人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.020

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

多巴胺受体：多巴胺作为一种内源性神经递质，主要通过多巴胺受体调控其功能。多巴胺受体是能与多巴胺特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质。多巴胺受体为7个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前已分离出5种类型(DRD1-DRD5)。根据它们的生物化学、药理特性和生理功能的差别，可分为D1类和D2类受体，两类受体的C端含有磷酸化和棕榈酰化位点，涉及激动剂依赖性受体的去敏感化过程和第四胞内环的形成。

荧光素酶报告基因：是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素生成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。通过荧光测定仪也称化学发光仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种方法。

摘要

背景：多巴胺受体启动子区多态性位点的改变会影响受体的表达量，进而影响多巴胺能神经递质的作用，导致相关疾病的发生。

目的：通过克隆人DRD1基因的启动子区，构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性，为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。

方法：以人静脉血基因组DNA为模板，通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体，测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic，构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，采用阳离子脂质体法与内对照质粒pGL3-TK共转染HEK293细胞同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与内对照质粒pGL3-TK共转染作为阴性对照组，化学发光仪检测相对荧光强度。

结果与结论：①通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确；②与阴性对照组相比，该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性；③成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体，为研究该基因的转录调控提供了基础工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0002-5083-3962(王春红)

关键词: 实验动物, 基因病毒载体相关因子模型, 多巴胺受体D1基因, 双荧光素酶报告基因, 启动子, 克隆

Abstract:

BACKGROUND: The polymorphisms of dopamine receptor in promoter region will affect the expression of the receptor, thereby affecting the dopaminergic neurotransmitter, finally lead to related diseases.

OBJECTIVE: To construct the dual luciferase reporter vector containing human DRD1 promoter region and determine its activity, which could provide the basic tool for studying the transcriptional regulation of DRD1 gene.

METHODS: DRD1 promoter sequence was amplified by PCR using the human blood genomic DNA and cloned into pGM-T vector. After sequencing, the correctly constructed vectors were ligated to the firefly luciferase reporter plasmid pGL3-Basic. The cloned pGL3-Basic vectors were transfected into HEK293 using cationic liposome method. In the meanwhile, PGL3-Basic vector with no promoter was co-transfected with pGL3-TK plasmid as negative control group. The relative fluorescence intensity was measured by chemiluminescence.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Recombinant luciferase reporter gene vectors were confirmed by restriction analysis and sequencing. (2) Compared with the negative control group, the HEK293 cells transfected by recombinant vectors presented transcriptional activity. (3) In conclusion, luciferase reporter gene vectors containing DRD1 promoter region are successfully constructed and can provide the basic tool for further study on the transcriptional regulation of DRD1.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Receptors, Dopamine, Genes, Reporter, Transcription Initiation Site, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王春红，李哲，王明菡，邓丽丽，王欢. 人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 6060-6066.

Wang Chun-hong, Li Zhe, Wang Ming-han, Deng Li-li, Wang Huan. Constructing the dual luciferase reporter vector containing human DRD1 promoter region[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(40): 6060-6066.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Denno ME, Privman E, Venton BJ. Analysis of neurotransmitter tissue content of Drosophila melanogaster in different life stages. ACS Chem Neurosci. 2015;6(1):117-123.
[2] Ennis RC, Asico LD, Armando I, et al. Dopamine D?-like receptors regulate the α?A-adrenergic receptor in human renal proximal tubule cells and D?-like dopamine receptor knockout mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2014;307(11):F1238-1248.
[3] Beaulieu JM, Espinoza S, Gainetdinov RR. Dopamine receptors - IUPHAR Review 13. Br J Pharmacol. 2015; 172(1):1-23.
[4] Moreira FA, Dalley JW. Dopamine receptor partial agonists and addiction. Eur J Pharmacol. 2015;752: 112-115.
[5] Lazenka MF, Tomarchio AJ, Lichtman AH, et al. Role of Dopamine Type 1 Receptors and Dopamine- and cAMP-Regulated Phosphoprotein Mr 32 kDa in Δ9-Tetrahydrocannabinol-Mediated Induction of ΔFosB in the Mouse Forebrain. J Pharmacol Exp Ther. 2015; 354(3):316-327.
[6] Komal P, Estakhr J, Kamran M, et al. cAMP-dependent protein kinase inhibits α7 nicotinic receptor activity in layer 1 cortical interneurons through activation of D1/D5 dopamine receptors. J Physiol. 2015;593(16): 3513-3532.
[7] Hanami K, Nakano K, Saito K, et al. Dopamine D2-like receptor signaling suppresses human osteoclastogenesis. Bone. 2013;56(1):1-8.
[8] Furini CR, Myskiw JC, Schmidt BE, et al. D1 and D5 dopamine receptors participate on the consolidation of two different memories. Behav Brain Res. 2014;271: 212-217.
[9] Ishida M, Mitsui T, Izawa M, et al. Activation of D2 dopamine receptors inhibits estrogen response element-mediated estrogen receptor transactivation in rat pituitary lactotrophs. Mol Cell Endocrinol. 2013; 375(1-2):58-67.
[10] Grandy DK, Zhou QY, Allen L, et al. A human D1 dopamine receptor gene is located on chromosome 5 at q35.1 and identifies an EcoRI RFLP. Am J Hum Genet. 1990;47(5):828-834.
[11] Portmann T, Yang M, Mao R, et al. Behavioral abnormalities and circuit defects in the basal ganglia of a mouse model of 16p11.2 deletion syndrome. Cell Rep. 2014;7(4):1077-1092.
[12] Kato T. Molecular genetics of bipolar disorder and depression. Psychiatry Clin Neurosci. 2007;61(1): 3-19.
[13] Dollfus S, Campion D, Vasse T, et al. Association study between dopamine D1, D2, D3, and D4 receptor genes and schizophrenia defined by several diagnostic systems. Biol Psychiatry. 1996;40(5):419-421.
[14] Zhang C, Xie B, DU YS, et al. Gene-gene interaction between DNMT3B and DRD1 in schizophrenia. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2010;90(43):3059-3062.
[15] Howe AS, Leung T, Bani-Fatemi A, et al. Lack of association between dopamine-β hydroxylase gene and a history of suicide attempt in schizophrenia: comparison of molecular and statistical haplotype analyses. Psychiatr Genet. 2014;24(3):110-115.
[16] Del Zompo M, De Luca V, Severino G, et al. Haplotype association study between DRD1 gene and bipolar type I affective disorder in two samples from Canada and Sardinia. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2007;144B(2):237-241.
[17] Zhao L, Lin Y, Lao G, et al. Association study of dopamine receptor genes polymorphism with cognitive functions in bipolar I disorder patients. J Affect Disord. 2015;170:85-90.
[18] Seeman P. Schizophrenia and dopamine receptors. Eur Neuropsychopharmacol. 2013;23(9):999-1009.
[19] Yasuda J. TA cloning: a rapid and efficient method for cloning of the PCR products. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 1996;41(5):518-521.
[20] Zhou MY, Gomez-Sanchez CE. Universal TA cloning. Curr Issues Mol Biol. 2000;2(1):1-7.
[21] Palatinszky M, Nikolausz M, Sváb D, et al. Preferential ligation during TA-cloning of multitemplate PCR products--a factor causing bias in microbial community structure analysis. J Microbiol Methods. 2011;85(2): 131-136.
[22] Barriscale KA, O'Sullivan SA, McCarthy TV. A single secreted luciferase-based gene reporter assay. Anal Biochem. 2014;453:44-49.
[23] Alvarez ML. Faster experimental validation of microRNA targets using cold fusion cloning and a dual firefly-Renilla luciferase reporter assay. Methods Mol Biol. 2014;1182:227-243.
[24] Liu W, Chen W, Zhang P, et al. Molecular cloning and analysis of the human PCAN1 (GDEP) promoter. Cell Mol Biol Lett. 2007;12(4):482-492.
[25] Jiang AL, Zhang JY, Young C, et al. Molecular cloning and characterization of human homeobox gene Nkx3.1 promoter. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2004; 36(1):64-67.
[26] Büssow K. Stable mammalian producer cell lines for structural biology. Curr Opin Struct Biol. 2015;32: 81-90.
[27] Hookway C, Ding L, Davidson MW, et al. Microtubule- dependent transport and dynamics of vimentin intermediate filaments. Mol Biol Cell. 2015;26(9): 1675-1686.
[28] Masuda T, Wahlin K, Wan J, et al. Transcription factor SOX9 plays a key role in the regulation of visual cycle gene expression in the retinal pigment epithelium. J Biol Chem. 2014;289(18):12908-12921.
[29] Marques CL, Cancela ML, Laizé V. Transcriptional regulation of gilthead seabream bone morphogenetic protein (BMP) 2 gene by bone- and cartilage-related transcription factors. Gene. 2016;576(1 Pt 2): 229-236.
[30] Martínez F, Arif A, Nebauer SG, et al. A fungal transcription factor gene is expressed in plants from its own promoter and improves drought tolerance. Planta. 2015;242(1):39-52.
[31] Tian F, Wu M, Deng L, et al. Core binding factor beta (Cbfβ) controls the balance of chondrocyte proliferation and differentiation by upregulating Indian hedgehog (Ihh) expression and inhibiting parathyroid hormone-related protein receptor (PPR) expression in postnatal cartilage and bone formation. J Bone Miner Res. 2014;29(7):1564-1574.
[32] Joshi A, Pooley C, Freeman TC, et al. Transcription factor, promoter, and enhancer utilization in human myeloid cells.J Leukoc Biol. 2015 Feb 25.[Epub ahead of print]
[33] Liang LN, Zhang LL, Zeng BJ, et al. Transcription factor CAAT/enhancer-binding protein is involved in regulation of expression of sterol carrier protein x in Spodoptera litura. Insect Mol Biol. 2015;24(5): 551-560.
[34] Friedrich FW, Dilanian G, Khattar P, et al. A novel genetic variant in the transcription factor Islet-1 exerts gain of function on myocyte enhancer factor 2C promoter activity. Eur J Heart Fail. 2013;15(3): 267-276.
[35] Tao H, Wang L, Zhou J, et al. The transcription factor ccaat/enhancer binding protein β (C/EBPβ) and miR-27a regulate the expression of porcine Dickkopf2 (DKK2). Sci Rep. 2015;5:17972.
[36] Yao J, Ding M, Pang H, et al. Dopamine D1 receptor (DRD1) 5' region haplotypes significantly affect transcriptional activity in vitro. Neurosci Lett. 2015; 609:120-123.
[37] Deminoff SJ, Santangelo GM. Rap1p requires Gcr1p and Gcr2p homodimers to activate ribosomal protein and glycolytic genes, respectively. Genetics. 2001; 158(1):133-143.
[38] Katan-Khaykovich Y, Shaul Y. Nuclear import and DNA-binding activity of RFX1. Evidence for an autoinhibitory mechanism. Eur J Biochem. 2001;268 (10): 3108-3116.
[39] Epstein JA, Glaser T, Cai J, et al. Two independent and interactive DNA-binding subdomains of the Pax6 paired domain are regulated by alternative splicing. Genes Dev. 1994;8(17):2022-2034.
[40] Zhang W, Cveklova K, Oppermann B, et al. Quantitation of PAX6 and PAX6(5a) transcript levels in adult human lens, cornea, and monkey retina. Mol Vis. 2001;7:1-5.
[41] Wasylyk C, Kerckaert JP, Wasylyk B. A novel modulator domain of Ets transcription factors. Genes Dev. 1992;6(6):965-974.
[42] Magné S, Caron S, Charon M, et al. STAT5 and Oct-1 form a stable complex that modulates cyclin D1 expression. Mol Cell Biol. 2003;23(24): 8934-8945.
[43] Wu KJ, Wilson DR, Shih C, et al. The transcription factor HNF1 acts with C/EBP alpha to synergistically activate the human albumin promoter through a novel domain. J Biol Chem. 1994;269(2):1177-1182.
[44] Kerr LD, Ransone LJ, Wamsley P, et al. Association between proto-oncoprotein Rel and TATA-binding protein mediates transcriptional activation by NF-kappa B. Nature. 1993;365(6445):412-419.
[45] Feder JN, Jan LY, Jan YN. A rat gene with sequence homology to the Drosophila gene hairy is rapidly induced by growth factors known to influence neuronal differentiation. Mol Cell Biol. 1993;13(1): 105-113.

引言

多巴胺作为一种内源性神经递质，主要通过多巴胺受体调控其功能^[1]。多巴胺受体是能与多巴胺特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质^[2]。多巴胺受体(dopamine receptor，DRD)为7个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前已分离出5种类型(DRD1- DRD5)^[3-4]。根据它们的生物化学、药理特性和生理功能的差别，可分为D1类和D2类受体，两类受体的C端含有磷酸化和棕榈酰化位点，涉及激动剂依赖性受体的去敏感化过程和第四胞内环的形成^[5]。D1类受体的活化能使腺苷酸环化酶的活性增加，细胞内环化腺苷酸(cAMP)水平显著升高，D2类受体可以抑制腺苷酸环化酶的活性，使cAMP水平下降，还与细胞内其他第二信使系统相关联，包括激活钾通道，抑制钙通道及转换磷脂酰肌醇^[6-9]。人类DRD 5种亚型的基因位于不同的染色体上。DRD1基因位于第5号染色体短臂37区5带(5p37.5)，全长3 489 bp^[10]。人和大鼠的DRD1基因编码产物均为466个氨基酸，其同源性为91%，而跨膜部分的同源性为96%^[11]。DRD1受体基因的mRNA在纹状体、伏隔核和嗅结节等部位表达丰富，这些区域中DRD1受体的表达量也非常高^[12]。

DRD1基因启动子区的多态性位点会通过调控转录活性来影响DRD1的产量，进而影响多巴胺神经递质的代谢，有研究发现该基因启动子区的核苷酸多态性位点可能与精神分裂症、双相情感障碍等疾病的发生有关^[13-18]。有学者分析了131例精神分裂症患者和8例嗜酒者的多巴胺DRD1受体-48A/G基因多态性与精神分裂症的关系，二者之间缺乏关联性^[14]。研究发现DRD1基因的rs17799914与精神分裂症可能具有关联性，前质额叶的多巴胺功能缺损导致了精神分裂症患者的认知能力不足^[15]。Del Zompo等^[16]分析701个无关个体(男性：226例患者，171例健康个体；女性：111例患者，193例健康个体)的DRD1基因5个SNPs (rs11746641，rs11749676，rs251937，rs12518222，rs4867798)，发现在男性群体中，DRD1基因的rs11746641和rs11749676与精神分裂症具有相关性，单倍型分析表明T-A-T-C-T型可能与保护作用有关(P=0.008)，G-G-T-C- C型可能是危险因素(P=0.012)，在女性群体中未发现其与精神分裂症的相关性。Zhao等^[17]在对精神分裂症(373例精神分裂症患者，379例健康个体)的病因研究中发现DRD1基因的SNPs(rs4532，rs5326，rs2168631，rs6882300，rs267418)与精神分裂症的发生没有明显关联性。在对112例首发精神分裂症患者和60例健康对照者的认知功能及DRD1基因rs4532位点的基因分型的关联研究中发现rs4532多态性位点可能与精神分裂症患者执行功能损害有关^[18]。

目前，对DRD1基因启动子区的研究甚多，但仍未得出一个统一的结论，且很多研究多局限在对单独某一位点与疾病的回顾性分析，并未对具体调控做细致的分析。此研究拟通过构建含有DRD1基因启动子区序列的荧光素酶报告基因载体，细胞转染验证其表达活性，为进一步深入研究该基因的转录调控机制提供基础工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 设计 基因水平实验研究。

1.2 时间及地点 实验于2014年11月至2015年5月在沈阳医学院公共卫生学院实验室完成。

1.3 材料 核酸内切酶：KpnⅠ及10×Buffer、BglⅡ及10×Buffer(Thermo)；prime STAR HS DNA聚合酶、5×Buffer、dNTP、DNA A-Tailing Kit、Gel DNA Extraction Kit、2 000 bp DNA Ladder、琼脂糖、琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素(TaKaRa)；T₄ DNA连接酶及10×Buffer(Thermo)；pGM-T克隆试剂盒、TOP10感受态细胞(TIANGEN)；质粒小提试剂盒(离心柱型)(AXYGEN)；pGL3载体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)；无内毒素质粒大量提取试剂盒(转染级)(博迈德)；DMEM/F12(1∶1)培养基、DMEM/高糖培养基及胎牛血清(Hyclone)；opti-MEM培养基(Gibco，美国)；Lipofectamine^® 3000(Invitrogen)；人胚肾293细胞(上海生科院细胞库)。

1.4 方法

1.4.1 人DRD1基因启动子克隆取枸橼酸钠抗凝的人静脉血3 mL置于试管中，应用酚-氯仿法提取基因组DNA，所得DNA沉淀加适量的TE(10 mol/L Tris-HCl， 1 mol/L EDTA pH 8.0)溶解，溶解后的DNA于4 ℃保存。

应用Primer 5.0软件设计特异性引物，根据pGL3- Basic载体多克隆位点选定限制性内切酶(图1)。

PCR反应扩增引物：Forward(-1 990 bp): 5’-ggg gta ccc cgc atg gct gtt gtg gag att g-3’；Reverse (+10 bp): 5’-gaa gat ctt cgc aat gcg agg cag cga g-3’。划线部分分别为KpnⅠ和BglⅡ的酶切识别位点，引物委托生物公司合成(TaKaRa，大连)。

PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 1 min，复性60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min 10 s，循环35次；终末延伸72 ℃ 5 min。扩增片段长度2 001 bp (-1 990 bp至+10 bp)。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物。紫外光下切胶，并按照Gel DNA Extraction Kit说明书的操作步骤进行纯化。纯化后的PCR产物通过DNA A-Tailing Kit在3’端加一个碱基A后与pGM-T载体连接。

向铺好的含有氨苄青霉素的固体琼脂平板表面加入16 μL IPTG(50 g/L)、40 μL X-gal(20 g/L)，使用无菌枪头使其均匀地涂开，避光置于37 ℃放置1-3 h，使溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽快挥发干净。取5 μL连接产物加入50 μL TOP10感受态细胞中(感受态细胞应待刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴45 min。将离心管置于42 ℃水浴90 s，取出后立即置于冰浴中5 min，期间不可摇动离心管。向离心管中加入500 μL预热的LB培养基150 r/min、37℃振荡培养35 min。将离心管中的菌液混匀，吸取100 μL加到含有氨苄抗性的固体琼脂培养基上，用无菌枪头轻轻地将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37 ℃培养16 h。

将得到的白色菌落接种到2 mL LB(含有终质量浓度100 mg/L的氨苄青霉素)培养基，37 ℃振荡培养16 h，保存菌种后提取质粒。KpnⅠ和BglⅡ双酶切及测序验证插入的片段。验证无误的质粒在双酶切后切胶纯化，与pGL3-Basic载体连接。使用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取重组后的报告基因质粒，内对照质粒pGL3-TK和阴性对照质粒pGL3-Basic。

1.4.2 转染 HEK293细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基，在37 ℃，体积分数为5%CO₂，100%相对湿度条件下培养。将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic稀释至100 mg/L，内对照质粒pRL-TK稀释至10 mg/L；然后将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic与内对照质粒pRL-TK按5︰1，10︰1，20︰1混合。选择对数生长期细胞接种于24孔板(1×10⁵/孔)，待细胞生长密度达80%-90%且分布均匀即可进行转染。使用Lipofectamine^® 3000转染，转染后培养6 h更换新鲜的DMEM培养基，转染后24 h收集细胞。

1.4.3 双荧光素酶活性分析将上述24孔板中的细胞用500 μL 1×PBS洗涤1次，弃液，加入100 μL新鲜配置的1×PLB裂解液。于室温下在摇床振荡20 min以充分裂解细胞。在0.5 mL检测管中依次加入100 μL LARⅡ溶液、20 μL裂解液，混匀后将检测管放入Lumat3 LB9508管式发光检测仪检测孔中，延迟3 s，检测时间10 s，测定出萤火虫荧光素酶的活力，然后在检测管中加入 100 μL新鲜配置的1×STOP液，混匀后再检测海肾荧光素酶的活力。计算两种荧光素酶的活力比值，即相对荧光强度。

1.5 主要观察指标 萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶数值，荧光素酶报告基因的相对荧光强度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

DRD1基因5’端启动子区可能对基因表达活性具有不同的影响，进而影响多巴胺受体1在中枢神经系统中的数量。因此，进一步研究DRD1基因表达的调控机制，对深入研究DRD1基因与精神疾病的关系以及潜在的药物治疗靶点创造条件。

研究选择位于起始密码上游的片段作为目的片段(-1 990 bp至+10 bp)，片段长度2 001 bp。通过对pGL3-Basic载体多克隆位点的查阅，选择KpnⅠ和BglⅡ限制性内切酶识别位点来构建克隆载体。由于待插入的片段较长，先通过TA克隆筛选出具有黏性末端的片段，再与表达载体进行连接。TA克隆简单，成功率高，PCR扩增产物通过加A反应在末端加一个碱基A，而T载体的缺口有一个凸出的T，正好可以配对。该TA克隆技术比其他的PCR克隆方法有更高的重组效率，一般超过90%的阳性克隆含有目的DNA片段^[19-21]。

选用萤火虫荧光素酶表达载体检测转录活性主要有如下的优点：荧光素酶的测定非常灵敏，不需要放射性物质；其分析的线性范围可以超过8个数量级，因此少量细胞的裂解产物就可以满足实验需要；荧光素酶分析还可以在96孔板里进行，方便大量转染细胞后的测定^[22-23]。在双荧光素酶报告基因系统中，以TK启动子转录的海肾腔肠荧光素酶作为内对照，可以降低细胞数目和状态、转录和裂解效率等差异造成的误差，使得结果更加可靠和准确^[24-25]。

人HEK293细胞系胚胎肾细胞经腺病毒DNA剪切后转化而来。免疫染色、免疫印迹和微列阵分析表明该细胞表达神经丝(neurofilament，NF)亚基，NF-L，NF-M和NF-H以及通常在神经元表达的许多蛋白质^[26]，这表明此细胞和神经元会有意外的关联，也可能具有更多神经元特性的转录因子^[27-28]。另一个可能的解释是与神经细胞系相比，该细胞生长代谢速率更快，因而在转染后的相同时间内，荧光素酶产量更多。

启动子区主要通过转录因子来发挥转录活性的调控，转录因子有基础转录因子和调控性转录因子两种，前者与RNA聚合酶结合形成复合体，通过与转录起始位点临近的DNA启动子区结合来开始基因的转录^[28-30]；后者通常是与增强子序列进行结合，再与转录复合体发生作用，对基因在转录水平进行调控，例如组织、细胞和时间差异性^[31]。增强子没有严格的方向性，即可以在基因的上游，也可以在基因的下游，甚至是该基因的内部^[32-35]。在该基因启动子区内，目前已发现多种SNP位点会影响转录因子和DNA结构域的结合^[36]。Rs267410位点位于GCR转录因子核心识别位点的周围，可能会影响该转录因子与DNA的结合。GCR转录因子可以参与核糖体蛋白和糖酵解基因的转录，形成核糖体/GCR调控复合物，如亮氨酸拉链基序在Gcr1p和Gcr2p各自有两个特有的激活机制^[37]。Rs10063995位点位于RFX1转录因子的识别序列中，该转录因子能结合并调控多种病毒和细胞基因的增强子，属于进化上比较保守的RFX单倍家族，共享一个DNA结合结构域和保守的C-末端区域。该因子的核转运和DNA结合活性可以通过蛋白激酶的磷酸化进行协同调控^[38]。Rs10078714位点位于锌指蛋白作用域的核心序列中。锌指蛋白的氨基末端包含一个120个氨基酸的保守基序，可以抑制DNA的结合。Rs201568565位于PAX-6和c-Ets-1转录因子结合序列中，PAX-6含有一个保守的128个氨基酸组成的DNA结合基序，其突变会导致人虹膜的发育障碍^[39]，并且其表达的下降会降低人晶状体纤维的转录^[40]。C-Ets-1属于ETS家族，该家族蛋白有相似的A/CGG AA核心识别基序，并且有不同的反式激活属性^[41]。Rs146439723位点位于PAX-6识别序列之外，虽然不直接影响其对DNA序列的识别，但可能会对结合强弱有一定程度的影响。Rs35916350位点位于Oct-1/ HNF-1/c-Rel转录因子的识别序列内。Oct-1可以与其他因子形成复合体调控细胞周期蛋白D1的表达^[42]，HNF1转录因子可以与C/EBP作用来协同激活人白蛋白的启动子^[43]，而c-Rel转录因子可以与TATA-结合蛋白相互作用来发挥功能^[44]。Rs199763328位于Hairy转录因子识别序列内，该转录因子可能在哺乳动物早期胚胎发育过程中转导生长因子的信号^[45]。

综上，实验构建了含人DRD1基因启动子区的双荧光素酶报告基因系统，通过转染人真核细胞HEK293验证了其具有较强的转录活性，为进一步研究DRD1基因表达及转录调控机制提供了基础工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程