猪脱细胞真皮与人表皮干细胞构建组织工程皮肤修复全层皮肤缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.012

摘要/Abstract

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文题释义：
猪脱细胞真皮结构：利用猪等身上的胶原蛋白制成，去除表皮及真皮内的细胞成分，保留正常的胶原纤维组织和基底膜等细胞外间质成分。这种无细胞真皮无免疫原性，完整保留了各种基底膜成分，且可提供近接近正常结构的真皮替代，有利于细胞的生长，是一种十分理想的支架材料。
组织工程皮肤：由表皮层和真皮层两部分组成，表皮层主要是利用人体干细胞培养出的皮肤组织。患者换肤后，人工皮肤会与自身皮肤融合并再生长。通过换肤，患者在避免自体取皮的同时，能修复皮肤创伤，重建功能。为此，在组织工程皮肤的构建过程中需要使用一定的种子细胞和真皮层支架材料。

背景：目前已有应用蚕丝蛋白、结缔细胞、生物高分子材料、合成高分子材料、纳米材料、传感器制成的生物人造皮，以及非生物人造皮，应用于临床试验都取得了良好效果，但它们与真正皮肤相比还有很大差距。
目的：观察表皮干细胞/猪脱细胞真皮组织工程皮肤修复大鼠全层皮肤缺损的效果。
方法：取20只SD大鼠，建立背部皮肤缺损模型，随机分为2组，实验组于皮肤缺损处植入人表皮干细胞-猪脱细胞真皮组织工程皮肤，对照组植入猪脱细胞真皮。植入后4周，进行大体、组织学和免疫组织化学观察。
结果与结论：①大体观察：实验组创面愈合良好，皮肤弹性佳；对照组移植区域呈现瘢痕愈合，触之质地偏硬；②组织学观察：两组在镜下均可见良好的表皮和真皮结构，表皮可明显区分为基底层、棘层和角化不全的角质层，与实验组相比，对照组可见较多纤维结缔组织；③免疫组织化学观察：实验组愈合创面抗人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原呈现阳性，对照组愈合创面抗人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原呈阴性；④结果表明：人表皮干细胞/猪脱细胞真皮组织工程皮肤修复动物全层皮肤缺损，可有效抑制瘢痕形成及挛缩。

ORCID:0000-0002-8011-4467(钱李科)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 皮肤缺损, 修复, 干细胞, 人表皮干细胞, 组织工程皮肤

Abstract:

BACKGROUND: Biological artificial skin made by fibroin, connective tissues, biopolymer materials, synthetic polymeric material, nano materials as well as sensor and non-biological artificial skin both have achieved satisfactory effects in clinical trials, but there is still a significant difference from the natural skin.
OBJECTIVE: To investigate the treatment outcomes of epidermal stem cells/porcine acellular dermal tissue-engineered skin for full-thickness skin defects in rats.
METHODS: Twenty Sprague-Dawley rats were selected to make the skin defect model on the rat back, and then randomly divided into experimental and control groups, followed by subjected to the implantation of human epidermal stem cells/porcine acellular dermal tissue-engineered skin and porcine acellular dermal matrix, respectively. Gross, histological and immunohistochemical observations were performed at 4 weeks after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Gross observation: the wound in the experimental group healed well, and the skin had good elasticity; the control group showed scar formation in the implanted site and the texture was hard. Histological observation: there were good epidermal and dermal structures under microscope in both groups, and the basal layer, stratum corneum and stratum corneum of the epidermis could be distinguished clearly. Compared with the experimental group, more fibrous connective tissue could be found in the control group. Immunohistochemical observation: the wound surface in the experimental group was positive for the anti-HLA class I antigen, while the wound surface in the control group negative for the anti-HLA class I antigen. These findings suggest that the human epidermal stem cells/porcine acellular dermal tissue-engineered skin can effectively inhibit the scar formation and contracture in the repair of full-thickness skin defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Skin Transplantation, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

钱李科，钱明元. 猪脱细胞真皮与人表皮干细胞构建组织工程皮肤修复全层皮肤缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 227-231.

Qian Li-ke, Qian Ming-yuan.

Treatment outcomes of human epidermal stem cells/porcine acellular dermal tissue-engineered skin in the repair of full-thickness skin defects

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 227-231.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 20只大鼠均进入结果分析，未出现死亡或脱失。

2.2 人表皮干细胞培养与鉴定结果人表皮干细胞培养 4 h 后，大部分细胞均发生贴壁，呈三角形或多边形，胞体小，核质比大(图1A)；连续培养3 d，细胞形成较小克隆，呈典型铺路石样(图1B)；角蛋白19免疫组织化学鉴定呈阳性(图1C)。

2.3 脱细胞真皮基质组织学观察经组织学观察，脱细胞真皮基质无细胞存在，基底膜完整，见图2A；Verhoeff铁苏木精染色可见脱细胞真皮基质中的胶原，弹力纤维形态规则，结构清晰，无肿胀，无变性坏死，见图2B。

2.4 组织工程皮肤构建情况表皮干细胞种植于无细胞真皮上1 d 之后，细胞出现生长增殖；种植8 d，表皮干细胞不断增殖并逐渐发生融合，形成片状；14 d存在细胞膜片物，并呈现出皮片状生长，可观察到多层融合的表皮层细胞覆盖在无细胞真皮表面，无细胞真皮内细胞成分已完全去除，最终获得的组织工程皮质地柔软、易于加工。

2.5 动物实验组织工程皮肤移植情况观察组复合皮可对创面予以快速覆盖，很好地抑制创面挛缩，创面愈合之后，皮肤弹性良好，经观察未发生不良反应，见图3A；对照组移植区域呈现出瘢痕愈合，触之质地偏硬，见图3B，有2只动物出现移植皮肤变成褐色，变硬坏死，移植失败。

2.6 组织学检查和免疫组织化学染色结果

组织学检查：两组在镜下均可见良好的表皮和真皮结构，表皮可明显区分为基底层、棘层和角化不全的角质层，其中角质形成细胞向真皮基质中生长，真皮表皮连接处呈波浪状，与观察组相比，对照组可见较多纤维结缔组织。

免疫组织化学染色：观察组愈合创面抗人人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原呈阳性，对照组呈阴性。观察组愈合创面广谱角蛋白免疫组织化学染色结果显示为阳性反应，整个表皮层细胞胞浆均为棕黄色。见图4。

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引言

现如今，在工业化、城市化大背景下，严重烧伤、创伤等已成为“多发病”，且伤者常伴有大面积皮肤缺损^[1]。传统外科治疗方法是进行皮肤移植，采用供者皮肤、尸体皮甚至异种皮肤做移植材料，但存在移植面积有限及排斥反应等问题^[2-3]。随着组织工程学的不断发展，人们开始尝试进行组织工程皮肤构建，构建过程中，需要相应的种子细胞和支架。干细胞具有恢复人体细胞的能力，可作为人体修复系统。其中，人表皮干细胞具有一定的分化潜能，在一定条件下可分化为表皮细胞^[4]。另外，还需要一定的支架材料，为种子细胞提供附着和生长的条件。在相应的支架材料方面，理想的支架材料应该具备良好的生物相容性和孔隙结构等。以往有学者指出，可以含有成纤维细胞的三维培养基为支架，以表皮干细胞为种子细胞，构建新型组织工程皮肤^[5]。理想的皮肤替代物应包含表皮及真皮结构，在表皮层下增加真皮成分，以有效提高其机械性能和创面接受率。脱细胞异体真皮是一种细胞外基质，取材于人体损献体皮肤，经特殊的理化处理，将组织中可引起宿主免疫排斥反应的所有细胞清除掉，同时完整地保留与原有组织结构相同的细胞外基质。猪脱细胞真皮结构利用猪等身上的胶原蛋白制成，去除表皮及真皮内的细胞成分，保留正常的胶原纤维组织和基底膜等细胞外间质成分。这种无细胞真皮无免疫原性，完整保留了各种基底膜成分，且可提供近接近正常结构的真皮替代，有利于细胞的生长，是一种十分理想的支架材料。以往徐飞等利用以骨髓间充质干细胞为种子细胞、脱细胞真皮为支架的组织工程皮肤，修复糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面，有效促进了创面愈合^[6]。此次研究过程中，以人表皮干细胞、猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤，探讨其修复大鼠全层皮肤缺损的效果，为临床皮肤缺损修复提供一定的参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验和单一样本观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年6月至2016年6月在首都医科大学基础部病理实验室完成。

1.3 材料七八周龄雄性SD大鼠20只，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SYXK(京)2011- 0039，体质量250-300 g，饲养环境和健康状况良好。新鲜仔猪皮购自本地农贸市场，经卫生检疫。幼儿包皮2份，取自在张家港市第一人民医院接受包皮手术儿童患者，均为术后丢弃的全层皮肤标本，经患者及其家属知情同意。研究相关内容和方法均经张家港市第一人民医院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物方法、项目进行中涉及动物福利和伦理问题等均符合要求。

主要试剂与仪器：高糖低钙DMEM培养基(上海弘顺生物科技有限公司)；胎牛血清(上海创赛科学仪器有限公司)；乙二胺四乙酸(武汉博士德生物工程有限公司)；氢化可的松(上海信然实业有限公司)；胰蛋白酶(上海朗顿生物科技有限公司)；单克隆鼠抗人HIA-Ⅰ抗体(北京索莱宝科技有限公司)；表皮生长因子(上海艾研生物科技有限公司)；人Ⅳ型胶原(北京绿源大德生物科技有限公司)；中性蛋白酶(上海拜力生物科技有限公司)；鼠抗人α6-PE(上海桥杜生物科技有限公司)；Ig1-PE(南京森贝伽生物科技有限公司)；Ig1-FITC(上海雅吉酶联生物科技有限公司)；鼠抗人CD71-FITC单克隆抗体(上海远慕生物科技有限公司)；鼠抗人角蛋白 19单克隆抗体、鼠抗人角蛋白5单克隆抗体(上海士锋生物科技有限公司)；兔抗人角蛋白多克隆抗体(上海纪宁实业有限公司)；倒置显微镜(北京柏莱斯特科技发展有限公司)；荧光显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

制备猪脱细胞真皮支架^[7]：将新鲜仔猪皮切为0.3 mm 左右厚的皮片，浸入1 mol/L NaCl溶液中进行脱表皮处理。24 h后利用PBS进行冲洗，并浸泡于含5 g/L十二烷基硫酸钠的PBS中。2 h后利用PBS 进行冲洗，利用2 g/L胰蛋白酶进行消化。消化结束再次利用PBS进行冲洗并保存。取一部分进行苏木精-伊红染色和Verhoeff铁苏木精染色，置于镜下观察。

分离、鉴定人表皮干细胞^[8-10]：取幼儿包皮，剔除皮下组织后修剪为2 mm×2 mm小块，通过蛋白酶消化及吹打等处理获得单细胞悬液。进行黏附实验，10-15 min快速黏附之后，去除未发生黏附的细胞，其余细胞使用低钙高DMEM培养基继续培养，并添加胎牛血清和 CaCl₂、表皮生长因子、氢化可的松。待细胞达到70%-80%融和状态时，对细胞进行消化，并添加胎牛血清终止消化。收集细胞之后再次进行10-15 min快速黏附，去除未发生黏附的细胞，其余细胞继续进行大约20 d的培养，最终获得的细胞作为构建复合皮的种子细胞。收集第3代细胞，通过角蛋白19 免疫组织化学鉴定方式对相应表皮干细胞进行鉴定。

构建复合皮^[11]：利用粗针密刺无细胞真皮，然后将扩增的第2代增殖力强的表皮干细胞接种于铺好Ⅳ型胶原的无细胞真皮上，密度为1×10⁵/cm²。所使用的培养基为低钙高糖DMEM 培养基，并添加胎牛血清、CaCl₂、表皮生长因子、氢化可的松。将培养体系置于培养箱，每3 d换液1次。10 d后取出，进行气液界面培养。培养5 d之后，在倒置显微镜下进行观察，进行后续实验。

建立动物模型与移植^[12-14]：20只大鼠均建立皮肤缺损模型，对大鼠进行麻醉，于动物背部尾侧正中切除2.5 cm× 2.5 cm的全层皮肤至肌筋膜，随机分为观察组和对照组，每组10只，对照组移植猪脱细胞真皮支架，观察组移植复合皮。两组创面均覆盖同样大小的相应移植物，消毒凡士林油纱贴于移植物上，妥善打包固定。

术后观察：术后观察动物创面愈合情况，移植后4周进行活检取材，镜下观察创面愈合情况，并进行组织学与免疫组织化学染色，显微镜下观察结果。

1.5 主要观察指标组织工程皮肤构建情况；实验动物组织工程皮肤移植情况；动物实验组织学检查和免疫组织化学染色结果。

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讨论

皮肤是人体面积最大的器官，容易受到外伤、烧伤、炎症等因素的损害^[15]。例如，由于压疮、静脉曲张、血管炎、糖尿病等引起的溃疡及烧伤等急性创伤导致的皮肤缺损，有可能造成皮肤大面积损伤，或是深度损伤，导致人体缺少可移植的自体皮肤^[16]。这样的患者如果不及时植皮，可能会导致创伤修复困难，而反复取皮植皮，又可能对患者造成新的创伤。

一直以来，国际医学界都试图体外制造皮肤，用来更换人体损坏的皮肤组织。到目前为止，已有多种人造皮肤问世，有用蚕丝蛋白、结缔细胞、生物高分子材料、合成高分子材料制成的生物人造皮，也有用纳米材料、传感器制成的非生物人造皮——近来报道最多的是电子皮肤^[16-17]，这些人造皮肤在临床实验上都取得良好的效果，但它们与真正皮肤相比还有很大差距。

从组织工程学角度看，完整的皮肤包括不同的层次：表皮、真皮和皮下组织，而这些皮肤一般都只包含2个层次，表皮和真皮^[18]。组织工程皮肤由表皮层和真皮层两部分组成，表皮层主要是利用人体干细胞培养出的皮肤组织。患者换肤后，人工皮肤会与自身皮肤融合并再生长。通过换肤，患者在避免自体取皮的同时，能修复皮肤创伤，重建功能。为此，在组织工程皮肤的构建过程中需要使用一定的种子细胞和真皮层支架材料。其中，干细胞可是患者自己的，也可以是他人的。表皮干细胞是组织工程皮肤构建过程中十分理想的种子细胞，在维持表皮更新、保持细胞产生等方面都具有十分重要的作用^[21-24]。真皮层又叫胶原层，主要由实验室合成或取自牛、猪等异体身上的胶原蛋白制成，这样的两层结构与人体皮肤组织结构相似。脱细胞异体真皮材料就是将异体面部皮肤取下，脱除其真皮组织细胞，当其中的免疫球蛋白被破坏后，就可消除异体排斥反应。此次实验中，经过一定的实验室处理获得猪脱细胞真皮基质，经观察无细胞存在，基底膜完整，胶原、弹力纤维形态规则，结构清晰。可见经处理之后，真皮基质未受到明显影响，维持了原本的生物学特性。Ⅳ型胶原属于基底膜成分，在进行组织工程皮肤构建过程中，可有效促进表皮真皮正常锚着纤维结构的生成，对上皮细胞的生长产生十分积极的影响^[25-29]。另外，Ⅳ型胶原还可对表皮干细胞的特性予以有效维持^[32-31]。此次实验过程中，在培养表皮干细胞的过程中，利用Ⅳ型胶原铺底进行培养，并选择使用高糖低钙培养基和专用血清。另外，还积极的补充一定外源性表皮生长因子。最终，人表皮干细胞在无细胞真皮上进行接种之后，便可经过一定时间的体外复合培养构建出复合皮。对复合皮进行动物创面移植之后，初期阶段表层细胞需要依靠渗透的血浆来获得所需的营养物质。实验过程中使用的无细胞真皮具有天然的毛孔结构，可以为血浆的渗透提供一定的通道^[32]。但是，天然的毛孔结构孔径较小，如果出现真皮稍厚等情况，便极易影响到血浆渗透作用，导致复合皮无法及时获得所需营养，无法正常成活^[33-34]。为此，实验过程中，需要对相应的无细胞真皮进行密刺处理，以促进血浆的渗透，为复合皮提供足够的营养。通过此次实验可以发现，在进行复合皮动物移植之后，近期创面未出现明显排斥反应。分析出现这一结果的原因，可能是在经过培养之后，郎格汉斯细胞失去原有的抗原呈递能力，相应表皮细胞抗原性也出现不断减弱情况，于是，刺激淋巴细胞增殖的能力也显著下降。通过此次实验还发现，观察组在构建组织工程皮肤并进行动物移植之后，相应的复合皮可对创面予以快速覆盖，很好地抑制创面挛缩，创面愈合之后，皮肤弹性良好，且经观察未发生不良反应，即表明，所使用的组织工程皮肤具有良好的修复效果，种子细胞具有良好的分化能力，以脱细胞真皮为支架发生生长和分化，为创面的修复提供所需的真皮组织，很好地修复缺损部位。在支架材料中还保留了基底膜复，可为上皮细胞的移行以及定植提供作序的平面，有利于局部的上皮化，并有效减轻瘢痕的形成及挛缩等的出现。

另外，实验结果还显示，观察组愈合创面抗人人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原呈阳性，对照组呈出阴性。这一结果表明，新生的表皮并非来源于伤口边缘的鼠自体细胞，而是由移植人表皮细胞形成的。另外，观察组愈合创面广谱角蛋白免疫组织化学染色结果显示为阳性反应，整个表皮层细胞胞浆均为棕黄色。这一结果也表明，利用表皮干细胞和猪脱细胞真皮来构建组织工程复合，可用来进行皮肤缺损修复。但受到入组样本数量及观察时间等因素的影响，此次研究所得到的相关结果及相应结论可能存在一定的片面性和不准确。因此，研究还存在一定的不足之处，还需要在今后的研究中予以进一步完善和分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程