体外扩增NK细胞中非克隆性染色体异常的特征及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0645

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5362-5367.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0645

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

体外扩增NK细胞中非克隆性染色体异常的特征及意义

李玉龙，黄洲风，张磊，邬成业，程薇，董晓燕，朱尊民，孙恺

河南省人民医院血液病研究所，河南省郑州市 450002

修回日期:2018-06-04 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 孙恺，博士后，主任医师，河南省人民医院血液病研究所，河南省郑州市 450002
作者简介:李玉龙，男，1978年生，河南省郑州市人，汉族，2004年郑州大学医学院毕业，硕士，副主任技师，主要从事血液肿瘤遗传学研究。
基金资助:
河南省科技厅基础与前沿项目基金(142300410078)，项目名称：自然杀伤细胞在造血干细胞移植中双重角色的研究

The characteristics and significance of non-clonal chromosome aberrations in the in vitro expanded NK cells

Li Yu-long, Huang Zhou-feng, Zhang Lei, Wu Cheng-ye, Cheng Wei, Dong Xiao-yan, Zhu Zun-min, Sun Kai

Institute of Haematology, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450002, Henan Province, China

Revised:2018-06-04 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Sun Kai, MD, Chief physician, Institute of Haematology, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450002,Henan Province, China
About author:Li Yu-long, Master, Associate chief technician, Institute of Haematology, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450002, Henan Province, China
Supported by:
Fundamental and Frontier Project Fund of Henan Provincial Science and Technology Department, No. 142300410078

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
非克隆性染色体异常：是指在随机检测的20-40个中期分裂相中，如果染色体异常发生率小于4%，则所出现异常即为非克隆性染色体异常。
人工化抗原递呈细胞：通过基因工程技术，使K562细胞表面表达CD64、CD86、CD137L、截短型CD19和IL-21等抗原。NK细胞在捕获K562细胞同时，接触以上抗原，诱发刺激信号而增殖。

摘要
背景：非克隆性染色体异常在干细胞培养中较为常见且研究较多，而在体外扩增的NK细胞中研究甚少。
目的：探讨体外扩增NK细胞中非克隆性染色体异常的特征及意义。
方法：分离肿瘤患者和健康志愿者外周血单个核细胞，应用人工化抗原递呈细胞刺激NK细胞增殖，流式细胞术鉴定其表型，并测定其产生γ-干扰素的功能。传统G显带法分析NK细胞染色体异常。对两组NK细胞的非克隆性染色体异常发生率、分泌γ-干扰素的功能及两者相关性进行分析。
结果与结论：①7例肿瘤患者的NK细胞样本中，6例检测出非克隆性染色体异常，而在12例健康志愿者中，6例存在非克隆性染色体异常；②肿瘤组481个中期分裂相，其中17个含有非克隆性染色体异常；对照组785个中期分裂相，其中7个含有非克隆性染色体异常[3.53%(17/481) vs. 0.89%(7/785)，Z=-2.212，P=0.028]；③4例有放化疗病史的患者，其NK细胞中非克隆性染色体异常频率明显高于对照组(P=0.003)及初诊肿瘤患者(P=0.034)，而初诊患者与对照组并无明显差别(P=0.819)；④肿瘤组分泌γ-干扰素的NK细胞比例与对照组无明显差别(P=0.371)。NK细胞产生γ-干扰素水平与非克隆性染色体异常发生率亦无明显相关性；⑤实验首次探讨了以人工化抗原递呈细胞扩增的NK细胞中非克隆性染色体异常的特征，并初步研究了其与NK细胞功能之间的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5455-1922(李玉龙)

关键词: NK细胞, 非克隆性染色体异常, 放化疗, γ-干扰素

Abstract:

BACKGROUND: The significance of non-clonal chromosome aberrations (NCCAs) in in vitro expanded stem cells has been discussed in many studies; however, it is not well documented in the expanded NK cells.
OBJECTIVE: To investigate the characteristics and significance of NCCAs in the in vitro expanded NK cells.
METHODS: Peripheral blood mononuclear cells were isolated from patients with tumors and healthy controls. Artificial antigen presenting cells were used to stimulate the proliferation of NK cells. On the 7^th day of culture, the cells were collected for phenotype identification and interferon-γ secretion test by flow cytometry and for cytogenetic analysis by the conventional G-banding technique. The difference in the frequency of NCCAs and interferon-γ secretion between the two groups and the correlation between NCCAs and interferon-γ secretion were studied.
RESULTS AND CONCLUSION: NCCAs were found in 6 of 7 samples from the tumor patient group and 6 of 12 samples from the healthy controls. In the tumor patient group, 17 metaphases containing NCCAs were found out of 481 metaphases, and in the control group, 7 NCCA-containing metaphases were detected out of 785 metaphases [3.53% (17/481) vs. 0.89% (7/785), Z=-2.212, P=0.028]. Four patients with a history of chemoradiotherapy showed higher NCCA frequencies than those patients undergoing chemoradiotherapy (P=0.034) and the healthy controls (P=0.003). No difference was found between the newly diagnosed tumor patients and the healthy controls (P=0.819). The ratios of interferon-γ secreting NK cells in the two groups were not significantly different (P=0.371) and the correlation between the frequency of NCCAs and the interferon-γ secreting level was not identified. It was the first time that the characteristics of NCCAs in the artificial antigen presenting cells-expanded NK cells and the relationship between NCCAs and the NK cell function were preliminarily studied. The effect of NCCAs on the function and survival of NK cells in vitro and in vivo needs further investigations.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Killer Cells, Natural, Chromosomes, Interferon-gamma, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李玉龙，黄洲风，张磊，邬成业，程薇，董晓燕，朱尊民，孙恺. 体外扩增NK细胞中非克隆性染色体异常的特征及意义[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5362-5367.

Li Yu-long, Huang Zhou-feng, Zhang Lei, Wu Cheng-ye, Cheng Wei, Dong Xiao-yan, Zhu Zun-min, Sun Kai. The characteristics and significance of non-clonal chromosome aberrations in the in vitro expanded NK cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5362-5367.

图/表（结果） 2

2.1 NK细胞的免疫表型验证 目前，CD3^-CD16⁺CD56⁺被认为是NK细胞的表面标志。在培养的第7天，80.5%-91.2%的细胞呈现CD3^-CD16⁺CD56⁺表型(图1)，人工化抗原递呈细胞成功刺激了NK细胞的增殖(图2)。

2.2 肿瘤组和对照组NK细胞中检出非克隆性染色体异常人数及非克隆性染色体异常发生频率比较 人工化抗原递呈细胞的核型为复杂的克隆性染色体异常(图3)，而所有NK细胞样本中均未检测到克隆性染色体异常。FISH检测人工化抗原递呈细胞性别染色体为两个绿色X信号(图4)，表示K562细胞来自女性，因此异常的男性核型不可能源自人工化抗原递呈细胞污染。

在7例肿瘤患者的NK细胞样本中，6例检测出非克隆性染色体异常(图5)，而在12例健康志愿者中，6例检出非克隆性染色体异常，两者相比差异无显著性意义(85.71% vs. 50%，P=0.173)。

在肿瘤组中，共分析481个中期分裂相，发现含有非克隆性染色体异常的分裂相17个；在健康组中，共分析785个中期分裂相，发现含非克隆性染色体异常的分裂相7个，两者相比差异有显著性意义[3.53%(17/481) vs. 0.89% (7/785)，Z=-2.212，P=0.028]。

2.3 有/无放化疗史的个体NK细胞中非克隆性染色体异常的频率比较 4例有放化疗病史的患者，264个中期分裂相中发现含有非克隆性染色体异常的分裂相15个，明显高于对照组[5.68%(15/264)vs.0.89%(7/785)，Z=-2.991，P=0.003]及初诊肿瘤患者[5.68%(15/264) vs. 0.92%(2/217)，Z=-2.121，P=0.034]，而初诊肿瘤患者与对照组非克隆性染色体异常的频率差异无显著性意义[0.92% (2/217) vs. 0.89%(7/785)，Z=-0.229，P=0.819]，见表2。

2.4 肿瘤组与对照组NK细胞γ-干扰素表达水平比较 培养后肿瘤组与对照组NK细胞表达γ-干扰素水平差异无显著性意义[(28.41±3.54)% vs. (31.88±7.50)%，F=0.846，P=0.371]，接受过放化疗的患者与对照组以及初诊肿瘤患者相比，差异亦无显著性意义[(26.4±3.21)% vs. (31.88±7.50)%，F=2.847，P=0.114；(26.4±3.21)% vs. (32.1±5.63)%，F=2.135，P=0.204]。

2.5 NK细胞中非克隆性染色体异常与γ-干扰素分泌水平相关性分析 肿瘤组和对照组NK细胞中，非克隆性染色体异常与γ-干扰素表达水平均无明显相关性(r值分别为-0.472，-0.557，P值分别为0.285，0.06)。

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引言

材料方法

1.1 设计 前瞻性队列研究。

1.2 时间及地点 2015年2月至2016年7月在河南省人民医院血液病研究所完成。

1.3 对象 随机选取2015年在河南省人民医院就诊的初诊及正在接受治疗的肿瘤患者共7例(表1)。7例患者均经影像学及病理学明确诊断，且无免疫系统疾病。取材时，外周血白细胞均在正常范围内。

健康志愿者12名，男11名，女1名，平均年龄32.3岁。

肿瘤组与对照组间性别比例(P=0.123)及年龄比较(P=0.944)，差异均无显著性意义，具有可比性。

1.4 方法

1.4.1 NK细胞培养 抽取外周血30 mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以(2-6)×10⁸ L^-1的浓度接种于NK细胞培养基(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，与人工化抗原递呈细胞(浙江中赢方舟生物工程股份有限公司)按1∶2的比例共培养^[9]。每2 d或3 d半量换液1次，每7 d按1∶1的比例加入人工化抗原递呈细胞重新刺激NK细胞增殖。

1.4.2 流式细胞术鉴定NK细胞表型 在细胞第1个培养对数生长期(第7天)收集NK细胞，应用流式细胞仪检测细胞表面CD3，CD4，CD8，CD16和CD56(艾森生物杭州有限公司)分子的表达^[10]。

1.4.3 流式细胞仪检测NK细胞胞浆内γ-干扰素水平 在培养的NK细胞样本中加入10 μg/L美洲商陆有丝分裂原(PMA)、1 mg/L离子霉素(ionomycin)、5 mg/L Brefeldin A，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂温箱中孵育6 h；用洗剂(含体积分数为1%胎牛血清，0.02% NaN₃的PBS)清洗1次，加入CD3-APC和CD56-PE单克隆抗体，4 ℃孵育30 min；用200 μL固定缓冲液(含40 g/L多聚甲醛的PBS)室温固定20 min，然后用PBS清洗2遍，破膜剂(含体积分数为5%胎牛血清，0.1%皂素，0.02% NaN₃的PBS)清洗1遍，加入IFN-γ-FITC单抗，室温孵育15 min，流式细胞仪分析。

1.4.4 染色体核型分析 将NK细胞进行低渗，固定，按传统G显带方法处理，Metasystem全自动扫描系统扫描中期分裂相。每份样本分析50-100个分裂相，结果按照人类细胞遗传学国际命名体制2013进行描述。另外也对K562细胞的核型进行了分析，采用荧光原位杂交法检测K562细胞的性别染色体(K562细胞系来源于一位女性白血病患者)以排除所检测核型中存在滋养细胞的污染^[11]。

1.5 主要观察指标 非克隆性染色体异常的具体形式，非克隆性染色体异常发生率及分泌γ-干扰素水平。

1.6 统计学分析 两组间率的比较用卡方检验的Fisher精确概率法；两样本均数的比较用t 检验，方差不齐时用秩和检验；相关性分析用Pearson检验。统计学检验水准为双侧P < 0.05。统计学分析采用SPSS 17.0软件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

一直以来，克隆性染色体异常都是肿瘤遗传学研究的重点，其不仅增进了研究者对血液肿瘤甚至部分实体瘤发病机制的认识，而且促进了针对特定克隆性染色体异常的靶向性疗法的研究^[12]。而非克隆性染色体异常的重要性则相对被忽视了。非克隆性染色体异常早期被用来评估特殊职业人群暴露于致癌物后发生癌症的风险^[13]。肿瘤患者的外周血非克隆性染色体异常明显升高，尤其在接受过放化疗之后，提示非克隆性染色体异常和基因缺陷、疾病状态以及细胞的进化潜能密切相关^[14]。在该研究中，经人工化抗原递呈细胞刺激增殖的NK细胞，50%健康志愿者和85.71%肿瘤患者可发现非克隆性染色体异常，差异无显著性意义(85.71% vs. 50%，P=0.173)，说明伴随细胞的快速增殖，染色体复制，分裂过程中的错误增加是普遍现象。肿瘤患者中共分析481个中期分裂相，其中17个含有非克隆性染色体异常；健康志愿者中共分析785个中期分裂相，7个含有非克隆性染色体异常(3.53% vs. 0.89%，Z=-2.212，P=0.028)，说明肿瘤患者基因缺陷和基因组不稳定性明显高于正常人。通过进一步比较发现，肿瘤患者NK细胞中增高的非克隆性染色体异常，主要是由经历过放化疗的患者贡献的，其发生率远高于健康对照(5.68% vs. 0.89%，Z=-2.991，P=0.003)。而初诊患者非克隆性染色体异常的发生率与对照组比较差异无显著性意义(0.92% vs. 0.89%，Z=-0.229，P=0.819)，这也提示放化疗作为治疗肿瘤的手段，同时也促使肿瘤患者的基因组异质性和进化潜能显著提高，从而可能产生抵抗相应治疗的细胞个体^[15]。

该研究发现的非克隆性染色体异常，涉及2号染色体6次为最多，其中5次为长臂(q)，但位点各不相同，分别为q21、q31、q37以及2个无法确定。重复出现2次的位点包括5q35、6p22、9p24和9q34。在这些位点存在很多癌症相关基因，如2q31的HOXD13、HOXD11、HOXD1，其与NUP98，ETV6的融合见于多种血液髓系肿瘤。位于5q35的NPM1基因，具有多个伙伴基因，参与淋巴瘤、白血病、非小细胞肺癌的发生发展。位于6p22的DEK基因，9q34的SET基因，以及位于9p24的JAK2基因，也都以不同的融合基因形式出现于多种血液肿瘤之中^[16-21]。研究中并未发现上述热点基因参与的常见染色体异常，如t(2;11)，t(2;5)，t(3;5)，t(6;9)等。但是否涉及上述基因，以及该非克隆性染色体异常对细胞有何影响尚待研究。

已经证实的是，非克隆性染色体异常与染色体不稳定性关系密切，以染色体不稳定性为特征的肿瘤，升高的非克隆性染色体异常是染色体不稳定性的具体表现形式之一^[22-24]。非克隆性染色体异常的升高可在人外周血中被发现，而且通常伴随患癌概率的增高^[13]。敲除了抑癌基因ATM和/或P53的多种小鼠组织细胞，经过传代培养后，发现其非克隆性染色体异常的发生频率均明显高于对照组，表明肿瘤发生风险与非克隆性染色体异常发生率呈正相关^[24]。Ye等^[24]检测了多种代表不同阶段的肿瘤细胞系中的非克隆性染色体异常，发现集落形成能力以及对裸鼠的致瘤能力最强的细胞系总是伴随着最高的非克隆性染色体异常发生率。

NK细胞作为一种终末分化期细胞，其增殖依靠细胞因子或人工化抗原递呈细胞的刺激。一旦撤销刺激因素，NK细胞将不可避免走向凋亡^[25]。因此，体外扩增的NK细胞中虽然可发现不同比例的非克隆性染色体异常，但其主要反映了细胞基因组本身的缺陷以及快速扩增导致的染色体复制、分配和修复方面的错误^[14]。虽然干细胞体外培养能否导致细胞恶性转化的争论一直存在^[8]，但目前为止，未发现输注NK细胞致瘤或癌变的报道^[26]。

一种核型即代表一种独特的遗传信息，其生物学功能也必然有相应的改变。非克隆性染色体异常的发生以及不同非克隆性染色体异常的比例是否对NK细胞的功能产生影响尚不得而知。该实验检测了培养第7天NK细胞分泌γ-干扰素的能力，在肿瘤组与对照组之间差异无显著性意义(P=0.371)，亦未发现肿瘤组或对照组非克隆性染色体异常的发生率和NK细胞分泌γ-干扰素的功能之间有显著相关性(P值分别为0.285，0.06)。究其原因，作者认为主要是发生非克隆性染色体异常的细胞占NK细胞的比例并不高(该实验中最高为10%)，并不能对培养后的NK细胞整体功能产生足够的影响，目前尚无法对发生非克隆性染色体异常的细胞单独检测。由于该研究病例数目较少，无法针对放化疗剂量、药物种类、不同肿瘤病类型以及病理分期与非克隆性染色体异常和NK细胞功能之间的关系进行分组研究。但是，关于放化疗对NK细胞功能的影响，报道的差异较大。区大卫等^[27]报道54例鼻咽癌患者，放疗后NK细胞杀伤K562细胞功能显著降低。而刘晓静等^[28]报道28例放疗的中晚期食管癌患者，当累积剂量达20-30 Gy和40-60 Gy时检测NK细胞功能，发现其分泌穿孔素的能力显著增强。有报道称，如果放疗包含了血流丰富的纵膈区域，则患者NK细胞功能下降，如不涉及纵膈区，NK细胞功能不受影响^[29]。Ghiringhelli等^[30]发现对肿瘤患者小剂量、周期性应用环磷酰胺(50 mg，2次/d，口服，间隔1周，共4周)，可特异性杀伤调节性T细胞，降低其免疫抑制功能，从而增强NK细胞的功能。而Koda等^[31]研究了174例直肠癌患者，发现术前化疗显著损伤了Ⅰ到Ⅲ期患者的NK细胞功能。因此，放化疗对NK细胞功能到底产生何种影响与肿瘤类型、疾病分期、用药、患者自身状况等多种因素相关，无法一概而论。

虽然研究中未证实非克隆性染色体异常对于NK细胞功能有何影响，但是非克隆性染色体异常对细胞寿命的影响似乎是必然的。DNA损伤可以通过多条信号传导通路导致细胞凋亡。ATM、ATR蛋白可检测到诸如双链DNA断裂(double-strand breaks，DSBs)等损伤，传递信号激活检查点激酶1，2(checkpoint kinases，CHK)和P53。P53激活前凋亡因子如FAS、PUMA和BAX的转录，启动凋亡程序^[32]。非克隆性染色体异常的存在无疑将导致该类细胞的凋亡，缩短NK细胞的寿命。该研究中，NK细胞中发生非克隆性染色体异常的细胞比例最高为10%，但是考虑到人工检测的局限性，实际发生率也许更高。况且，放化疗通常都以DNA作为靶标，未检测到非克隆性染色体异常细胞中存在DNA损伤的比例尚难确定。因此，该类患者NK细胞回输后的生存时间和效能势必受到影响。

综上所述，作者发现在应用人工化抗原递呈细胞体外扩增的NK细胞中普遍存在非克隆性染色体异常，而具有放化疗史的肿瘤患者，其NK细胞的非克隆性染色体异常频率显著增高，并未发现具有较高频率非克隆性染色体异常的NK细胞样本整体分泌γ-干扰素的功能与对照组有明显差别。含有非克隆性染色体异常的NK细胞功能和回输后的生存时间以及遗传学检测在NK细胞过继性免疫治疗中的意义值得进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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