树突状细胞体外成熟及免疫功能的18F-FDG评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (42): 6758-6762.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.007

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树突状细胞体外成熟及免疫功能的¹⁸F-FDG评价

雷霄¹，梁英魁¹，赵文锐¹，王升¹，郭峰¹，傅强²

1解放军海军总医院核医学科，北京市 100048
2珠江医院心血管内科，广东省广州市 510282

修回日期:2014-09-11 出版日期:2014-10-08 发布日期:2014-10-08
通讯作者: 傅强，博士，副主任医师，副教授，珠江医院心血管内科，广东省广州市 510282
作者简介:雷霄，男，1979年生，湖北省荆州市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事心脏及肿瘤核医学、免疫机制等研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2010B031500030)；海军总医院创新培育基金项目(CX201112)

¹⁸F-FDG effects on maturation and immune function of dendritic cells in vitro

Lei Xiao¹, Liang Ying-kui¹, Zhao Wen-rui¹, Wang Sheng¹, Guo Feng¹, Fu Qiang²

1Department of Nuclear Medicine, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
2Department of Cardiovascular Medicine, Zhujiang Hospital, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Revised:2014-09-11 Online:2014-10-08 Published:2014-10-08
Contact: Fu Qiang, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Department of Cardiovascular Medicine, Zhujiang Hospital, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
About author:Lei Xiao, Master, Attending physician, Department of Nuclear Medicine, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
Supported by:
the Science and Technology Plan Project of Guangdong Province, No. 2010B031500030; the Innovative and Culture Fund of Navy General Hospital, No. CX201112

摘要/Abstract

摘要：

背景：既往研究表明，不同剂量的电离辐射对树突状细胞的成熟、免疫功能等也可能有一定的影响。
目的：分析不同浓度的¹⁸F-FDG对体外培养的人外周血单个核细胞源性树突状细胞的成熟及免疫功能的影响。
方法：人外周血单个核细胞源性树突状细胞诱导成熟后，分为5组，分别加入含PBS及92.5×10⁴，185×10⁴，370×10⁴，740×10⁴ Bq/mL浓度的¹⁸F-FDG培养基，作用24 h后收集细胞，检测树突状细胞的凋亡率、细胞表型(CD1α、CD80、CD83、CD86、HLA-DR)表达、同种混合淋巴细胞反应及细胞培养上清液中的巨噬细胞炎性蛋白1α和单核细胞趋化因子1表达。
结果与结论：740×10⁴ Bq/mL浓度的¹⁸F-FDG可以引起树突状细胞的凋亡、CD86的表达下调，同种T细胞抗原提呈能力下降，单核细胞趋化因子1的分泌下降；其余浓度的¹⁸F-FDG对树突状细胞的成熟及免疫功能无明显影响。结果表明较低浓度的¹⁸F-FDG对树突状细胞的凋亡、成熟、抗原提呈、迁移能力等影响较小，可以在选择合适浓度的前提下作为一种树突状细胞细胞的体外标记物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 树突状细胞, 凋亡, 细胞表型, 免疫功能, 趋化因子

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that different doses of ionizing radiation may have some impact on maturation and immune function of dendritic cells.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of ¹⁸F-FDG with different concentrations on maturation and immune function of dendritic cells from human peripheral blood mononuclear cells in vitro.
METHODS: Human peripheral blood mononuclear cells-derived mature dendritic cells were divided into five groups: PBS, 92.5×10⁴, 185×10⁴, 370×10⁴, 740×10⁴ Bq/mL ¹⁸F-FDG were separately added into each group. Dendritic cells were collected 24 hours later. Apoptosis rate, phenotypic expression (CD1α, CD80, CD83, CD86, HLA-DR), ability of mixed lymphocyte reaction and expression of macrophage inflammatory protein 1α and monocyte chemotactic factor-1 in cell culture supernatant were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Apoptosis rate, phenotypic expression of CD86, ability of mixed lymphocyte reaction and expression of monocyte chemotactic factor-1 were down-regulated after culture in 740×10⁴ Bq/mL ¹⁸F-FDG. However, ¹⁸F-FDG at other concentrations had no influence on maturation and immune function of dendritic cells. This study demonstrates that low-concentration ¹⁸F-FDG has little influence on apoptosis, maturation, antigen presentation, and migratory capacity of dendritic cells, and it may be selected at an appropriate concentration as a label for dendritic cells in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: dendritic cells, chemotactic factors, immunity

中图分类号:

R318

雷霄，梁英魁，赵文锐，王升，郭峰，傅强. 树突状细胞体外成熟及免疫功能的¹⁸F-FDG评价[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6758-6762.

Lei Xiao, Liang Ying-kui, Zhao Wen-rui, Wang Sheng, Guo Feng, Fu Qiang. ¹⁸F-FDG effects on maturation and immune function of dendritic cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6758-6762.

图/表（结果） 1

2.1 树突状细胞形态学观察 光镜下，成熟树突状细胞悬浮，部分细胞聚集成簇，细胞表面可见数量不等、形态不一的树突样突起。电镜下，细胞呈不规则形，表面粗糙，胞体有形态不一的突起。

2.2 ¹⁸F-FDG对树突状细胞凋亡的影响 凋亡率均数在各组间比较，差异有显著性意义(F=11.111，P=0.000)；740×10⁴ Bq/mL与其余各组比较，凋亡率增高，差异有显著性意义(P_5vs1=0.000，P_5vs2=0.000，P_5vs3=0.000， P_5vs4；其余各组间凋亡率比较，差异无显著性意义(P > 0.05)(图1)。=0.000)

2.3 ¹⁸F-FDG对树突状细胞成熟和分化的影响 CD86表型表达均数在各组间比较，差异有显著性意义(F=7.104，P=0.001)，其中740×10⁴ Bq/mL与185×10⁴ Bq/mL比较，CD86表型表达均数下降，差异有显著性意义(P_5vs3=0.000)。CD1α、CD80、CD83、HLA-DR表型表达均数在各组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 ¹⁸F-FDG对树突状细胞同种混合T淋巴细胞反应的影响 混合T淋巴细胞反应cpm值在各组间比较，差异有显著性意义(F=3.103，P=0.024)；740×10⁴ Bq/mL分别与对照组、92.5×10⁴ Bq/mL组、370×10⁴ Bq/mL比较，cpm值降低，差异有显著性意义(P=0.024，P=0.003，P=0.009)；其余各组间cpm值比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.5 ¹⁸F-FDG对树突状细胞上清液趋化因子分泌的影响 树突状细胞培养上清液内巨噬细胞炎性蛋白1α表达量各组间比较，差异无显著性意义(F=2.034，P=0.106)；单核细胞趋化因子1表达量各组间比较，差异有显著性意义(F=3.984，P=0.008)，其中740×10⁴ Bq/mL分别与对照组、92.5× 10⁴ Bq/mL组、370×10⁴ Bq/mL比较，单核细胞趋化因子1表达量较低，差异有显著性意义(P_5vs1=0.000，P_5vs2=0.008，P_5vs4=0.024)，见表2。

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引言

树突状细胞是免疫过程中负责抗原呈递的细胞，是机体内功能最强的专职抗原呈递细胞，在免疫应答的诱导和调节中起重要作用。研究证实其在肿瘤、器官移植、冠心病等疾病的进展过程中起重要作用，体外培养并定向诱导成熟的树突状细胞能通过其特异性的表面标记物和信号传导通路，向病变局部趋化及归巢^[1-2]。鉴于此，如何示踪其在免疫相关疾病的趋化、归巢及分布成为研究的热点之一。

¹⁸F-FDG是临床常用的正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)显像药物，可通过与葡萄糖相同的转运载体进入细胞内，以6-磷酸-FDG的形式滞留在细胞内^[3]；体外培养的细胞也能摄取FDG并存留在细胞内，¹⁸F的半衰期为1.83 h，衰变产生的β⁺粒子的丰度为96.9%，平均能量为0.635 MeV，发射的正电子在组织中即失去动能并产生电离辐射效应。

电离辐射对机体的免疫力有重要影响，临床上也用其特性进行放射性治疗。电离辐射除了杀伤辐射敏感的细胞外，也对辐射抵抗细胞的功能有一定的影响。虽然树突状细胞是一种辐射抗性较高的免疫细胞，但既往研究表明，不同剂量的电离辐射对树突状细胞的成熟、免疫功能等有一定的影响^[4-5]。低剂量电离辐射作用后不同时间，在免疫应答中起重要作用的共刺激分子的表达及细胞因子含量出现明显不同，主要表现为照射后表面共刺激分CDS0、CD28表达的上调，正向调节细胞因子白细胞介素12、γ干扰素含量的增加，且两者之间具有相互促进、相互协同的作用，而起负性调节的细胞因子转化生长因子β1含量则降低，提示白细胞介素12、γ干扰素的增加及转化生长因子β1含量的下调可能是低剂量免疫兴奋效应的主要原因^[5]。

在体外实验中，光化学疗法可以减弱脂多糖对树突状细胞成熟的诱导作用，并导致树突状细胞的凋亡^[6-7]。而在体内研究中，经电离辐射可以使受辐射组织中的未成熟树突状细胞迅速下降，其原因可能为辐射区域的炎症诱导树突状细胞的迁移与凋亡^[8-9]。

基于以上研究及理论，实验选择树突状细胞作为研究对象，体外培养树突状细胞后并摄取¹⁸F-FDG，观察¹⁸F-FDG电离辐射对树突状细胞的成熟及免疫功能的影响，为进一步研究能否采取¹⁸F-FDG体外标记树突状细胞奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：随机对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2011年12月至2012年12月在解放军海军总医院中心实验室完成。

材料：外周血采集自10名年龄22-35岁健康男性，受试者自愿参加。

实验方法：

细胞培养及分组：20 mL外周血标本添加到等体积的淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min，收集中间云雾状细胞层，PBS稀释至45 mL，吹打混匀后1 500 r/min离心15 min，弃上清液后加入4 mL含双抗的体积分数为10%胎牛血清1640培养液，在37 ℃、体积分数5%的CO₂饱和湿度培养箱中培养，2 h后吸出未贴壁的细胞，PBS轻柔冲洗培养瓶，收集外周血单个核细胞。同时收集上清液，将预温的RPMI-1640+体积分数10%胎牛血清5 mL注入吸管平衡尼龙毛柱，37 ℃静置30 min待用，用注射器吸取 1 mL上清液垂直加入毛柱，再加入数滴RPMI-1640+体积分数10%胎牛血清后平放毛柱于灭菌饭盒内，37 ℃培养 60 min，然后将用注射器吸取5 mL预温的RPMI-1640注入尼龙毛柱洗脱T细胞，离心弃上清。沉淀即为收集的T淋巴细胞。

外周血单个核细胞加入含20 μg/L hGM-CSF及20 μg/L hIL-4的GroDC培养基，于体积分数5%CO₂37.5 ℃环境中，采取隔日洗涤换液的方式继续培养5-7 d后收集成熟树突状细胞。将每份树突状细胞标本分为等细胞数的5份，随机分配于对照组及4个实验组(92.5×10⁴- 740×10⁴Bq/mL)中；对照组加入含BPS的GroDC培养基，4个实验组分别加入含92.5×10⁴，185×10⁴，370×10⁴，740×10⁴ Bq/mL¹⁸F-FDG的GroDC培养基^[2]，作用24 h后收集细胞，光镜观察细胞形态，检测树突状细胞的凋亡、细胞表型(CD1α、CD80、CD83、CD86、HLA-DR)表达、同种混合淋巴细胞反应及细胞培养上清液中的趋化因子巨噬细胞炎性蛋白1α和单核细胞趋化因子1表达。

树突状细胞流式细胞仪检测：按照试剂盒说明书检测细胞凋亡及CD1α、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达。检测结果在计算机上用Cell Qust Plot软件分析数据，计算获得阳性细胞百分数。

同种混合T淋巴细胞反应：将经丝裂霉素处理的树突状细胞按1∶50的树突状细胞∶T细胞比例加入96孔板与细胞浓度为2×10⁹ L^-¹的T淋巴细胞混合，培养96 h后收集细胞用液态闪烁计数仪测定放射性。结果以每分钟放射计数(cpm)值表示。

趋化因子巨噬细胞炎性蛋白1α和单核细胞趋化因子1检测：按照酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒说明操作进行，测量A₄₅₀值。每个标准品和标本的A值应减去零孔的A值。手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，A值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的A值可在标准曲线上查出其浓度。

主要观察指标：①树突状细胞形态学观察。②¹⁸F-FDG对树突状细胞凋亡的影响。③¹⁸F-FDG对树突状细胞成熟和分化的影响。④¹⁸F-FDG对树突状细胞同种混合T淋巴细胞反应的影响。⑤¹⁸F-FDG对树突状细胞上清液趋化因子分泌的影响。

统计学分析：所有实验数据以x(_)±s表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验；P < 0.05认为差异有显著性意义。所有统计学处理均采用SPSS 16.0统计软件进行分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

电离辐射对于树突状细胞凋亡的研究结果显示，30 Gy的γ射线可以诱导树突状细胞的凋亡，失去经脂多糖处理后的正常成熟能力，提示大剂量的γ射线治疗在体内可引起树突状细胞凋亡^[6^，^10]。本实验中较低浓度的¹⁸F-FDG干预并未影响树突状细胞凋亡率，表明树突状细胞对细胞内辐射有一定的抗性；但较大剂量的细胞内辐射仍可以引起树突状细胞的凋亡。

电离辐射对于树突状细胞的表面分子表达的研究结果存在分歧。日本有报道称0.05 Gy γ射线照射并不改变树突状细胞MHCs或者共刺激分子的表达^[11]，且多数研究认为电离辐射对树突状细胞的表面分子表达无明显影响^[12-14]。但也有研究发现不同剂量(0.1-0.5 Gy)X射线照射后使树突状细胞的HLA-DR、CD86和CD40分子表达上调，CD80分子表达下调^[15-16]。其结果的不一致可能受多种因素的影响，但树突状细胞的大多数表面分子表达受电离辐射影响较小。本实验中，细胞内辐射并未影响树突状细胞表面的CD1α、CD80、CD83、HLA-DR的表型表达，但大剂量辐射引起了CD86的表达下调，机制尚不明确。

在辐射对树突状细胞抗原提呈功能影响的研究中，单纯照射的树突状细胞对T细胞的激活程度明显小于将树突状细胞与T细胞共培养并给予照射后的激活程度^[16]；树突状细胞在培养早期阶段接受0.5 Gy以下的X射线照射，会降低抗原提呈能力及致敏T细胞杀伤A549的能力^[17]。但临床放疗导致的DNA损害甚至细胞死亡可以导致细胞微环境的改变，通过树突状细胞表面的一些Toll样受体、LOX-1 scavenger受体和FcγR分子捕获呈递^[18-19]，说明辐射对树突状细胞抗原提呈功能的影响受很多组织器官局部因素的影响^[20]。本实验中，接受大剂量细胞内辐射的树突状细胞对同种T细胞抗原提呈能力下降，可能与树突状细胞凋亡率升高有关，具体机制尚待明确。

在电离辐射对树突状细胞的迁移能力的在体研究中发现，γ射线能促进未成熟树突状细胞的迁移能力，而对成熟树突状细胞的迁移能力无明显影响^[21]。李晓等^[22]观察低剂量X射线对人树突状细胞体外迁移能力影响，分别用0，0.05，0.1，0.2，0.5 Gy剂量X射线照射体外分离培养诱导分化成熟的树突状细胞。结果显示，0.2 Gy照射后，CCR7蛋白表达量高于其他剂量, 树突状细胞迁移能力显著高于其他剂量；以抗CCR7单克隆抗体封闭CCR7蛋白活性,在接受同等剂量照射时, 树突状细胞迁移能力显著降低。提示受到0.2 Gy X射线照射的树突状细胞,体外迁移能力显著增强，其机制可能与受照后树突状细胞表达CCR7 mRNA及蛋白水平升高有关。

对间质树突状细胞和表皮LC的研究发现，电离辐射对MHCII+iDC和Langerin+LC的迁移的促进作用具有剂量和时间依赖性。在体外条件下的研究中，发现大剂量γ射线可以明显抑制骨髓来源树突状细胞的迁移能力，而且可以通过下调CCR7和诱导凋亡抑制树突状细胞的迁移，减少细胞因子的分泌，导致免疫抑制^[23-24]。

本实验中，接受大剂量细胞内辐射的树突状细胞诱导型趋化因子单核细胞趋化因子1的分泌明显下降，与既往研究基本相符。

实验结果提示，¹⁸F-FDG作用于体外培养的外周血单个核细胞来源树突状细胞，其电离辐射作用虽在较高浓度下会对树突状细胞的凋亡、抗原提呈、迁移能力产生影响，但在大多数较低浓度下对树突状细胞的凋亡、成熟、抗原提呈、迁移能力等影响较小，可以选择合适的药物浓度作为一种树突状细胞细胞的体外标记物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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