Foxp3，IDO在小鼠角膜移植免疫排斥反应的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0857

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
角膜移植免疫：角膜移植免疫反应是导致角膜移植术后失败的主要原因。常规角膜移植成功率较高，但高危角膜移植(新生血管、再次移植等)术后角膜植片存活率明显降低。角膜移植免疫反应具体发病机制尚未明确，是一复杂、多因素参与的反应过程，主要是以T淋巴细胞介导为主的迟发型超敏反应。
Foxp3：Foxp3是重要的负调节蛋白，是CD4+CD25+Tr发育及免疫功能的维持与转录因子，在调控CD4+CD25+Tr细胞的发育和功能发挥上起重要的作用。
IDO(吲哚胺2，3-二氧化酶)：是位于细胞浆中含亚铁血红素的酶，是色氨酸代谢的限速酶，它可通过降解局部组织中的色氨酸影响淋巴细胞的功能，在肿瘤逃逸、母胎耐受、慢性感染、自身免疫性疾病和移植免疫中发挥重要的免疫调节作用。

摘要
背景：移植免疫反应是导致角膜移植术后失败的主要原因，但其具体发病机制不明确。有研究报道，Foxp3和吲哚胺2，3-二氧化酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)与移植免疫有关。
目的：研究Foxp3，IDO在小鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用。
方法：以C57BL/6小鼠为供体，BALB/c小鼠为受体建立角膜移植实验模型。将30只BALB/c小鼠随机分为3组，正常组6只；角膜移植组12只；地塞米松治疗组12只。角膜移植组：给予生理盐水；地塞米松治疗组：给予地塞米松注射液10 mg/kg，分别于角膜移植术后0，2，4，6，8，10 d经腹腔注射给药。用裂隙灯观察移植排斥情况，免疫组织化学检测植片γ-干扰素表达，Real-time PCR检测植片内Foxp3 mRNA，IDO mRNA的表达。
结果与结论：①地塞米松治疗组发生排斥反应时间(20.667±1.033) d，较角膜移植组(14.833±1.472) d明显延迟(P < 0.05)；②角膜移植组术后第14天角膜植片内γ-干扰素及Foxp3 mRNA，IDO mRNA的表达较地塞米松治疗组明显增强(P < 0.05)；③结果提示，γ-干扰素及Foxp3，IDO在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用，降低角膜植片γ-干扰素及Foxp3，IDO表达可能有助于诱导耐受。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3170-9237(宫玉波)

关键词: Foxp3, 号IDO, 号组织构建, 号γ-干扰素, 号角膜移植

Abstract:

BACKGROUND: Immunological rejection reaction is the main cause of corneal allograft failure and its pathogenesis is still unclear. Foxp3 and indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) are reported to be associated with transplantation immunity.
OBJECTIVE: To study the roles of Foxp3 and IDO in mouse corneal allograft rejection.
METHODS: Routine penetrating keratoplasty was performed with C57BL/6 mice as donors and 30 BALB/c mice as recipients. The recipient mice were randomly divided into normal group (n=6), allograft group (intraperitoneal injection of normal saline solution for 6 times at 0, 2, 4, 6, 8 and 10 days after allograft, n=12) and dexamethasone group (intraperitoneal injection of 10 mg/kg dexamethasone, n=12). The graft rejection was evaluated under slit lamp microscope. Expression level of interferon-γ in grafts was detected by immunohistochemical staining. The expression levels of Foxp3 and IDO mRNA in grafts were detected by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The mean graft survival time in the allograft group was (14.833±1.472) days, and that in the dexamethasone group was (20.667±1.033) days (P < 0.05). The expression levels of interferon-γ as well as Foxp3 and IDO mRNA in grafts were significantly increased in the allograft group compared with the dexamethasone group (P < 0.05) at the 14th day postoperatively. These results suggest that Foxp3, IDO and interferon-γ play important roles in corneal allograft rejection; therefore, decreasing the expression levels of Foxp3, IDO and interferon-γ may contribute to inducing tolerance.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Interferon-gamma, Corneal Transplantation, Graft Rejection, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

角膜移植不仅是角膜病盲人复明的最主要手段，而且也是对因炎症、创伤等原因导致角膜破溃而实行的一种保护眼球的重要治疗手段，但术后的免疫排斥反应仍是手术失败的最主要原因^[1-2]。角膜移植免疫排斥反应是一多因素参与、极其复杂和高度调节的反应过程，具体发病机制仍不清楚，进一步研究其发病机制对抑制角膜排斥，诱导免疫耐受具有重要意义。

CD4⁺CD25⁺Tr(regulatory T cell，Tr)具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性，能通过直接细胞接触机制或分泌调节性细胞因子(白细胞介素10和转化生长因子β)机制主动抑制自身免疫细胞的活化，在维持机体免疫耐受和免疫应答稳态方面具有重要作用^[3-6]。Foxp3是重要的负调节蛋白，是CD4⁺CD25⁺Tr发育及免疫功能的维持与转录因子；给CD4⁺CD25^-T细胞转入Foxp3可使其具有CD4⁺CD25⁺Tr功能；Foxp3在调控CD4⁺CD25⁺Tr细胞的发育和功能发挥上起很重要的作用^[7]。Foxp3表达增加，大鼠同种异体心脏移植物的存活时间延长^[8]。吲哚胺2，3-二氧化酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)是位于细胞浆中含亚铁血红素的酶，是色氨酸代谢的限速酶，它可通过降解局部组织中的色氨酸影响淋巴细胞的功能，在肿瘤逃逸、母胎耐受、慢性感染、自身免疫性疾病和移植免疫中发挥重要的免疫调节作用^[9]。有研究表明，IDO修饰的间充质干细胞通过增加CD4⁺CD25⁺Tr表达及其调节功能^[10]，诱导同种异体移植耐受。该研究通过检测Foxp3，IDO在角膜移植免疫排斥反应中植片的表达，探讨其在角膜移植免疫中的作用。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2010年9月至2011年4月在解放军总医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6-8周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量18-22 g；6-8周龄雄性BALB/c小鼠，体质量18-22 g，清洁级，购自解放军总医院实验动物中心，许可证号：SYXK (军2012-0064)。

1.3.2 实验用试剂 TRIzol(Invitrogen)，反转录试剂盒(TransGen Biotech)，SYBR Real-time PCR Master Mix (Toyobo)。免疫组织化学试剂：兔抗小鼠γ-干扰素(IFN-γ)单克隆抗体(博奥森生物)；二抗试剂盒(康为世纪生物)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 C57BL/6小鼠12只为供体；将30只BALB/c小鼠随机(采用随机数字表)分为3组。正常组(6只)，其中4只小鼠角膜提取RNA用于Real-time PCR反应，2只小鼠角膜用于病理检查及免疫组织化学；角膜移植组(12只)；地塞米松治疗组(12只)。角膜移植组、地塞米松治疗组各12只，其中4只小鼠角膜提取RNA用于Real-time PCR反应，2只小鼠角膜用于病理检查及免疫组织化学，6只用于术后观察角膜移植植片的排斥情况及存活时间。角膜移植组给予不含药物的生理盐水，地塞米松治疗组给予地塞米松注射液10 mg/kg，分别于术后0，2，4，6，8，10 d腹腔注射。

1.4.2 小鼠同种异体角膜移植动物模型的建立受体选择右眼手术，供体提供双眼角膜。3%戊巴比妥钠2 mL/kg腹腔注射麻醉C57BL/6小鼠及BALB/c小鼠。术前10 min滴复方托品酰胺滴眼液及1%丁卡因滴眼液各3次。常规消毒铺巾，严格无菌操作，手术显微镜下进行角膜移植手术。首先于C57BL/6小鼠角膜钻取直径为1.5 mm植片，置于黏弹剂Healon中备用；于BALB/c小鼠右眼行穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty，PKP)，用直径1.5 mm环钻标记中央区角膜后，用角膜穿刺刀刺穿入前房，并向前房注入黏弹剂Healon，维纳斯剪沿标记印痕完成植床制作；将植片置于植床，以11-0尼龙线间断缝合6-8针，线结暴露不包埋；术后注入消毒空气形成前房。术毕散瞳，庆大霉素冲洗结膜囊，结膜囊内涂金霉素眼膏，缝合睑缘。术后 1 d拆除睑缘缝线，0.3%氧氟沙星眼药水点眼，每日3次，连用3 d。手术后7 d拆除角膜缝线。

1.4.3 小鼠同种异体角膜移植术后实验观察观察排斥反应及判断标准：术后14 d内每天行裂隙灯显微镜检查，14 d后隔日观察一次。判断标准参照Sonoda和Streilein 评分方法^[11]。

(1)角膜混浊评分：0分，植片完全透明清亮；1分，植片轻度上皮性混浊；2分，植片混浊加重前基质混浊，虹膜纹理可见；3分，深层基质轻度混浊，虹膜纹理隐约可见；4分，深层基质中度混浊仅可见瞳孔；5分，植片完全混浊，前房看不进。

(2)新生血管评分：0分，无新生血管；1分，植床周边有新生血管；2分，新生血管达植片周边部；3分，新生血管达植片中周部；4分，新生血管布满角膜植片。

(3)角膜植片排斥标准：以植片混浊评分和新生血管评分判定排斥，术后1周拆除角膜缝线后，角膜混浊减轻(一般混浊评分≤2分)，当角膜植片再次混浊加重，混浊评分≥3分，同时新生血管评分≥2分时即为排斥。

记录每只眼出现排斥反应的时间，即角膜植片存活时间。统计各组植片存活时间进行数据分析。由于手术等因素造成感染、前房出血、前房消失或术后5 d内发生严重角膜植片水肿、混浊及破坏，不归于角膜移植术后免疫排斥反应，并及时补充实验动物。

1.4.4 组织病理和免疫组织化学检查于术后第14天取角膜植片。动物麻醉处死后立即剪下完整角膜植片，将角膜组织置于体积分数10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，行病理学检查。同时做免疫组织化学检测，确定植片中γ-干扰素的表达。按试剂盒说明书进行抗体标记，DAB显色，最后采用苏木精复染。

1.4.5 移植角膜组织Foxp3 mRNA和IDO mRNA表达real-time PCR检测分别取正常角膜及移植术后第14天角膜组织，每组4只角膜组织提一个RNA标本。总RNA的提取：取液氮保存的小鼠角膜组织样品至冷冻的研钵中，加入液氮研磨呈粉状，转移至有1 mL TRIzol的离心管中，TRIzol法提取总RNA；根据反转录试剂盒说明合成cDNA；Real-time PCR仪扩增，以2^-^??Ct法计算基因相对表达量。目的基因Foxp3上游引物：5'-CCC AGG AAA GAC AGC AAC CTT-3'，下游引物：5'-TTC TCA CAA CCA GGC CAC TTG-3'；IDO上游引物：5'-GTC CGT GAG TTT GTC ATT-3'；下游引物：5'-GTA TCT ACT ATT GCG AGG TG-3'；内参GAPDH上游引物：5'-tct tgg gct aca ctg agg ac-3'，下游引物：5'-cat acc agg aaa tga gct tga-3'。Real-time PCR反应参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s， 60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40个循环；60-95 ℃缓慢升温，产生熔解曲线。

1.5 主要观察指标 ①角膜移植排斥反应时间；②角膜移植植片γ-干扰素蛋白表达；③角膜移植植片Foxp3，IDO mRNA 表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 11.5统计软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，两组间比较用t 检验；多样本均数比较应用单向方差分析(One-way ANOVA)，样本均数间的多重比较采用LSD检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

角膜移植是目前组织移植中成功率最高的手术，其主要是由于角膜不含血管和淋巴管，处于相对的免疫“赦免”区。但多种致病因素如严重感染、化学伤等破坏了角膜正常解剖学特性，对此类高危角膜行角膜移植，术后排斥反应发生率明显增加。角膜移植免疫排斥反应是一复杂、多因素参与的反应过程，主要是以T淋巴细胞介导为主的迟发型超敏反应。

此次实验结果表明：角膜移植组发生排斥反应时，γ-干扰素，Foxp3，IDO表达均明显增加，而地塞米松治疗组，γ-干扰素，Foxp3，IDO表达明显降低。

γ-干扰素：γ-干扰素是Thl细胞分泌的主要因子，它的作用主要是激活巨噬细胞，促进MHC分子表达和抗原提呈，在介导移植免疫反应中起重要的促进作用。Skurkovich等^[12]将抗γ-干扰素抗体用于治疗人穿透性角膜移植术后排斥反应，患者视力及植片混浊情况得到明显改善。降低γ-干扰素表达，有助于延长移植物存活时间^[13-15]。Foxp3是重要的负调节蛋白，是CD4⁺CD25⁺Tr发育及免疫功能的维持与转录因子；在调控CD4⁺CD25⁺Tr细胞的发育和功能发挥上起很重要的作用。IDO是位于细胞浆中含亚铁血红素的酶，是色氨酸代谢的限速酶。研究发现，IDO至少通过两种机制引起免疫耐受：①T细胞增殖中的G₁期中期对色氨酸非常敏感，IDO过度表达使色氨酸缺乏，T细胞不能有效的增殖和激活^[16]；②通过诱导Treg细胞的增殖^[17]，产生白细胞介素10和转化生长因子β来抑制T细胞的免疫功能^[18]。

该研究中，作者分别通过Real-time PCR及免疫组织化学技术检测移植术后14 d小鼠角膜植片中Foxp3，IDO及γ-干扰素的表达。同正常角膜相比，角膜移植组角膜植片内Foxp3，IDO及γ-干扰素高表达，而且该表达较地塞米松治疗组明显升高。根据实验结果作者认为角膜移植组角膜排斥反应发生时，植片内出现大量效应性T细胞，导致γ-干扰素因子高表达，而同时Foxp3，IDO高表达是对效应性T细胞的调节反应，有保护植片不被破坏的作用；但由于效应性T细胞的绝对增强，致使植片最终被排斥；而地塞米松治疗组由于抑制了效应性T细胞在植片的产生，因而植片内γ-干扰素及Foxp3，IDO表达均降低。角膜植片内γ-干扰素及Foxp3，IDO的低表达似乎是移植免疫耐受的重要标志。有研究表明Foxp3和IDO有助于移植器官耐受，移植器官耐受患者Foxp3及IDO表达升高^[19-23]。在小鼠同种异体角膜移植中，通过基因转染IDO于供体植片，使其高表达IDO则明显延长了植片的存活时间^[24]。IDO的表达可能与ACAID的形成有关^[25]。但也有研究表明移植物过度或高表达Foxp3和IDO并没有阻止排斥反应的发生，移植排斥反应时Foxp3和IDO表达增高^[26-27]。

总结：实验研究中发现，角膜移植免疫排斥反应发生时，γ-干扰素及Foxp3，IDO均高表达，降低其表达可能有助于诱导移植耐受。

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