胃癌微环境转化后骨髓间充质干细胞的体内致瘤性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 32-37.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.006

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胃癌微环境转化后骨髓间充质干细胞的体内致瘤性

汪永锋¹，刘喜平¹，崔国宁¹，董俊刚¹，李沛清¹，明海霞¹，张炜²

1甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省兰州市 730000
2兰州大学第一附属医院，甘肃省兰州市 730000

修回日期:2016-11-10 出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 刘喜平，博士，教授，甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省兰州市 730000
作者简介:汪永锋，男，1967年生，甘肃省人，汉族，1990年兰州医学院毕业，副教授，主要从事解剖与组织胚胎学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81260525)

In vivo tumorigenicity of bone marrow mesenchymal stem cells in the body after the conversion of gastric cancer microenvironment

Wang Yong-feng¹, Liu Xi-ping¹, Cui Guo-ning¹, Dong Jun-gang¹, Li Pei-qing¹, Ming Hai-xia¹, Zhang Wei²

1School of Basic Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
2First Affiliated Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Revised:2016-11-10 Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Liu Xi-ping, M.D., Professor, School of Basic Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Wang Yong-feng, Associate professor, School of Basic Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260525

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
干细胞巢：各种干细胞生存在特定的细胞和非细胞成分的环境中，称之为微环境，亦称干细胞巢，它是干细胞维持稳态，即保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的关键。
处于胃癌微环境中的骨髓间充质干细胞：其形态和表明标志物CD34，CD44会发生一定改变，有向胃癌干细胞转化的趋势。将胃癌微环境与骨髓间充质干细胞共培养转化后的骨髓间充质干细胞裸鼠皮下接种后，结果发现其在体内有明显的致瘤能力，表明经胃癌微环境转化的骨髓间充质干细胞已发生了恶性转化，可能已转化为胃癌干细胞。

摘要
背景：临床胃癌组织及裸鼠体内致瘤组织分离得到的胃癌间质干细胞，其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，并证明是肿瘤微环境的重要组成部分，可促进肿瘤的生长。
目的：观察经胃癌微环境转化后的骨髓间充质干细胞在体内是否具有致瘤能力。
方法：设立骨髓间充质干细胞单独常规培养为对照组，实验组采用Transwell 小室将人胃癌BCG-823细胞与大鼠骨髓间充质干细胞非接触共培养建立胃癌微环境。收集骨髓间充质干细胞，分别在裸鼠腋下部位行皮下接种对照组细胞或实验组共培养转化后的骨髓间充质干细胞，观察裸鼠皮下有无结节形成；免疫组织化学法检测肿瘤组织潜伏膜蛋白LMP1及抑癌基因TCF21的表达；透射电镜观察肿瘤组织的超微结构。
结果与结论：①肿瘤结节：对照组裸鼠接种单独培养的骨髓间充质干细胞7-14 d后，始终未形成肿瘤结节。实验组在第7天皮下开始出现肿瘤结节，至14 d肿瘤结节显著增大并稳定；②免疫组织化学显示，实验组潜伏膜蛋白LMP1呈显著现高表达状态，抑癌基因TCF21呈低表达状态；③透射电镜结果显示肿瘤体组织体积较大，形态不规则，细胞微绒毛异常增多，表面有许多树枝状突起，细胞内成分发生明显改变；④结果表明，经胃癌微环境转化的骨髓间充质干细胞具有体内致瘤能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8575-401X(汪永锋)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胃癌BCG-823细胞, 骨髓间充质干细胞, 共培养, 胃癌微环境, 胃癌干细胞, 体内实验, 致瘤性, 抑癌基因TCF21, 潜伏膜蛋白LMP1, 超微结构, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The clinical gastric cancer tissues and the mesenchymal stem cells isolated from tumor
tissues in the body of nude mice have similar characteristics with bone marrow mesenchymal stem cells, which are certificated to be an important part of the tumor microenvironment that can promote the growth of tumor.
OBJECTIVE: To observe that whether bone marrow mesenchymal stem cells have the tumorigenic ability after the conversion of gastric microenvironment.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells cultured singly and routinely were used as controls. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were indirectly co-cultured with gastric cancer BCG-823 cells in a Transwell chamber to construct the gastric microenvironment (experimental group). Bone marrow mesenchymal stem cells from each group were subcutaneously seeded into the forelimb armpit of nude mice, and then, the formation of subcutaneous nodules was observed. Immunohistochemical method was used to detect the expression of tumor tissue latent membrane protein 1 (LMP1) and tumor suppressor gene TCF21. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of tumor tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: After 7-14 days, there were no tumor nodules in the nude mouse armpit in the control group. On the contrary, in the experimental group, tumor nodules formed in the nude mouse armpit after 7 days, and these nodules were enlarged and kept stable until the 14th day. The immunohistochemical results showed high level of LMP1, but low level of TCF21. Under the transmission electron microscope, the tumor tissues had a large volume and an irregular shape, the cell mricovilli were increased abnormally, and there were many fendritic protrusions on the surface, indicating the presence of obvious intracellular changes. In conclusion, bone marrow mesenchymal stem cells after the conversion in the gastric microenvironment have the ability of tumorigenicity in vivo.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Stomach Neoplasms, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

汪永锋，刘喜平，崔国宁，董俊刚，李沛清，明海霞，张炜. 胃癌微环境转化后骨髓间充质干细胞的体内致瘤性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 32-37.

Wang Yong-feng, Liu Xi-ping, Cui Guo-ning, Dong Jun-gang, Li Pei-qing, Ming Hai-xia, Zhang Wei . In vivo tumorigenicity of bone marrow mesenchymal stem cells in the body after the conversion of gastric cancer microenvironment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 32-37.

图/表（结果） 1

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引言

骨髓间充质干细胞良好的迁移性、肿瘤趋向性及易于分离扩增和易于导入外源基因的特点^[1]，使其成为肿瘤生物治疗的首选载体。

利用骨髓间充质干细胞作为胃癌生物治疗的载体，追踪并运送肿瘤靶向药物到恶性肿瘤的内部，或将基因修饰的骨髓间充质干细胞作为基因治疗的靶向载体以增强其抗肿瘤效应是胃癌治疗的全新思路与探索^[2-3]，可能为胃癌的治疗带来希望。然而，随着对骨髓间充质干细胞的生理特性和肿瘤研究的不断深入，发现骨髓间充质干细胞本身、尤其在肿瘤微环境中可能出现恶性转化，具有成瘤、促瘤风险^[4-5]。

许多研究结果也显示，肿瘤是一种干细胞疾病，由此提出肿瘤干细胞的概念^[6]。研究发现，胃癌在发生发展过程中，来源于骨髓的间充质干细胞会归巢到胃黏膜处，参与胃黏膜炎症及胃黏膜肠化增生及癌变组织的损伤修复，也改变了骨髓间充质干细胞生存的微环境，骨髓间充质干细胞可能发生恶性转化，临床胃癌组织及裸鼠体内致瘤组织分离得到的胃癌干细胞，其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似^[7-8]，认为胃癌干细胞可能起源骨髓干细胞。

作者所在课题组前期采用Transwell小室将人胃癌BCG-823细胞与大鼠骨髓间充质干细胞非接触共培养后，发现胃癌微环境使大鼠骨髓间充质干细胞排列紊乱，细胞间连接疏松，呈团簇生长，CD44呈阳性表达，有恶性转化的趋势^[9]。实验推测骨髓间充质干细胞可能已经转化为胃癌干细胞。细胞的成瘤性一般根据目标细胞的特性及动物的敏感性，采用裸鼠以一定的细胞数量进行体内接种进行检测。

为了进一步验证这一假说，实验将胃癌微环境转化后的骨髓间充质干细胞接种在裸鼠腋部皮下，观察其对裸鼠致瘤性的影响。

材料方法

1.1 设计 细胞学体内实验观察。

1.2 时间及地点 2014年1至7月在甘肃中医药大学科研实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：健康6周龄SPF级BALB裸小鼠20只，体质量16-19 g，雌雄不限。由重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司提供，合格证号：SCXK(渝)2012-0006。

细胞：大鼠骨髓间充质干细胞由重庆威斯腾生物科技有限公司提供，经3次传代后，细胞大小、形态趋于一致，均匀分散生长，用于实验。

人胃癌BGC-823细胞，由上海中科院细胞库提供，用含有青链霉素各100 U/mL的DMEM/F12培养基(美国Hy Clone公司)置于5% CO₂，37 ℃条件下的培养箱(美国SHEL LAB 公司)中培养，定期换液传代，选择对数生长期的BGC-823细胞用于实验。

1.4 方法

1.4.1 分组及细胞共培养体系的建立 实验分为实验组(骨髓间充质干细胞与BGC-823细胞共培养)和对照组(骨髓间充质干细胞单独常规培养)。

实验组采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室(美国Costar公司)结合6孔板进行非接触式共培养，将第3代骨髓间充质干细胞以2×10⁵的量种植于Transwell共培养系统的下室，再将Transwell的上室置于孔中，BGC-823细胞以2×10⁵的量接种于上室内。对照组以第3代骨髓间充质干细胞以2×10⁵的量接种于Transwell小室内，下层为含体积分数10%胎牛血清(美国Hy Clone公司)和体积分数1%青链霉素混合液(美国Gibco公司)的DMEM/F12基础培养液。收集骨髓间充质干细胞分别在37 ℃、体积分数5% CO₂恒温培养箱中培养7 d后终止培养。

1.4.2 各组骨髓间充质干细胞的体内致瘤的观察 收集骨髓间充质干细胞，将20裸鼠按随机数字表法随机分为实验组及对照组，每组10只，分别在腋下部位行皮下接种各相应组培养后的骨髓间充质干细胞悬液0.2 mL，此后每天观察裸鼠情况，注意皮下有无结节形成，并每天称量裸鼠的体质量，并绘制曲线。

当裸鼠出现身体明显消瘦、后背弓起、活动能力受限等死亡前征兆时为淘汰，最终每组入选裸鼠6只。当肿瘤生长稳定且成瘤后2周肿瘤不消失，并稳定增长，达到实验需求。用颈部脱臼法麻醉处死小鼠，取出皮下肿瘤体，并测量瘤体长、短径，称质量并计算体积。

肿瘤体积计算公式：肿瘤体积=1/2(长×宽²)。

1.4.3 免疫组织化学法检测肿瘤组织TCF21和LMP1表达 将实验组肿瘤组织及对照组注射部位组织石蜡切片脱蜡至水，体积分数3%H₂O₂室温孵育5-10 min，再用蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。用体积分数10%正常山羊血清进行封闭，在温室下，孵育10 min，倒去血清，加入一定比例的兔抗人TCF21多克隆抗体(英国Abcam公司，工作浓度1∶100)及鼠抗人LMP1单克隆抗体(丹麦Dako公司，工作浓度1∶50)。先经37 ℃孵育，再置于4 ℃过夜。用PBS冲洗3次，每次5 min，加入一定比例的生物素稀释标记的羊抗兔二抗(体积分数1%BSA-PBS稀释，工作浓度1∶100)，在37 ℃下，孵育10 min。用PBS冲洗3次，每次5 min，加入用PBS稀释的一定比例的辣根酶标记链霉卵白素稀释液，在37 ℃下，孵育30 min。再用PBS冲洗3次，每次5 min，加入DAB显色剂显色，最后用自来水充分冲洗，复染，再封固，拍照。以胞浆和胞膜染色呈棕褐色为阳性标准，参考以往文献方法^[10-11]，光学显微镜(×400)下随机取5个视野，计算TCF21和LMP1阳性细胞率。

1.4.4 肿瘤组织的超微结构透射电镜观察 将肿瘤组织切成约1 mm的方块贮存于1.5 mL EP管中，先用4 ℃、体积分数2.5%戊二醛固定2 h，再用体积分数1%四氯化锇固定30 min，最后用PBS冲洗2遍，10 min/次。将固定好的细胞团块移入已灭菌的青霉素小瓶中。依次脱水体积分数50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮2次、100%丙酮3次，每次脱水12 min，去除脱水剂，依次加入丙酮-EPON812包埋剂和纯包埋剂对组织进行包埋，置于烤箱中60 ℃、24 h直到其成为硬块。将硬块用超薄切片机切成约1 μm厚的半薄切片，取载玻片，中央加一滴双蒸水，将薄切片放于水滴上，烤箱干燥，滴加美蓝染液30 s，染色后用蒸馏水冲洗，再用复合染料染色10 s。冲洗烤干后，在显微镜下观察组织中细胞图像，对需做超薄切片的部位标记下来。

1.5 主要观察指标 ①胃癌微环境转换后骨髓间充质干细胞的体内肿瘤结节的体积质量；②肿瘤组织LMP1及TCF21的表达；③肿瘤组织的超微结构透射电镜观察。

1.6 统计学分析 计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间数据差异的比较用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胃黏膜由壁细胞、顶细胞、颈黏液细胞、主细胞、多能干细胞及少量的内分泌细胞等多种上皮细胞共同组成，各种细胞均来源于多能干细胞^[12-13]。各种干细胞生存在特定的细胞和非细胞成分的环境中^[14]，称之为微环境，亦称干细胞巢，它是干细胞维持稳态，即保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的关键，巢的成分改变和巢中信号通路的改变可能导致正常的干细胞发生转变^[15]。

研究认为胃癌发病与骨髓间充质干细胞有关，以幽门螺杆菌为主的长期慢性感染^[16-18]、吸烟^[19-20]、高盐饮食以及其他一些理化因素均可导致胃黏膜的炎症反应和组织损伤^[21]，此时骨髓来源的干细胞会聚集到胃黏膜处，参与损伤修复并增生，随着时间的推移，微环境的改变可以导致干细胞功能紊乱，发生肠化、不典型增生，从而引发癌变^[22-23]。有研究认为胃癌干细胞可能起源骨髓干细胞。同时，胃癌形成后，由肿瘤细胞本身、众多基质细胞及肿瘤细胞产生的细胞因子、蛋白水解酶、微血管、微淋巴管及组织液等共同形成了胃癌微环境^[24-25]，处于胃癌微环境中骨髓间充质干细胞的生物学特性会发生一定的改变来适应肿瘤微环境^[26]。

实验前期采用Transwell小室将人胃癌BCG-823细胞与大鼠骨髓间充质干细胞非接触共培养后发现骨髓间充质干细胞排列紊乱，不规则，细胞间连接疏松，细胞变细变长，胞核变小，呈团生长，其增殖率亦明显增高。检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD44呈高表达状态，CD44作为细胞表面黏附分子，在淋巴细胞、成纤维细胞和增生的上皮细胞等多种细胞中均有表达^[27]，同时CD44既是骨髓间充质干细胞的重要标志物^[28]，也是肿瘤干细胞的表面标志物^[29]。因此，在胃癌干细胞的特异性表面分子无法确定的情况下，肿瘤干细胞在裸鼠体内能否成瘤被作为验证肿瘤干细胞存在的金标准^[30]。

实验以“微环境诱导”理论为指导，通过人胃癌BCG-823细胞与大鼠骨髓间充质干细胞共培养的方式建立胃癌微环境中骨髓间充质干细胞的生长转化模型，采用裸鼠体内致瘤方法，将胃癌微环境转化后的骨髓间充质干细胞在裸鼠腋下皮注射，从肿瘤结节的形成、肿瘤组织相关癌基因的表达及肿瘤组织的超微结构透射电镜观察等方面观察骨髓间充质干细胞在胃癌微环境中是否发生了恶性转化。

实验结果表明，经胃癌微环境转化后7 d后的骨髓间充质干细胞在裸鼠腋部皮下接种后，在第7天皮下开始出现肿瘤结节，至14 d肿瘤结节显著增大并稳定，肿瘤体积较大，形态不规则，裸鼠的体质量明显增加。透射电镜观察亦显示，实验组细胞微绒毛异常增多，溶酶体、粗面内质网等细胞内容物异常增多，细胞内成分发生明显改变。结果表明经胃癌微环境转化的骨髓间充质干细胞具有体内致瘤能力，骨髓间充质干细胞发生了恶性转化，可能已转化为胃癌干细胞。而未经胃癌微环境转化骨髓间充质干细胞的对照组在裸鼠腋下皮接种后7-14 d裸鼠始终未出现肿瘤结节，体质量未发生明显变化。

肿瘤的形成、发生和发展与肿瘤组织相关抑癌或促癌基因蛋白的表达与调控有关。潜伏膜蛋白LMP1是一种能够促进正常细胞恶性转化和增殖，增强肿瘤细胞侵袭能力，抑制分化、凋亡和活化癌细胞基因的致瘤蛋白，已有研究表明LMP1在胃癌和相应癌旁组织中呈高表达状态^[31]。而转录因子21则是一种最新发现的抑癌基因，与头颈部肿瘤、肺癌、胃癌等肿瘤的发生、发展有关^[32-36]。

研究认为，当肿瘤细胞中TCF21基因被激活时，活化的TCF21基因可以减慢肿瘤的生长^[37-39]。

实验免疫组织化学显示LMP1在裸鼠肿瘤结节组织中较对照组正常组织中的表达明显升高；TCF21在裸鼠肿瘤结节组织中较对照组正常组织中的表达明显降低，这与以往相关研究TCF21在肿瘤组织中的表达量较正常组织降低基本一致^[33^，^40-41]，表明经胃癌微环境转化后的骨髓间充质干细胞不但发生了恶性转化，具有体内致瘤能力，LMP1与TCF21参与了经胃癌微环境转化后骨髓间充质干细胞的裸鼠体内致瘤，其肿瘤组织的形成可能与LMP1与TCF21的基因调控失调有关，而LMP1与TCF21的具体作用机制尚不明确。

此外，在胃癌微环境中骨髓间充质干细胞是否获得了胃癌干细胞的其他相关生物学特性，值得进一步研究。

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[4]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[5]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[6]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
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[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.