壳聚糖/羟基磷灰石骨复合支架修复关节软骨损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
壳聚糖：是人体中相对比较少见的一种碱性多糖，它是甲壳素的脱乙酰化产物，在自然界中储量较丰富，价格廉价，具有良好的生物相容性，能够有效促进细胞增殖和黏附。同时，壳聚糖本身的生物性能也能够促进伤口愈合，是骨组织修复的理想材料。
羟基磷灰石：是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机组成成分，人的牙釉质中羟基磷灰石的含量约96%，骨头中也约占到69%。羟基磷灰石具有优良的生物相容性和生物活性，并可作为一种骨骼或牙齿的诱导因子，在口腔保健领域中对牙齿具有较好的再矿化、脱敏以及美白作用。

背景：壳聚糖/羟基磷灰石复合支架在结构上与天然骨十分类似，具有良好的生物学性能，能够发挥不同材料的性能。
目的：观察壳聚糖/羟基磷灰石复合支架修复关节软骨损伤的效果。
方法：取30只新西兰大白兔，制作左侧膝关节软骨缺损模型，随机分2组，实验组与软骨缺损处置入壳聚糖/羟基磷灰石复合支架，对照组置入透明质酸钠凝胶。置入后4，8，12周，取软骨损伤组织进行组织学观察。
结果与结论：①组织学Wakitani与Mankin评分：实验组置入后4，8，12周Wakitani评分显著高于对照组(P < 0.05)，置入4，12周的Mankin评分显著低于对照组(P < 0.05)；②番红-O染色：置入后4周，对照组软骨细胞表面存在明显的褶皱状小突起，细胞相对不规则；实验组软骨细胞表面存在轻微的褶皱状小突起，细胞核略大，排列相对有序。置入后8周，对照组软骨细胞表面存在褶皱状小突起，细胞排列欠规则；实验组软骨细胞表面存在褶皱状小突起，细胞核较大，排列规则；置入后12周，对照组软骨细胞表面存在褶皱状小突起，细胞核变大，排列基本有序；实验组软骨细胞表面无褶皱状小突起；细胞核变大，排列规则；③结果表明：壳聚糖/羟基磷灰石复合支架可促进关节软骨损伤的修复。

ORCID: 0000-0002-7870-7909(刘洪亚)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 壳聚糖, 羟基磷灰石, 复合支架, 运动型关节软骨损伤

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the chitosan/hydroxyapatite composite scaffold with good biological performance is very similar to natural bone in structure, and plays the performance of different materials.
OBJECTIVE: To observe the repairing effect of chitosan/hydroxyapatite composite scaffold on articular cartilage injury.
METHODS: Thirty New Zealand white rabbits were selected to make articular cartilage injury on the left knee, and then model rabbits were randomly divided into sodium hyaluronate gel group (control group, n=15) and chitosan/hydroxyapatite composite scaffold group (experimental group, n=15). At 4, 8, 12 weeks after scaffold implantation, cartilage tissues were taken out and observed histologically.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the experimental group showed higher Wakitani scores at 4, 8, 12 weeks, but lower Mankin scores at 4 and 12 weeks after implantation (both P < 0.05). Safranin-O staining results showed that at 4 weeks after implantation, chondrocytes arranged relatively in disorder with overt pleated small projections in the control group, while chondrocytes were well aligned with slightly pleated small projections and slightly large nuclei in the experimental group; at 8 weeks, chondrocytes arranged irregularly with pleated small projections in the control group, while in the experimental group, the chondrocytes arranged orderly with pleated small projections and large nuclei; at 12 weeks, the chondrocytes in the control group exhibited a substantially ordered arrangement with pleated small projections and large nuclei, while in the experimental group, the chondrocytes arranged in order with no pleated small projections but with large nuclei. All these findings indicate that chitosan/hydroxyapatite composite scaffold can promote articular cartilage repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydroxyapatites, Chitosan, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘洪亚. 壳聚糖/羟基磷灰石骨复合支架修复关节软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 244-248.

Liu Hong-ya. Chitosan/hydroxyapatite composite scaffolds for articular cartilage injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 244-248.

图/表（结果） 3

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引言

组织工程是近年来刚刚兴起的一门学科，它是运用生命科学和工程学的原理及方法，研究并开发运用于修复、维护机体各种组织或器官损伤后的功能及形态的替代物。关节软骨损伤是临床上常见的骨科疾病，该疾病在运动员中发生率较高^[1-7]。目前，关节软骨损伤的修复方法包括：关节镜下灌洗清理、多种骨髓刺激等，这些方法均能够促进软骨损伤的修复，但这些方法各有优缺点，且使用时均受到很大限制。组织工程学修复关节软骨在实验中得到应用，但是支架的选择尚存在较大争议。理想的支架应该具备以下性能：生物相容性较好^[8-10]；具有合适的降解性，能够与机体组织细胞的生长率相互适应；具备三维多孔结构，修复后能够促进缺损创面愈合；具有良好的生物机械性能和可塑性。

为了进一步促进受损组织修复，很多学者对细胞移植进行了大量实验，利用多孔人造细胞外基质或支架作为缺损组织的修复材料。但材料的性能、形态等又由支架的制备方法决定^[12]。通常而言，支架应该具备良好的高孔隙率和空隙贯通性，能够实现营养物质的运用和废弃物的转移^[9]。因此，运动性关节软骨损伤修复过程中除了选择合适的材料外，还应该选择适当的支架修复方法。

壳聚糖是人体中相对比较少见的一种碱性多糖，它是甲壳素的脱乙酰化产物，在自然界中储量较丰富，价格廉价，具有良好的生物相容性，能够有效促进细胞增殖和黏附^[10-12]。同时，壳聚糖本身的生物性能也能够促进伤口愈合，是骨组织修复中的理想材料。

羟基磷灰石是动物硬组织的主要无机组成成分，具有较高的生物活性和生物相容性。壳聚糖/羟基磷灰石复合支架由于结构上与天然骨十分类似，具有良好的生物学性能，能够发挥不同材料的性能^[13-14]。但是，壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法及其在关节软骨损伤中运用的报道较少^[15-16]。

实验选择30只新西兰大白兔建立模型，观察壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法及其在运动型关节软骨损伤中的应用效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比动物观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至9月在山东省医学高等专科学校实验室完成。

1.3 材料

实验动物：选取1-6月龄新西兰大白兔30只，体质量1.53-2.40 kg，平均(1.86±0.11) kg，雌雄随机，由山东省医学高等专科学校动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(新) 2003-0001。对新西兰大白兔进行等条件喂养，标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮水，动物室恒温，温度20-25 ℃，相对湿度为20%- 25%^[17-20]。将30只新西兰大白兔随机分为对照组(n=15)和实验组(n=15)。

复合支架修复关节软骨损伤实验的主要仪器和试剂：青霉素钠注射液(80×10⁴ U)(新疆制药厂)；苏木精、伊红染液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；SP免疫组化试剂盒(华北制药有限公司)；常规手术器械(上海医疗器械厂)；专业动物实验台(中科院上海细胞所)；生物组织石蜡包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术研究所)；透明质酸钠凝胶(常州药物研究所有限公司)。

1.4 实验方法

壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备：①将壳聚糖溶于0.5%-1.5%的醋酸水溶液中，获得0.5%-2%的壳聚糖溶液，再将其与2%-9%的磷酸水溶液按质量比(0.25-0.4)∶(0.353-0.55)的比例充分混合均匀，将其在搅拌下滴加到浓度为1%-3%氢氧化钙悬浊液中，获得混合液，壳聚糖与氢氧化钙的质量比为(0.25-0.4)∶(0.444-0.555)，滴加完后搅拌2.0-3.0 h，静置24 h获得羟基磷灰石/壳聚糖前驱液；②将羟基磷灰石/壳聚糖前驱液放入透析袋中浸泡8-24 h，获得纤维状羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料；③将纤维状羟基磷灰石/壳聚糖复合浆料加水洗涤或用水透析漂洗，过滤至中性后干燥，将其放置在90-120 ℃、压力100-200 MPa下成型，获得壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料。

新西兰大白兔建模及处理方法：取30只新西兰大白兔，采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，在无菌操作下对左前膝关节内侧切口，并逐层分离切开皮下组织，充分暴露关节囊，将髌骨导向外侧脱位，充分暴露内侧踝关节面，并采用电动手钻在股骨内侧踝中心钻出直径为3.5 mm、深度为3 mm的孔，建立软骨全层损伤模型^[21-22]。待新西兰大白兔止血完成且对其缺损部位进行冲洗、清理后，对照组在缺损部位置入透明质酸钠凝胶，实验组在缺损部位置入壳聚糖/羟基磷灰石复合支架。术后，将新西兰大兔送回笼中，自由饮食、活动，且对每只新西兰大白兔从手术起每天肌肉注射80×10⁴ U青霉素钠，1次/d，连续注射3 d，预防损伤部位发生感染^[23-24]。

1.5 主要观察指标

大体观察：术后常规饲养，观察两组新西兰大白术后4周兔活动情况、行走及活动是否受限，术后并发症等。

组织学观察：置入后4，8，12周，每周各处死5只兔，获得生物标本，利用体积分数10%甲醛溶液固定，并进行硝酸脱钙、冲洗、石蜡包埋，对组织进行纵向切片，切片厚度4 µm，行0.1%番红-O染色，光镜下观察运动性软骨损伤修复情况^[25-26]。

Wakitani评分：对两组兔置入后4，8，12周进行Wakitani评分。Wakitani评分总共包括5部分，即细胞形态、基质染色(异染性)、表面规则、软骨厚度及填充体、周围软骨结合度5部分，每部分最高4分，最低0分，总分20分，得分越高修复效果越好^[27]。

Mankin评分：对两组兔置入后4，8，12周进行Mankin评分。Mankin评分标准分为3期：Ⅰ期(早期)，总分0-8分；Ⅱ期(中期)，9-5分；Ⅲ期(晚期)，16-20分；得分越高修复效果越差^[27]。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示经比较两组数据间存在统计学差异。

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讨论

近年来，随着中国现代医学的不断发展，运动医学也得到不断发展，很多组织工程学技术和方法均被运用于运动损伤中，这些方法中以关节软骨运动型损伤最为突出。膝关节软骨损伤以关节面软骨和半月板等为主^[28-29]。传统的治疗方法主要以摘除、关节融合或关节置换为主，这些方法虽然能够改善患者症状，但治疗预后较差，容易影响运动员的运动成绩。因此，临床上一直尝试运用其他方法对运动性关节软骨损伤进行治疗^[30-31]。

羟基磷灰石是临床上使用较多的修复材料，该材料与天然骨十分相似，结构为六方晶体系结构。目前，临床上对于羟基磷灰石的制备方法较多，常见的包括固相反应法和湿法等，固相反应法的优势是更加符合化学计量，获得的材料结晶相对完整，但这种制备方法需要长时间混磨，反应速度也比较慢，产物粒径也比较大；水热合成法的优点是能够够获得的产品的结晶度较高，钙磷比更加接近化学计量比。同时，羟基磷灰石具有较高的生物活性、生物相容性和生物可降解性^[32]。将该材料用于关节软骨损伤中修复效果理想，能促进损伤部位愈合，促进机体关节恢复。实验中，30只兔均存活，对照组兔关节稍有粘连，滑囊出现轻度充血、水肿，缺损修复部位和周围软骨之间界限清晰，但修复区域低于周围软骨高度，凹陷明显；实验组缺损修复区域平坦，表面也比较光滑，且与周围正常软骨开始融合，光泽度较好。有研究结果显示，骨细胞在羟基磷灰石固化体上培养 7 d后分泌比较旺盛，具有良好的生长性^[33]。

壳聚糖也是临床上使用较多的一线材料，是自然界中比较罕见的带正电荷的碱性多糖，属于甲壳素的脱乙酰化合物，在自然界中的储量相对比较丰富，成本也相对比较低廉，再加上材料本身不具有毒性，具有良好的生物相容性，能够有效促进细胞的增殖与黏附^[34]。此外，壳聚糖本身的生物性能也能够有效促进伤口的愈合。目前，壳聚糖在生物医学组织工程中得到广泛应用，如药物载体、离子吸附剂等，将其用于运动关节损伤中能增强细胞的黏附作用，改善机体关节功能。实验中，实验组置入后4，8，12周的Wakitani评分显著高于对照组(P < 0.05)。

壳聚糖/羟基磷灰石骨复合支架属于是一种新型的材料，这种复合材料在结构上与天然骨更加接近，具有更加优良的生物学性能。实验中，两组置入后8周的Mankin评分差异不显著(P > 0.05)；实验组置入后4，12周的Mankin评分显著低于对照组(P < 0.05)。纳米羟基磷灰石复合材料比相应的微米复合材料具有更加优良的生物学性能，并且复合材料的组成、结构和工艺等能够获得与天然骨更加匹配、适合的符合材料。临床上，将壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料运用于关节软骨损伤修复中效果理想，能够发挥两种不同材料优势，且材料制备方法相对简单，能够促进缺损部位早期恢复^[35]。实验中，实验组软骨细胞表面呈现褶皱状小突起，软骨细胞细胞核略大，核小体多，排列有序，且游离的核糖体较多；对照组细胞表面有褶皱状小突起，软骨细胞核不规则，线粒体数量较少。

综上所述，壳聚糖/羟基磷灰石复合支架材料结构与天然骨十分相似，在关节软骨损伤修复中效果理想，具有骨传导性和成骨诱导能力，可促进损伤关节早期恢复，具有较高的临床应用价值。

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