实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型视神经炎发病机制：与辅助性T细胞亚群的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：视神经炎的病因多为自身免疫引起的炎性脱髓鞘，很多的视神经炎为多发性硬化的早期表现。在外周CD4⁺ T细胞中，有5%-10%为调节性T细胞，其免疫抑制能力很强。自身免疫性脑脊髓炎所引起的视神经炎发病机制是否与辅助性T细胞亚群的有关呢？
目的：分析实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型视神经炎发病机制与辅助性T细胞亚群的关系。
方法：将小鼠腹腔注射百日咳菌液建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，分别免疫11，15，19 d，并设腹腔注射生理盐水的佐剂组小鼠作对照。
结果与结论：酶联免疫吸附检测显示，与佐剂组相比，免疫后19 d组视神经白细胞介素4蛋白含量降低(P < 0.05)；免疫后11，15 d组视神经白细胞介素17蛋白含量升高(P < 0.05)；免疫后15，19 d组视神经干扰素γ蛋白含量升高(P < 0.05)；免疫后11，15，19 d组视神经Foxp3蛋白含量显著降低(P < 0.05)。实时PCR检测显示，与佐剂组相比，免疫后11，15，19 d组视神经中干扰素γ、Foxp3 mRNA表达降低(P < 0.05)，RORt mRNA表达升高；免疫后15，19 d组视神经中白细胞介素4，白细胞介素17，T-beat mRNA表达升高(P < 0.05)。免疫后19 d组GATA3 mRNA表达降低(P < 0.05)。结果证实，实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型视神经炎的发生发展可能受到Foxp3和调节性T细胞表达减少的影响，免疫后早期白细胞介素17可能介导对炎症损伤，发病高峰期干扰素γ可能使炎症损伤程度加重。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 实验性自身免疫性脑脊髓炎, 视神经炎, 辅助性T细胞亚群, 白细胞介素4, 白细胞介素17, 干扰素γ, Foxp3, 炎症损伤, 发病机制, 病理改变

Abstract:

BACKGROUND: More and more evidence have shown that autoimmune-induced inflammatory demyelinating mostly leads to optic neuritis that is quite an early manifestation of multiple sclerosis, but whether the pathogenesis of optic neuritis in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice is correlated with helper T cell subsets has rarely been reported.
OBJECTIVE: To analyze the correlation between pathogenesis of optic neuritis of mouse EAE model with helper T cell subsets.
METHODS: The mice were injected intraperitoneally Bordetella pertussis to establish EAE models. Then, the animal models were subjected to immunization for 11, 15, 19 days, respectively. Mice undergoing intraperitoneal injection of normal saline served as controls (adjuvant group).
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the adjuvant group, the protein expression of interleukin 4 in the optic nerve decreased in the 19-day immunization group (P < 0.05); the protein expression of interleukin 17 in the optic nerve increased in the 11- and 15-day immunization groups (P < 0.05); the protein expression of interferon γ in the optic nerve increased in the 15- and 19-day immunization groups (P < 0.05); the protein expression of Foxp3 in the optic nerve decreased in the 11-, 15- and 19-day immunization groups (P < 0.05). Real-time PCR results showed that compared with the adjuvant group, the mRNA expression of interferon γ and Foxp3 in the optic nerve decreased (P < 0.05), while mRNA expression of RORt increased in the 11-, 15- and 19-day immunization groups; the mRNA expression of interleukin 4, interleukin 17, T-beat increased in the 15- and 19-day immunization groups (P < 0.05); the mRNA expression of GATA3 reduced in the 19-day immunization group (P < 0.05). These results reveal that Foxp3 expression and helper T cell reduction have important influences on the development of optic neuritis in EAE mouse models, interleukin 17 may mediates inflammatory injury in the early stage, while interferon-γ makes inflammatory injury worse in the peak incidence of the disease.

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Key words: tissue engineering, T-lymphocytes, autoimmunity, T-lymphocyte subsets

中图分类号:

R318

姚汉云，文芳，董新宇 . 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型视神经炎发病机制：与辅助性T细胞亚群的关系[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6763-6768.

Yao Han-yun, Wen Fang, Dong Xin-yu. Correlation analysis of pathogenesis of optic neuritis with helper T cell subsets in a mouse experimental autoimmune encephalomyelitis model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6763-6768.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 纳入小鼠32只均进入结果分析，无死亡和感染，无脱失值。

2.2 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠行为学变化 小鼠运动功能障碍在免疫后14 d出现，临床神经功能评分逐渐升高，慢性进展型是其发病后的主要表现，见图1。

2.3 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经病理变化 免疫后0 d，小鼠的正常视神经具有较细的纤维和较为均匀的髓鞘密度(图2A)。免疫后11 d，少数髓鞘扭曲不规则，板层结构消失；视神经有髓神经轴索破坏，少数轴索内线粒体轻度肿胀(图2B)。免疫后15 d，多数小鼠增厚不规则或板层状结构具有疏松的排列，有髓神经轴索破坏，神经纤维髓鞘显著水肿(图2C)。免疫后19 d，绝大部分视神经均有较为显著的病变，表现为一定程度脱髓鞘；轴突呈均质状和空泡样，微管消失，甚至可见髓鞘塌陷；髓鞘板层状分离、剥脱，轴突髓鞘部分向内向外突起，或板层具有日益增大的分离范围，夹杂着髓鞘半环形套叠等，有间隙形成在轴突轴膜和髓鞘间，具有较低的电子密度，细胞器消失(图2D)。

2.4 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经白细胞介素4、白细胞介素17、干扰素γ及Foxp3蛋白含量变化 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经白细胞介素4蛋白含量免疫后19 d组实验性自身免疫性脑脊髓炎明显比佐剂组低 (P < 0.05)，但免疫后11 d组和免疫后15 d组之间的差异无显著性意义(P > 0.05)；实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经白细胞介素17蛋白含量免疫后11 d组和免疫后15 d组均明显比佐剂组高(P < 0.05)，但免疫后19 d组和佐剂组之间的差异无显著性意义(P > 0.05)；实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经干扰素γ蛋白含量免疫后15 d组和免疫后19 d组明显比佐剂组高(P < 0.05)，但免疫后11 d组和佐剂组之间的差异无显著性意义(P > 0.05)；实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经Foxp3蛋白含量免疫后11 d组、免疫后15 d组、免疫后19 d组均明显比佐剂组低(P < 0.05)，但免疫后11 d组、免疫后 15 d组、免疫后19 d组之间的差异均无显著性意义(P > 0.05)。见表2。

2.5 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经中白细胞介素4、白细胞介素17、干扰素γ及Foxp3 mRNA的表达 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经中白细胞介素4 mRNA表达免疫后11 d组、免疫后15 d组明显比佐剂组高(P < 0.05)，但免疫后19 d组和佐剂组之间的差异无显著性意义(P > 0.05)；实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经中白细胞介素17、T-beat mRNA表达免疫后15 d组、免疫后19 d组明显比佐剂组高(P < 0.05)，但免疫后11 d组和佐剂组之间的差异无显著性意义(P > 0.05)；实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经中干扰素γ、Foxp3 mRNA表达免疫后11 d组、免疫后15 d组、免疫后19 d组均明显比佐剂组低(P < 0.05)；实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经中RORt mRNA表达免疫后11 d组、免疫后15 d组、免疫后19 d组均明显比佐剂组高(P < 0.05)，同时免疫后11 d组、免疫后15 d组、免疫后19 d组之间的差异均显著(P < 0.05)；实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经中GATA3 mRNA表达免疫后19 d组明显比佐剂组低(P < 0.05)，但免疫后11 d组、免疫后15 d组和佐剂组之间的差异均无显著性意义(P > 0.05)。见表3。

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引言

视神经炎在神经眼科临床极为常见，属于急性或亚急性视神经炎症，西方国家相关医学文献报道，临床最为常见的视神经炎类型是原发性或特发性脱髓鞘性视神经炎，多发性硬化的发病受到该类型的视神经炎的直接而深刻的影响，在病理改变方面二者相同。流行病学研究表明，70%，10%-20%的多发性硬化患者中存在视神经炎、临床首发症状为视神经炎^[1]，同时其向多发性硬化转化的风险是很高的，因此说将视神经炎早期识别出来并对其进行及时有效的干预具有极为重要的临床意义。从现有资料来看，国内外很少有相关医学学者深入研究脱髓鞘视神经炎的分子免疫学，CD4⁺T辅助细胞(Th)作为免疫调节细胞发挥着极为重要的作用，依据其分泌的细胞因子不同将其分为Th1、Th2细胞亚型，Th1、Th2细胞分别主要对白三烯(IFNC)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子和白细胞介素4，6，10(IL-4，6，10)等细胞因子进行分泌，主要作用分别为促炎症反应和抗炎。

许多的证据表明，视神经炎的病因多为自身免疫引起的炎性脱髓鞘，相当多的视神经炎为多发性硬化的早期表现。从现有资料看，国内外脱髓鞘性视神经炎的分子免疫学研究并不多见，传统理论认为，在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)/多发性硬化疾病中，存在着Th1/Th2的失衡，Th1类细胞因子可以加重实验性自身免疫性脑脊髓炎炎性反应的症状，而ThZ类细胞因子起着调节性的效应。最近研究发现一类不同于Th1和ThZ的细胞亚群，它们不表达白细胞介素4或干扰素γ，却高水平分泌白细胞介素17，被命名为Th17细胞。Th17细胞被证实能通过分泌炎症递质白细胞介素17诱导严重的自身免疫反应，缺失Th17细胞能防止或减轻自身免疫性脑脊髓炎等自身免疫病的发病。此外研究发现，CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞在预防自身免疫性疾病方面发挥重要作用，其数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生。

最近有相关医学学者研究表明，Th17细胞对严重的自身免疫反应进行有效诱导的途径为通过对炎症递质白细胞介素17的分泌，其和Th1和Th2细胞亚群不同，不对白细胞介素4或干扰素C进行表达，但是却能够将白细胞介素17高水平地分泌出来^[2]。在外周CD4⁺ T细胞中，有5%-10%为调节性T细胞(CD4⁺ CD25⁺ regulatory T cell，Treg)，其免疫抑制能力很强。叉头蛋白3(Foxp3)属于FOX蛋白，是Treg 的特异性标志，CD4⁺ CD25⁺调节性T细胞是其表达的主要场合，有效调节着Treg发育和发挥功能。以往相关医学学者在实验性自身免疫性脑脊髓炎/多发性硬化发病机制的研究中给予了脑和脊髓病变以普遍的关注和充分的重视，但是很少有医学学者深入研究视神经病变，特别是小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型视神经中辅助性T细胞亚群的变化很少有医学学者研究报道^[3]。

实验分析了实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型视神经炎发病机制与辅助性T细胞亚群的相关性，以期为临床有效防治视神经炎提供依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年1月至2014年5月在武汉市第一医院动物实验室完成。

材料：健康雌性野生型C57BL/6小鼠(SPF15)32只，鼠龄6-8周，平均(7.1±2.6)周，体质量16-18 g，平均(17.0±2.5) g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SOXK(沪)2007-0005。

方法：

分组及实验性自身免疫性脑脊髓炎模型制备：购进动物后进行2周的适应性喂养，然后依据随机数字表法将其分为佐剂组(8只)和模型组(24只)2组，其中模型组又随机分为3组，即免疫后11 d组(8只)、免疫后15 d组(8只)、免疫后19 d组(8只)。

在2.5 mL生理盐水中溶解10 mg MOG35-55，在 2.5 mL CFA(TB 1 g/L)中溶解17.5 mg TB，将抗原乳剂(MOG 200 g/mL，TB 4 g/L)充分乳化制备出来。分别将两个进针点在两组小鼠背部中线两侧选定，然后给予两组小鼠皮下注射相应抗原，每只0.2 mL，将对照设为生理盐水，将第0天设为免疫当天，第0、2天给予佐剂组小鼠腹腔注射0.1 mL生理盐水，给予模型组小鼠腹腔注射0.1 mL百日咳菌液。第7天运用相同的抗原乳剂对两组小鼠进行重复免疫^[4]。

行为学观察：对小鼠进行MOG免疫后，定期对小鼠的功能进行评分，1次/d，MOG免疫后19 d停止该评分工作。严格依据实验性自身免疫性脑脊髓炎症状评分标准进行评分，即如果小鼠无任何临床症状，则评为0分；如果小鼠尾部张力消失，不太笨拙轻度则评为1分；如果小鼠双后肢无力，恢复的条件为被动翻身，则评为2分；如果小鼠双后肢瘫痪，恢复的条件为给予其刺激，则评为3分；如果小鼠双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁，则评为4分；如果小鼠处于频死状态或死亡，则评为5分^[5]。

标本收集及形态学观察：分别分批处死各组小鼠的时间为免疫后11，15，19 d，低温下为快速取出的双侧视神经匀浆后，运用ELISA法对其上清液进行检测，96孔板直接离心，将上清部分小心转入干净的空白96孔板，1 000-2 000 r/min，5 min。-80 ℃冻存1-6个月。不能低于ELISA试剂盒的检测灵敏度范围。体积分数2.5%戊二醛固定后制备电镜切片，制备过程中运用常规方法。在冻存管中放置预冷清洗后的PBS，冻存管经DEPC处理过，然后将其投入液氮罐，4 h后将其放置在-70 ℃的冰箱中，备用^[6]，进行免疫组织化学DAB染色，观察视神经形态。

白细胞介素17、白细胞介素4、干扰素γ细胞因子检测：加入酶标板后严格依据试剂盒说明书中的检测程序运用ELISA双抗体夹心ABC法进行检测，将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物，通过比色，测知标本中抗原的量。加入TBM显色前充分洗板，在酶标仪上放置反应板后制备标准曲线，制备过程中严格依据读出的吸光度值，然后有效计算出小鼠视神经组织中白细胞介素4，白细胞介素17，干扰素γ蛋白含量^[7]。

RT-PCR检测：RNA提取及反转录反应。对各组视神经总RNA进行抽取，抽取过程中运用Trizol法，反转录RNA标本之前对其进行稀释后，反应体系为2 μL 5× Buffer， 0.5 μL RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5 μL OligodT (50 μmol/L)，1.0 Total RNA(1 g/L)，0.5 μL Random 6 mers，RNase Free dH₂O up to 20 μL，反应条件为先后37 ℃和85 ℃分别15 min和5 s。委托TaKaRa公司合成引物(表1)，用蒸馏水配成浓度为0.2 μmol/L，配置过程中严格依据说明书，对制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系为10 μL SYBR-green(2×)，0.4 μL PCR Forward Primer，0.4 μL PCR Reverse Primer，0.4 μL ROX Reference DyeII (50×)，预变性、变性、退火先后95 ℃，95 ℃，60 ℃分别10 s、5 s、34 s检测关，延伸72 ℃ 45 s检测开，变性、退火、延伸重复45个循环。将标准曲线绘制出来，绘制过程中严格依据标准品梯度的测量结果，进而将各样品所测基因含量计算出来，各样品目的基因和管家基因(GAPDH)的含量之比即为样品校正后的基因相对含量^[8]。

主要观察指标：实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠行为学变化，视神经超微结构，实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经白细胞介素4、白细胞介素17、干扰素γ及Foxp3蛋白和mRNA的表达。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，用单因素方差分析法进行多组间均数差异的比较，检验水准α=0.05。

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讨论

目前临床上均没有深入系统地研究视神经炎的发病机制，近年来，相关医学研究表明，细胞因子白细胞介素17引发炎症的机制为其能够将启动并刺激多种细胞，引发多种致炎性细胞因子及化学因子等，而细胞因子白细胞介素17的产生主体为活化的T细胞，其致炎性较强，缺失Th17 细胞能够促进自身免疫病的发病的显著减轻甚至对其进行有效的防止，如自身免疫性脑脊髓炎等^[9-31]。此外，相关医学研究表明，在对外周免疫耐受的维持中，CD4⁺ CD25⁺调节性T细胞发挥着极为重要的作用，自身免疫性疾病可能在其数量减少或功能缺失的情况下发生^[14]。但是，现阶段临床还没有深入系统地研究实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经中不同辅助性T细胞亚群及其细胞因子的表达规律。国外相关医学学者动态分析了实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠局部组织检测到的炎症递质，结果表明在高峰时间出现方面，白细胞介素17比干扰素γ早；但是在维持时间方面，干扰素γ比白细胞介素17长，说明Th1及Th17的分化表达的一个主要特点就是阶段性^[15]。实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠早期视神经炎的发病中Th17细胞发挥着至关重要的作用^[32-48]，而后期组织炎症反应中Th1细胞发挥着至关重要的主导作用；白细胞介素4和Foxp3发挥作用的时间可能不同，而Foxp3 mRNA和Treg细胞具有相同的表达频率，在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠视神经的早期分化中，Treg的功能受到了一定程度的限制。由于本次实验样本量较小，结果具有一定的局限性，仍需要相关医学学者对此进行进一步深入细致的分析研究。

总之，本次实验显示，实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型视神经炎的发生发展可能受到Foxp3和Treg表达减少的重要影响，早期阶段白细胞介素17对炎症损伤进行介导，发病高峰期干扰素γ使炎症损伤程度加重。在视神经炎的诊断中，对不同阶段白细胞介素17、干扰素C、Foxp3 基因表达进行检测可以作为临床采用的一种主要手段，而在视神经炎的防治中，运用药物或其他手段对Th1/Th2、Th17/Treg亚群进行有效的调节，使其处于平衡状态，进而有效抑制促炎细胞因子分泌可以作为临床采用的一种主要方法和措施。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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