肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导人脐带间充质干细胞向肿瘤相关间充质干细胞的转分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.005

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 25-31.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.005

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肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导人脐带间充质干细胞向肿瘤相关间充质干细胞的转分化

杨涓¹，郑盛¹，陈文钦²，刘晶²，张帆¹，王玉波¹

1云南省第三人民医院消化内科，云南省昆明市 650011
2昆明市东方医院产科，云南省昆明市 650000

修回日期:2016-11-25 出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 郑盛，主治医师，云南省第三人民医院消化内科，云南省昆明市 650011
作者简介:杨涓，女，1979年生，云南省昭通市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事消化系统疾病的基础和临床研究。
基金资助:
云南省自然科学基金(2012FD095)；云南省教育厅科研基金重点项目(2014Z125，2015Z146)；云南省临床重点专科建设项目(云卫医发[2015]18号)

Transdifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into cancer-associated mesenchymal stem cells induced by hepatocellular carcinoma HepG-2 supernatant

Yang Juan¹, Zheng Sheng¹, Chen Wen-qin², Liu Jing², Zhang Fan¹, Wang Yu-bo¹

1Department of Digestive Diseases, Yunnan Third People’s Hospital, Kunming 650011, Yunnan Province, China
2Department of Obstetrics, Dong Fang Hospital of Kunming, Kunming 650000, Yunnan Province, China

Revised:2016-11-25 Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Zheng Sheng, Attending physician, Department of Digestive Diseases, Yunnan Third People’s Hospital, Kunming 650011, Yunnan Province, China
About author:Yang Juan, Master, Attending physician, Department of Digestive Diseases, Yunnan Third People’s Hospital, Kunming 650011, Yunnan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Yunnan Province, No. 2012FD095; the Scientific Research Fund of Yunnan Educational Department, No. 2014Z125, 2015Z146; the Key Clinical Department Construction of Yunnan Province, No. [2015]18

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肝癌相关间充质干细胞：已有研究结果显示，从肝癌组织中可分离出肝癌相关间充质干细胞，它具有间充质干细胞的一般特性，如细胞的形态和胞质的透光性均良好，外形类似成纤维细胞，呈漩涡状生长。肝癌相关间充质干细胞高表达CD13、CD29、CD44及CD105，不表达CD34、CD38和CD133等。
肿瘤微环境：是指由细胞外基质及细胞构成的一种微环境，可对肿瘤细胞的增殖及迁移产生较大的促进作用，其中相关的细胞包括血管内皮细胞、纤维母细胞、T细胞及肿瘤相关成纤维细胞等，是近年来研究的热点，目前已证实其可促进肿瘤的增殖、分化和上皮−间质转化，此外还可促进肿瘤的转移。

摘要
背景：研究发现，肿瘤微环境可募集和吸引不同种类和分化程度的间充质干细胞至肿瘤生长部位，影响肿瘤进程。
目的：分析肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导人脐带间充质干细胞向肿瘤相关间充质干细胞的转分化，并探讨转分化后肿瘤相关间充质干细胞影响肝癌HepG-2细胞的增殖及迁移。
方法：①实验1：收集肝癌HepG-2细胞培养液上清，混合等量的低糖DMEM作为培养基，培养人脐带间充质干细胞，48 h后，检测人脐带间充质干细胞肿瘤相关间充质干细胞蛋白及miR-221的表达；②实验2：收集肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导后的人脐带间充质干细胞培养液上清，联合高糖DMEM培养肝癌HepG-2细胞，48 h后，检测细胞增殖与迁移能力；③实验3：实验组将人脐带间充质干细胞与肝癌HepG-2细胞共培养，对照组单纯培养肝癌HepG-2细胞，48 h后，检测细胞增殖与迁移能力。
结果与结论：①实验1：肝癌HepG-2细胞培养液上清处理后，人脐带间充质干细胞中波形蛋白和成纤维细胞活化蛋白表达增强，miR-221表达上调；②实验2：经诱导后人脐带间充质干细胞培养液上清处理后，肝癌HepG-2细胞增殖及迁移能力显著增强；③实验3：与人脐带间充质干细胞共培养后，肝癌HepG-2细胞增殖及迁移能力显著增强；④结果表明：肝癌HepG-2细胞培养液上清可诱导人脐带间充质干细胞获得肿瘤相关间充质干细胞样表型，并且转分化后的肿瘤相关间充质干细胞可促进肝癌HepG-2细胞的增殖和迁移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-1802-4249(郑盛)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 脐带间充质干细胞, 肝癌, 转分化, 细胞迁移, 细胞增殖, 云南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tumor microenvironment can recruit and attract different type and differently differentiated mesenchymal stem cells (MSCs) to the tumor growth site, thereby affecting tumor progression.
OBJECTIVE: To investigate the transdifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) into cancer-associated MSCs induced by the supernatant from hepatocellular carcinoma cells HepG-2 culture medium and the effect of induced hUC-MSCs on the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells HepG-2.
METHODS: (1) Experiment 1: The supernatant from hepatocellular carcinoma cells HepG-2 culture medium was prepared, mixed with equal volume of low glucose DMEM and used to culture hUC-MSCs for 48 hours. The expressions of cancer-associated MSCs proteins and miR-221 in hUC-MSCs were detected. (2) Experiment 2: The supernatant from induced hUC-MSCs culture medium was mixed with equal volume of high glucose DMEM to treat hepatocellular carcinoma cells HepG-2 for 48 hours and then the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells HepG-2 were observed. (3) Experiment 3: Hepatocellular carcinoma cells HepG-2 were cultured alone or co-cultured with hUC-MSCs for 48 hours and then the capabilities of proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells HepG-2 were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Experiment 1: The protein levels of vimentin and fibroblast activation protein were increased and the expression of miR-221 was upregulated in the hUC-MSCs after treated by the supernatant from hepatocellular carcinoma cells HepG-2 culture medium. (2) Experiment 2: The supernatant from induced hUC-MSCs culture medium promoted hepatocellular carcinoma cells HepG-2 proliferation and migration. (3) Experiment 3: The capabilities of proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells HepG-2 after co-cultured with hUC-MSCs were significantly enhanced. To conclude, these results above declared that the supernatant from hepatocellular carcinoma cells HepG-2 culture medium could induce hUC-MSCs, equipping them with cancer-associated MSC-like phenotype and promoting the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells HepG-2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Liver Neoplasms, Tumor Microenvironment, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

杨涓，郑盛，陈文钦，刘晶，张帆，王玉波. 肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导人脐带间充质干细胞向肿瘤相关间充质干细胞的转分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 25-31.

Yang Juan, Zheng Sheng, Chen Wen-qin, Liu Jing, Zhang Fan, Wang Yu-bo. Transdifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into cancer-associated mesenchymal stem cells induced by hepatocellular carcinoma HepG-2 supernatant[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 25-31.

图/表（结果） 2

2.1.1 hUC-MSCs经HepG-2培养液上清处理后肿瘤相关蛋白质检测结果 对处理前后hUC-MSCs的形态进行镜下观察发现，实验组与对照组细胞形态无明显差差异。Western blot结果提示实验组肿瘤相关间充质干细胞波形蛋白和凋亡调控蛋白水平高于对照组(P < 0.05)，见图1。采用免疫荧光对上述两种肿瘤相关间充质干细胞蛋白质波形蛋白和凋亡调控蛋白水平进行检测，结果提示实验组两种蛋白质的荧光强度明显增强，与Western blot结果一致，见图2。

2.1.2 HepG-2上清处理后hUC-MSCs中的miR-221检测结果 实验组miR-221表达明显高于对照组(P < 0.05)，见图3。

2.2 实验2结果

2.2.1 处理后hUC-MSCs对HepG-2增殖能力的影响 实验组肝癌HepG-2细胞形成的细胞集落数量较多，单个直径较大，与对照组、空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，对照组与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。实验组HepG-2细胞数目明显多于对照组、空白对照组(P < 0.05)，对照组与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.2.2 处理后hUC-MSCs对HepG-2迁移能力的影响 实验组有更多的HepG-2细胞迁移至Transwell小室膜下层，细胞计数明显高于对照组、空白对照组(P < 0.05)；对照组与空白对照组细胞计数比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。此外，细胞形态观察提示3组细胞没有明显差异，见图7。

2.3 实验3结果

2.3.1 共培养后HepG-2增殖能力的变化 相较于对照组，实验组的细胞集落数量更多，单个直径更大(P < 0.05)，见图8。从共培养第5天起，实验组细胞增殖速度显著加快，与对照组相比差异有显著性意义(P > 0.05)，见图9。

2.3.2 共培养后HepG-2迁移能力的变化 实验组HepG-2迁移细胞明显多于对照组(P < 0.05)，见图10。

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引言

原发性肝癌目前已成为国内消化系统第2位的肿瘤性疾病，严重威胁了居民生命和健康^[1-2]。肿瘤微环境是近年来提出的一个新的定义，它是指由细胞外基质及细胞构成的一种微环境，可对肿瘤细胞的增殖及迁移产生较大的促进作用，其中相关的细胞包括血管内皮细胞、纤维母细胞、T细胞及肿瘤相关成纤维细胞等^[3-4]，是近年来研究的热点，目前已证实其可促进肿瘤的增殖、分化和上皮-间质转化，此外还可促进肿瘤的转移。研究表明，肿瘤细胞的增殖、分化与多种因素密切相关，其中肿瘤微环境可通过促进肿瘤内部及周围微血管的新生、诱导细胞周围基质成分增加、促进炎症递质和细胞因子的释放等直接或间接影响肿瘤细胞的增殖和迁移，甚至包括肿瘤细胞的上皮-间质转化^[5-6]。

近年来研究证实，可从人肝癌组织中分离出肿瘤相关间充质干细胞样细胞(hepatocellular carcinoma-derived mesenchymal stem cells，HC-MSCs)。与其他组织来源间充质干细胞例如人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等相比，HC-MSCs中肿瘤相关成纤维细胞标记阳性数量明显增加^[7-8]。研究结果显示，肿瘤相关成纤维细胞是促进肿瘤细胞增殖和迁移的一种重要机制。已有研究结果提示，肿瘤微环境可募集和吸引不同种类和分化程度的间充质干细胞至肿瘤生长部位，影响肿瘤进程^[9-12]。间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、扩增技术成熟和移植免疫排斥影响小等优点，在临床上被广泛应用于各种疾病的组织修复与再生，它能够在特定条件下分化成为血管、肺脏、心脏、胰腺、肌肉和神经细胞的组织细胞，目前在临床上应用较广泛。但是，由于间充质干细胞也是肿瘤微环境的重要组分，如何安全有效地应用间充质干细胞一直是临床研究的热点。因此，研究拟行体外细胞实验，研究肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导hUC-MSCs向肿瘤相关间充质干细胞进行转分化，并对转分化后的肿瘤相关间充质干细胞如何影响HepG-2细胞的增殖及迁移有关机制进行研究。

材料方法

1.1 设计 细胞水平观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在云南省昆明市莫立克生物医学科技中心完成。

1.3 材料

1.3.1 标本及细胞来源 5份脐带标本由昆明市东方医院产科提供，产妇及胎儿身体未见异常，营养状况良好。人肝癌HepG-2细胞由昆明市莫立克生物科技有限公司提供。

1.3.2 主要试剂与仪器 胎牛血清(美国santa cmz公司)；HG-DMEM、EDTA、β-甘油磷酸钠(美国santa cruz公司)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司）；Tris碱(美国Mbchem公司)；甘氨酸、丙稀酰胺、N，N-亚甲双丙酰胺(美国Fluka公司)；十二烷基磺酸钠、四甲基二乙胺、牛血清白蛋白、Hoechst染料、兔抗vimentin抗体、抗兔Donkey anti-rabbit IgG(cy3)(美国Sigma公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；Taq酶(上海经科化学科技有限公司)；dNTP、DEPC、Trizol、Marker、胰酶消化液、蛋白酶抑制剂(上海宝生物科技有限公司)；抗鼠Goat anti mouse IgG(Cy3)、兔抗FAP抗体、预染蛋白Marker(美国Fermentas公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；倒置显微镜、共聚焦荧光显微镜(Olympus公司)；核酸蛋白测定仪、化学发光凝胶成像仪(GE公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 hUC-MSCs的分离培养及鉴定 采用组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs^[13]。使用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养基贴壁培养hUC-MSCs，细胞汇合度达80%-90%后，按1∶3传代。倒置相差显微镜观察细胞形态及贴壁能力。细胞传代至第5代，流式细胞仪检测hUC-MSCs细胞CD19、CD29、CD90及CD105蛋白质表达水平。

1.4.2 实验1 肝癌HepG-2细胞培养液上清处理hUC-MSCs：采用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基对肝癌HepG-2细胞进行培养。选择对数生长期肝癌HepG-2细胞，胰酶消化；将处理后的肝癌HepG-2细胞以5×10⁵接种于10 cm细胞培养皿，贴壁过夜，弃上清，PBS冲洗3次，2 min/次，再次选择上述高糖DMEM培养基进行培养。培养48 h后，收集相关细胞培养液，1 000 r/min离心5 min，取液体上清，过滤后置于5 mL离心管，置于-70 ℃环境保存。选择生长良好的hUC-MSCs，胰酶进行消化，以2×10⁵的细胞浓度接种于50 mL细胞培养瓶，贴壁过夜。实验选用低糖DMEM与等量HepG-2细胞培养液上清混合，对hUC-MSCs进行处理；设置对照组，其处理液为1∶1的低糖DMEM与高糖DMEM混合液，处理时间为48 h。

1.4.3 实验2 肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导的hUC-MSCs培养液上清处理HepG-2细胞：弃肝癌HepG-2细胞培养液上清处理后的hUC-MSCs上清，PBS冲洗3次，2 min/次，加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，48 h后收集上清。取对数生长期肝癌HepG-2细胞，PBS冲洗3次，2 min/次，胰酶消化并进行细胞计数，以5×10⁵的细胞浓度接种于10 cm细胞培养皿，贴壁过夜，弃去上清，采用PBS冲洗，2 min/次，洗涤3次。实验组用等量hUC-MSCs上清(经肝癌HepG-2细胞培养液上清处理)与高糖DMEM混合液对肝癌HepG-2细胞进行处理，对照组以未行处理的hUC-MSCs上清处理肝癌HepG-2细胞，空白对照组常规培养肝癌HepG-2细胞，处理时间为48 h。

1.4.4 实验3 细胞共培养：实验组选择生长良好的hUC-MSCs，PBS洗涤，胰酶进行消化，完成细胞计数，以1×10⁵/孔的细胞浓度接种于6孔嵌合板上层；选择生长良好的HepG-2细胞，PBS洗涤，胰酶进行消化，完成细胞计数，以1×10⁵/孔的细胞浓度接种于6孔嵌合板下层；6孔嵌合板上层加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液1.5 mL；下层加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液2.5 mL。对照组上层不加细胞，仅加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液1.5 mL，下层选择对数生长期生长良好的HepG-2，按照1×10⁵/孔的细胞浓度接种，不加DMEM培养基。细胞培养箱中共培养2 d，培养环境：37 ℃、体积分数5%CO₂。

1.5 主要观察指标

1.5.1 实验1

蛋白质提取：处理48 h后，收集相关细胞沉淀，数量约1×10⁶，加入按照1∶250配比的PIRA∶PMSF混合液50 μL，将加入细胞沉淀的混合液剧烈震荡1 min，静置于冰上约10 min，连续重复3次。置于4 ℃环境10 000 r/min离心30 min，连续重复3次，每次将上清液小心取出。用2 mL EP管分装上清液，置于4 ℃环境12 000 r/min离心 30 min，过滤。过滤后的液体用5 mL离心管分装，取出10 μL做蛋白质定量，其余置于-70 ℃保存。

总RNA提取：处理48 h后，收集约1×10⁶细胞沉淀，在60 mm培养板中加入1 mL总RNA提取试剂，在室温中放置5 min，使细胞完全溶解。据RNA提取试剂盒说明书提取RNA。使用核酸蛋白检测仪检测浓度。

RT-PCR和实时荧光定量PCR：根据PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time(Takara公司)反转录体系说明书合成cDNA，利用Primer 5.0软件设计引物，引物序列为Forward：5’-GTG CTG CGA AGT GGA AAC C-3’，Reverse：5’-AAG TCT GGC TCG TTC TCA GTG-3’，将反转录后cDNA 分别按梯度稀释10、1×10²、1×10³、1×10⁴和1×10⁵倍后进行qPCR；反应液配置需要在冰上进行，以U6作为内参。

Western blot：加入蛋白裂解液，通过超声破碎仪充分裂解，以上过程于冰上进行低温操作，离心机设置4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清后BCA 法测定蛋白浓度，按30 μg蛋白量作为标准上样量。SDS-PAGE 浓缩胶80 V，30 min；分离胶120 V，120 min，然后转膜100 V，100 min；加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4 ℃封闭过夜，之后加入二抗室温孵育1 h，ECL 法曝光、显影、照相。采用图象分析系统扫描，并对条带进行灰度分析。

免疫荧光：选择生长良好的hUC-MSCs，采用PBS洗涤，2 min/次，洗涤3次，胰酶进行消化，并进行细胞计数，选择2×10⁴的细胞浓度种入24孔板，细胞培养箱孵育，箱内环境：37 ℃、体积分数5%CO₂。按照1.4.2的分组对hUC-MSCs处理48 h，采用PBS洗涤，2 min/次，洗涤3次，加入体积分数3% H₂O₂溶液10 min。再次用PBS洗涤，应用0.5%Triton-100破膜10 min。PBS洗涤。选择通用型二抗IgGHRP多聚体，37 ℃环境孵育30 min，加入一抗，4 ℃环境孵育过夜。PBS洗涤，避光加入荧光二抗，37 ℃环境孵育45 min。PBS洗涤后选择Hoechst 33342染核，浓度1∶1 000，常温避光孵育15 min。荧光显微镜观察并拍照。

1.5.2 实验2与实验3

克隆成形实验：将相关处理后的细胞用PBS冲洗3次，2 min/次，胰酶消化、计数，重悬后接种于6孔板，1 000/孔，细胞培养箱中连续培养10 d，培养环境：37 ℃、体积分数5%CO₂，每天换液。培养结束后弃上清，PBS洗涤，应用40 g/L多聚甲醛固定细胞。PBS洗涤，采用结晶紫染色后进行拍照。

细胞计数：将处理后的细胞用PBS冲洗3次，2 min/次，胰酶消化、计数，重悬后接种于24孔板，1 000/孔，细胞培养箱中连续培养，培养环境：37 ℃、体积分数5%CO₂，换液1次/3 d，从共培养的第5天开始，每天同一时间点取出24孔板，PBS洗涤，胰酶消化，低倍镜下观察，进行细胞计数。

细胞迁移实验：将处理后的细胞用PBS冲洗3次，2 min/次，胰酶消化、计数，重悬后以5×10⁴/孔接种于24孔Transwell迁移板中，上室为200 μL无血清培养基，下室为600 μL含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM基础培养基。在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养12 h后，PBS清洗后用40 g/L多聚甲醛固定。PBS清洗，用棉签小心地擦去膜上层细胞，用结晶紫染色后用PBS洗净，显微镜下观察并拍照。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计量资料应用x(_)±s表示，两样本均数比较采用t 检验或Mann-Whitney U检验，显著性检验采用单因素方差分析，组间比较方差齐时采用LSD方法，方差不齐时比较釆用t 检验。P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

目前研究证实，间充质干细胞具有低免疫原性，同时可多向分化，此外其自我更新、增殖能力较强，目前间充质干细胞分离、培养、鉴定的技术已较为成熟。间充质干细胞在体内可通过分泌多种可溶性细胞因子和表达内生性细胞外基质，为肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和分化提供必要的微环境。此外，由于间充质干细胞具有向肿瘤组织区域特异性迁移和募集的特点，它在肿瘤的精准治疗中体现出较大的价值，可选择间充质干细胞作为肿瘤治疗药物的载体，成为一种特异性非常强的靶向运输治疗因子^[14-15]。同时，由于间充质干细胞的低免疫原性，在体内可通过改变肿瘤微环境，影响肿瘤的增殖和迁移，因此可以选择基因修饰的方法对细胞进行转分化，通过改变miRNA和相关蛋白质的表达从而改变间充质干细胞分泌的细胞因子和细胞外基质，对肿瘤的进程实现负向调控，以延缓肿瘤增殖、迁移和侵袭，达到有效干预肿瘤的目的^[16-17]。hUC-MSCs具有易于获得、可大量体外扩增、低免疫原性等优点，同时它具备的多向分化潜能和高度自我更新能力使得它在细胞再生、组织修复中已得到较广泛的应用，也在肿瘤的诊治中具备较大的前景。hUC-MSCs具备了所有干细胞的生物学特性，经过合适诱导，可向内外胚层的血管内皮细胞、神经细胞和心肌细胞分化，也可向脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等中胚层细胞分化^[18-19]。近年来发现，肿瘤细胞的增殖、分化与多种因素密切相关，其中肿瘤微环境可通过促进肿瘤内部及周围微血管的新生、诱导细胞周围基质成分增加、促进炎症递质和细胞因子的释放等，直接或间接影响肿瘤细胞的增殖和迁移，甚至包括肿瘤细胞的上皮-间质转化，而研究也证实间充质干细胞是肿瘤微环境细胞的主要来源^[20-21]。如何安全有效地利用间充质干细胞，减少或避免间充质干细胞的致瘤可能；在如何在临床的抗肿瘤治疗中安全、合理应用间充质干细胞特别是hUC-MSCs成为了当下干细胞研究领域的热点。目前的研究表明，间充质干细胞主要通过产生多种细胞因子，以及增加细胞外的基质成分促进肿瘤的生长与转移。Song等^[22]选择免疫抑制小鼠作为动物模型，将间充质干细胞与肿瘤细胞混合后注射到动物模型体内，结果显示新生肿瘤的瘤体体积明显增大，与肿瘤细胞单独注射组相比差异有显著性意义。Cuiffo等^[23]证明，间充质干细胞可通过改变有关miRNA的表达，影响miRNA与转录因子FOXP2的连接，对相关肿瘤的转移和周边侵袭起到了强化的作用。

已有研究结果显示，从肝癌组织中可分离出肝癌相关间充质干细胞，即HC-MSCs。它具有间充质干细胞的一般特性，如细胞的形态和胞质的透光性均良好，外形类似成纤维细胞，呈漩涡状生长。HC-MSCs高表达CD13、CD29、CD44及CD105，不表达CD34、CD38和CD133等。但HC-MSCs在体外的增殖能力比正常间充质干细胞强。miRNA是一类广泛存在于真核生物，长度为21-25 nt的单链非蛋白编码小RNA分子。近年来对miRNA的研究发现，在肝癌发生中，miRNA参与着肝癌演进的各个阶段，在肝癌发生的增殖、凋亡、侵袭和转移过程中扮演了关键作用。研究证实，HC-MSCs可高表达miR-221，能显著促进肝癌细胞的增殖与迁移。miRNAs作为原癌基因或抑癌因子, 能够抑制靶基因的表达与功能，从而进一步调节肿瘤的生物学特性。miR-221作为研究较多的一类miRNA，是一种致癌miRNA，在多种恶性肿瘤中过度表达。miR-221可调节肿瘤细胞的程序性凋亡，改变肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。miR-221目前已被用于癌症的诊断和预后。此外研究证实miR-221可加速肺癌进展，此外也有研究证实转基因调节miR-221可改变动物模型中肺癌的进展。在肝癌中，也有关于miR-221的报道，有研究发现在肝癌组织和癌旁组织中16个miRNA，包括miR-223、miR-150、miR-199a和miR-221的表达显著不同，其中7个上调，5个下调。与正常人相比，miR-221在原发性肝癌血清中高表达。研究分别收集HepG-2培养液上清处理前后的hUC-MSCs，采用RT-PCR对miR-221的表达进行实时荧光定量PCR检测。结果显示经过HepG-2培养液上清处理后的hUC-MSCs中miR-221的表达明显高于对照组，同样证实了hUC-MSCs可诱导肝癌细胞高表达miR-221。

研究结果还发现，采用HepG-2培养液上清处理hUC-MSCs，可诱导改变hUC-MSCs其miRNA和蛋白质表达水平，从而诱导hUC-MSCs出现癌性间充质干细胞的细胞表型，进而加入肿瘤微环境的构建，最终显著提升了肝癌细胞的增殖和迁移能力。目前研究还发现，肝癌细胞还可诱导hUC-MSCs向肿瘤相关成纤维细胞分化，这一过程的实现是通过肝癌细胞的胞吐作用完成的。其中TGF-β/Smad通路是非常重要和关键的一条信号通路，它完整的参与了hUC-MSCs向肿瘤相关成纤维细胞分化过程的调控。为此，在临床应用hUC-MSCs对相关疾病进行治疗尤其是抗肿瘤治疗时，肿瘤细胞可能会诱导hUC-MSCs转分化成为促进肿瘤增殖、生长的肿瘤相关间充质干细胞。因此，由于间充质干细胞的多向分化潜能及致瘤的风险，使其应用存在一定安全隐患，可能会进一步加剧快肿瘤的进展。为降低hUC-MSCs临床应用的风险，必须有效地改造hUC-MSCs，特别是考虑采用基因修饰的方式，提高其治疗效能，减少和避免其促进肿瘤发生发展及恶性转化的效应。

肝癌HepG-2细胞培养液上清诱导人脐带间充质干细胞向肿瘤相关间充质干细胞的转分化

Transdifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into cancer-associated mesenchymal stem cells induced by hepatocellular carcinoma HepG-2 supernatant

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