤，加入胰蛋白酶消化，离心弃上清，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，并将细胞浓度调整到2×10⁸ L^-¹，接种6孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中，当细胞浓度达50%时，弃去旧培养液，按照说明书操作，利用脂质体法(Lipofectamin^TM 2000)将TRAP1基因的siRNA瞬时转染至细胞中，于转染后48 h进行采用Western Blot实验检测RNA干扰效应。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞周期 于转染48 h后收集生长状态良好的CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞，4℃预冷的PBS冲洗2 次，加入4 ℃预冷的体积分数70%无水乙醇固定24 h，洗涤细胞，PBS重悬，调整细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，加入质量浓度50 mg/L RNA 酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)孵育30 min，加入含RNase的碘化丙啶染液，4 ℃暗室中放置1 h，流式细胞仪检测细胞的DNA含量，计算各周期细胞的百分比，实验重复进行3次。

1.4.5 MTT法检测细胞增殖能力 于转染48 h后收集生长状态良好的CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞接种于96孔培养板中，每孔200 μL，设置空白对照组(仅加培养基)，培养1，3，5，7 d，每孔中加入质量浓度5 g/L MTT溶液20 μL，常温培养4 h，小心吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min使结晶物充分溶解，酶标仪上测定紫外线490 nm波长处各孔吸光度值。

1.4.6 平板克隆形成实验 将上述分离的CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞接种于6孔培养板中，每孔1 000个细胞，轻轻摇晃培养板，保证细胞分散均匀，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养2周，待出现细胞克隆时终止培养，弃去培养液，采用D-Hank’s液冲洗2次，苏木精染色15 min，流水洗去染液，在显微镜下观察计数> 50个细胞的细胞克隆。

克隆形成率=(形成克隆数/接种细胞数)×100%。

1.4.7 TUNEL法检测细胞凋亡 于转染48 h后收集生长状态良好的CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞，进行细胞爬片，吸弃培养液，自然晾干后用40 g/L多聚甲醛溶液固定，经新鲜配制体积分数3%H₂O₂室温处理，体积分数0.1% Triton X-100(溶于体积分数0.1%枸橼酸钠溶液)打孔，按TUNEL试剂盒步骤说明操作，DAB显色，苏木精轻度复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，再以中性树胶封固，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.4.8 Western blot检测凋亡相关基因BAD及BAX的蛋白表达 于转染48 h后收集生长状态良好的CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞，PBS洗涤，裂解液裂解细胞获得总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。采用15%凝胶进行SDS电泳，PVDF膜转膜，体积分数5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗免抗人单克隆抗体(BAD及BAX；1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，ECL化学发光显色，GAPDH作为内参，凝胶成像系统拍照成像。

1.5 主要观察指标 CD24^-CD44⁺人喉鳞癌干细胞内干性基因OCT4，SOX2，NANOG，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1的表达；各组细胞周期及增殖情况，细胞克隆形成能力变化及细胞凋亡情况。

1.6 统计学分析 研究数值均用Graph Pad 6.0软件，计量资料用x(_)±s表示，不同组别间数据比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

喉癌是呼吸道常见的恶性肿瘤，其症状不典型极大限制了喉癌患者的早期治疗与干预，也很大程度上降低了喉癌患者的预后情况。针对中晚期喉癌患者，化疗是其主要的治疗手段。然而，随着患者化疗时间、次数的延长，多数患者逐渐出现耐药，极大的限制了患者的临床治疗^[14-15]。因此，寻找合理有效干预手段具有重要意义。

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的很少一部分具有干细胞性质的细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力，是肿瘤发生与扩散的根源^[18-20]。经过许多研究，人们已经在人类耐药肿瘤细胞中，发现一些膜蛋白高表达，作为药物大量出泵，可以导致细胞内的细胞毒药物浓度降低，使肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物产生耐药^[21-24]。为了对肿瘤干细胞进行深入研究，国内外学者进行了一系列肿瘤干细胞的分离鉴定，检测方法主要有细胞表面标志方法，球形培养方法，SP分析法等^[25-26]。实验确定喉鳞癌细胞中存在细胞表型CD24^-CD44⁺，采用Western Blot实验检测了与干性相关基因(OCT4，SOX2及NANOG)的表达上调。以上结果提示，实验已成功建立体外人喉鳞癌干细胞培养体系。

按照化疗耐药的驱使条件，可分为固有耐药和非固有耐药。固有耐药指患者个体对某种化疗药物呈现低敏感性，这可能与患者自身细胞上低表达特定受体有关。非固有耐药，也称可诱导耐药。即患者随着某种药物处理时间的延长，敏感性逐渐降低，这可能与肿瘤细胞内部自身适应性变化相关。针对喉癌化疗耐药，多数为非固有耐药。肿瘤靶向治疗即在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点设计相应的治疗药物，使肿瘤干细胞特异性死亡，而对肿瘤周围正常细胞没有影响。TRAP1就是这样一个特异的致癌位点，研究表明，TRAP1的异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，并且TRAP1在这些肿瘤中均表达上调^[27-28]。因此靶向抑制TRAP1的表达成为用于治疗或干预肿瘤生长的重要靶点^[29]。TRAP1是线粒体热休克蛋白90家族的主要成员^[30-40]。成熟的TRAP1蛋白含有645个氨基酸，并且包含ATP结合区域，在此区域ATP以特殊的构象与 γ-磷酸基团相结合，进而发挥作用。TRAP1的主要功能包括：①通过阻止受损蛋白解折叠和促进变性蛋白重折叠过程，调节活性氧族，抑制其产生，从而在氧化应激状态下维持线粒体的完整和功能；②参与对线粒体凋亡通路的双重调控；③参与调控线粒体呼吸与有氧糖酵解之间的代谢转化。多项研究显示，肿瘤细胞增殖、侵袭与转移能力与TRAP1异常表达引起细胞内部氧化损伤修复异常相关。

实验检测沉默TRAP1基因人喉鳞癌干细胞的生物学特性改变。结果显示，RNA干扰后，人喉鳞癌干细胞内TRAP1蛋白表达显著降低。通过MTT增殖实验检测了人喉鳞癌干细胞的增殖情况，其结果表明，人喉鳞癌干细胞的增殖受到了明显的抑制。对细胞周期的检测结果显示，人喉鳞癌干细胞的生长速度有明显减慢，细胞的周期被阻滞在G₀/G₁期，S期的细胞数目也有减少。相比于未经转染的人喉鳞癌干细胞，TRAP1基因沉默后人喉鳞癌干细胞克隆形成能力显著下调，凋亡细胞明显增多。

综上所述，沉默TRAP1基因可影响人喉鳞癌干细胞的增殖和促进其凋亡，提示TRAP1基因可能直接或间接地参与到人喉鳞癌干细胞周期的调控和凋亡过程。因此，TRAP1基因有望成为喉鳞癌的新的治疗靶点。