20 W微波照射骨骼肌卫星细胞的增殖与分化：兔骨折内固定模型研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
微波：是指频率为300 MHz-300 GHz的电磁波，是无线电波中一个有限频带的简称，即波长在1 mm-1 m之间的电磁波，是分米波、厘米波、毫米波的统称。微波频率比一般的无线电波频率高，通常也称为“超高频电磁波”。微波作为一种电磁波也具有波粒二象性。微波的基本性质通常呈现为穿透、反射、吸收3个特性。对于玻璃、塑料和瓷器，微波几乎是穿越而不被吸收。对于水和食物等就会吸收微波而使自身发热。而对金属类东西，则会反射微波。
肌卫星细胞：骨骼肌中除骨骼肌纤维(肌细胞)外的一种扁平、有突起的细胞，附着于肌纤维(肌细胞)表面；当肌纤维(肌细胞)受损后，肌卫星细胞可增殖分化，参与肌纤维(肌细胞)的修复，因此具有干细胞性质。

摘要
背景：研究表明，控制微波照射在较低功率时，微波能够促进内固定骨折的愈合，但对骨折周围骨骼肌的作用机制尚不清楚。
目的：观察20 W功率微波对内固定骨折骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响。
方法：取雄性新西兰家兔40只建立骨折+钛合金内固定动物模型，随机分成自然恢复组(n=20)、微波治疗组(n=20)，微波治疗组于造模后第4天行20 W功率微波照射治疗，连续照射30 d，自然恢复组不照射。取家兔大腿肌通过分离纯化培养获得骨骼肌卫星细胞，应用免疫组织化学、苏木精-伊红染色法、qRT-PCR技术对骨骼肌卫星细胞的增殖分化能力进行检测。
结果与结论：①苏木精-伊红染染色光镜下观察显示微波治疗组和自然恢复组肌肉组织形态学无明显的差别；②微波治疗组体外培养的卫星细胞MyoG mRNA的表达水平高于自然恢复组(P < 0.05)；③a-sarcometric actin染色阳性细胞数多于自然恢复组(P < 0.05)，早期增殖能力受到抑制，后期不受影响；④结果说明，应用20 W微波能促进植入物周围骨骼肌卫星细胞的分化能力，对其增殖能力的抑制也是可逆的；进一步证实低剂量微波治疗内固定骨折的安全性和有效性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-1348-5313(邹玉珍)

关键词: 组织构建, 组织工程, 微波治疗, 骨折, 内固定, 卫星细胞, 增殖能力, 分化能力

Abstract:

BACKGROUND: Low power microwave irradiation has been shown to promote the healing of fractures with internal fixation; however, its action mechanisms on the skeletal muscle around the fracture site are unclear.
OBJECTIVE: To study the effects of low power microwave irradiation (20 W) on the proliferation ability of skeletal muscle satellite cells in a rabbit model of femoral fracture with internal fixation.
METHODS: Forty male New Zealand rabbits were used to establish femoral fracture followed by internal fixation models, and then were equally randomized into spontaneous recovery and microwave treatment groups. Low power microwave irradiation (20 W) was given for 30 consecutive days in the microwave treatment group on day 4 after modeling, while no microwave irradiation was given in the spontaneous recovery group. Rabbit thigh muscles adjacent to the implant were obtained to isolate skeletal muscle satellite cells. Immunohistochemical staining, hematoxylin-eosin staining and quantitative RT-PCR were used to evaluate the ability of the proliferation and differentiation of skeletal muscle satellite cells.
RESULTS AND CONCLUSON: Hematoxylin-eosin staining showed that there was no significant difference in the morphology and histology of skeletal muscle tissues between the spontaneous recovery and microwave treatment groups. However, the relative mRNA expression of MyoG in the cultured skeletal muscle satellite cells in vitro and the number of α-sarcometric actin-postive cells in the microwave treatment group were significantly increased compared with the spontaneous recovery group (P < 0.05). The proliferative ability of skeletal muscle satellite cells was inhibited at the early stage, but not at the later stage. Our results suggest that low power microwave irradiation (20 W) can promote the proliferation and differentiation of skeletal muscle satellite cells around the implant in a rabbit model of femoral fracture with internal fixation, and thereby confirm the efficacy and safety of low power microwave irradiation for the internal fixation of fractures.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Microwaves, Fractures, Bone, Internal Fixators, Satellite Cells, Skeletal Muscle

中图分类号:

R318

邹玉珍，王刚，徐义明，白跃宏. 20 W微波照射骨骼肌卫星细胞的增殖与分化：兔骨折内固定模型研究[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4355-4361.

Zou Yu-zhen, Wang Gang, Xu Yi-ming, Bai Yue-hong. Effects of low power microwave irradiation (20 W) on the proliferation and differentiation of skeletal muscle satellite cells in a rabbit model of femoral fracture with internal fixation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4355-4361.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析新西兰大白兔40只，分为2组，均完成相关实验和检测，中途未发生创口感染、动物意外死亡等事件导致脱失，全部进入结果分析。

2.2 肌肉组织苏木精-伊红染色结果自然恢复组家兔骨骼肌肌纤维呈鲜红色长带状，肌节形态完好、肌膜结构完整，肌丝束排列规则整齐，肌细胞正常(图2A)。微波治疗组家兔未见肌纤维的断裂和坏死，与自然恢复组肌肉组织相比，肌细胞大小和形态较为一致，肌节结构稍显紊乱，偶见肿胀的肌细胞，但肌组织排列更加紧凑(图2B)。总体来看，光镜下微波治疗组和自然恢复组肌肉组织形态学无明显的差别。

2.3 兔骨骼肌卫星细胞分离培养及形态学观察自然恢复组的组织块在贴壁24 h后，周围就开始有激活的卫星细胞潜出，而微波治疗组在贴壁2 d后有细胞潜出。培养至第3天时，肌卫星细胞生长速度均较快，微波治疗组细胞较小，呈圆球性，单个散在分布，细胞数目略少于自然恢复组；自然恢复组有些细胞开始伸展成短梭形或纺锤形，细胞折光性较好，偶见少量圆形的混杂细胞(图3A，B)。之后细胞开始出现方向性，呈现有规律地沿长轴平行排列。培养7 d时，两组细胞数量较之前均明显增多，两

组细胞形态较为规则一致，但生长速度减慢，随着细胞密度的增大，细胞间隙变小，卫星细胞变细变长呈长梭形，此时，微波治疗组已出现相距较近的卫星细胞相互融合现象，显微镜下可见伸出小突起(图3C，D)。

当细胞汇合至80%以上或转移接种至分化培养基时，相邻细胞可彼此发生融合，形成大量类似肌管的粗大结构，其中央可见多个细胞核，并可见肌管特征性节律性收缩跳动的现象。到第9天时两组细胞都可进行传代，传代细胞生长迅速，增殖旺盛，细胞形态与原代细胞一致，但传代后的细胞体积变大。但传至第7代后，细胞开始出现老化迹象，折光性变弱，形态呈现多样性，表现为细胞收缩扁平，突起增多不规则，胞体立体感减弱，胞浆内出现空泡、颗粒等改变。因此后续实验选取4-6代的细胞无论从数量还是质量上都更满足要求。

2.4 兔骨骼肌卫星细胞免疫组织化学染色结果经a-sarcometric actin抗体免疫细胞化学染色检测结果显示，两组分离纯化出的细胞中约95%的细胞胞浆呈现阳性反应，表现为胞质染成棕黄色，胞核呈紫色，而用PBS作阴性对照的细胞胞浆不着色(图4)，这从蛋白质水平上表明实验培养的细胞为骨骼肌卫星细胞，且纯度较高。相比于自然恢复组，微波治疗组阳性细胞绝对数目更高，两组差异有显著性意义35.466 7±3.044 1，62.333 3± 4.864 8，P < 0.05)。

2.5 qRT-PCR检测兔肌卫星细胞MyoG mRNA相对丰度微波治疗组和自然恢复组分离培养的肌卫星细胞中MyoG mRNA的相对表达量分别为1.777 9 ±0.061 9、1.042 7±0.005 2。说明微波治疗组肌卫星细胞中MyoG mRNA的整体转录水平明显高于自然恢复组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

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引言

骨折愈合是涉及多种修复细胞和细胞因子的复杂再生过程，诸多因素可影响骨折愈合。据Einhorn^[1]调查报道，骨折患者中5%-10%会发生骨折的延迟愈合或不愈合，这是临床骨科康复治疗难题之一，随着医学技术的不断发展仍不能完全避免。因此如何早期促进骨折愈合，缩短骨折愈合的时间，成为近年来国内外学者研究的热点问题。

微波在临床改善局部血液循环、减轻水肿、减轻疼痛、促进炎症消退等方面有着很强的治疗作用^[2-5]，是目前应用最广的物理疗法之一。微波的频率高(300 MHz- 300 GHz)，微波电场作用于机体主要产生热效应和非热效应，许多实验和临床研究均证实，微波有刺激成骨的作用，在治疗骨折、骨不连方面有很好的疗效^[6-8]。

但通常认为，对于骨折实行内固定后，因体内有金属植入物，物理治疗尤其是微波是禁止使用的^[9-10]。由于在体内有金属植入物存在的情况下，应用微波会使能量在金属物旁汇聚而对其周围组织，特别是在高水分的组织中(如肌肉组织)，产生热损伤^[11]。然而叶冬梅等^[12-13]早期通过动物实验发现：连续低剂量的微波照射不会引起内固定植入物周围组织明显的升温(< 41 ℃)，并且能够加速骨折的愈合。近来也有不少实验研究表明，只要控制微波照射在一较低功率，微波能够促进内固定骨折的愈合，但对骨折周围骨骼肌的作用机制尚不清楚^[14-17]。

不同频率、剂量的微波照射的作用特点和引起的生物学效应会有所不同。作者此次实验在前人实验的基础上，采用的微波频率为2 450 Hz，剂量为20 W，照射时间为10 min。实验旨在通过进一步研究低剂量(20 W)微波对植入物周围肌肉卫星细胞增殖分化能力的影响，了解植入物周围骨骼肌的再生或损伤情况，以验证低剂量微波治疗内固定骨折的安全性，为临床上应用低剂量微波治疗内固定骨折提供科学的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点所有动物饲养和取材过程均于2015年6至9月在上海交通大学附属第六人民医院动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康雄性新西兰家兔40只，4月龄左右，体质量为2.0-3.0 kg(平均2.6 kg)，喂养在室温25 ℃左右，湿度适宜，通风，安静的环境中。单笼常规饲养，自由饮水和进食，饲喂中全部使用的全价颗粒饲料。实验动物由上海市松江区松联实验动物场提供，动物生产许可证：SCXK(沪)2012-0011，实验动物设施许可证：SYXK(沪)2011-0128。所有涉及动物的实验过程均严格遵循实验动物操作规程。

试剂与仪器：DMEM培养液(Hyclone)；胎牛血清 (Gibco)；100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、RNase A、山羊血清(sigma)；RNAiso Reagent、SYBR PrimeScript^TM RT-PCR Kit (TaKaRa公司)；0.25%胰酶溶液、0.25%胰酶、DAB显色试剂盒(索来宝)；小鼠a-Sarcomeric Actin抗体、SABC试剂盒(武汉博士德)；DEPC(Amresco公司)；微波治疗仪PM-800(ITO Company，日本)；钛合金内固定钢板及其配套(LCP System)(Synthes company，美国)；光学显微镜BM-8CA(上海团结仪器制造有限公司)；细胞培养箱HERA cell CO₂、酶标仪Multiskan Spectrum(Thermo Scientific)；实时PCR仪IQ5(BIO-RAD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制作所有新西兰家兔经适应性饲养1周后，称量记录体质量，使用30 g/L戊巴比妥钠以1.0-1.5 mL/kg经耳缘静脉注射麻醉，术中根据兔子反应适当追加0.2-0.3 mL/kg的剂量。兔子仰卧位固定于动物手术台上，备皮，常规消毒铺巾，无菌条件下于右股骨中段处做一3.5-4.5 cm股外侧切口，依次切开皮肤及皮下组织，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露股骨干，用线锯在股骨中段沿股骨垂直方向制作不完全横断性骨折模型，选用七孔钛合金钢板及配套钢钉行骨折内固定(图1)，彻底止血后，碘伏冲洗切口，逐层缝合。手术结束后伤口外围用纱布包裹，避免抓伤或撕咬伤口，转移到温暖的复苏室中观察1 h等待清醒。术后每天肌注80×10⁴ U青霉素预防感染，连续注射3 d。

1.4.2 动物分组及治疗方案家兔股骨中段内固定骨折模型建立完成后，将其随机分为2组(n=20)，自然恢复组、微波治疗组。其中自然恢复组兔子不给予任何治疗，令其自行恢复。自建模后第4天起，微波治疗组兔子每天固定时间接受10 min的25 W微波(2 450 Hz)治疗，微波发射器距离伤口10 cm左右，治疗周期为30 d。

1.4.3 样本的采集连续治疗30 d后，将新西兰家兔经耳缘静脉麻醉，右后肢浸泡于体积分数75%的乙醇中消毒5 min，用PBS冲洗干净，无菌纱布擦干。在无菌手术室下经原手术入口切开皮肤及皮下组织，小心分离骨骼和周围肌肉，迅速取家兔骨折断端旁股四头肌处肌肉组织，经预冷PBS冲洗，分为2部分(锡纸包裹)，取约0.5 cm宽的肌腹段浸入新鲜配置的体积分数10%甲醛中固定标记以备苏木精-伊红染色。剩余部分肌肉用于骨骼肌细胞培养。

1.4.4 肌肉组织形态学将已固定的肌肉组织通过流水冲洗，依次用不同体积分数乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明，再让加热溶解的石蜡浸透组织块，然后将已浸蜡的组织块放入融蜡中包埋，迅速冷凝。将组织蜡块用切片机切成6 μm厚的切片，于温水中摊片用载玻片贴片。再进行脱蜡苏木精-伊红染色，经乙醇脱水后二甲苯透明，最后滴中性树胶加盖玻片封固，光学显微镜下观察肌肉组织形态学变化。

1.4.5 兔骨骼肌卫星细胞分离培养、纯化和传代培养根据Rando等方法采用组织块培养法^[18]，部分步骤有做调整和优化，具体操作如下所述。剪取2 cm³左右大小的肌肉块，用PBS将肌肉组织冲洗干净后，置于无菌平皿中，修剪掉肉眼可见的筋膜、血管、脂肪等结缔组织，用眼科剪反复剪碎至1 mm ×1 mm ×1 mm大小的肌糜，用PBS洗3次，去掉漂浮的组织。用眼科镊把肌糜呈点状均匀放置于培养瓶，为使组织块更好的贴壁静置 30 min，再将含体积分数10%胎牛血清(FBS)+DMEM+ 100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素的生长培养液加入培养瓶中，注意避免组织块漂浮，在37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养。

细胞密度达80%左右时进行传代，弃去培养液，PBS洗涤一两次后加入适量0.25%胰酶消化液消化，显微镜下观察到绝大部分细胞变圆脱落时，弃胰酶，立即加入含体积分数20%胎牛血清培养液终止消化，用枪头反复吹吸细胞悬液，转移至离心管中以1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用2 mL含体积分数20%胎牛血清培养液重悬细胞，按1∶2的比例重新接种于新培养瓶内，每三四天换液1次并传代，每次传代均差速贴壁30 min进行纯化^[19-20]，以去除夹杂的成纤维细胞，将未贴壁细胞转入新的培养瓶中培养。

待纯化后的第3代的细胞分裂增殖至80%汇合后，将生长培养基更换为分化培养基(含体积分数2%胎牛血清的DMEM培养基)继续培养，诱导兔骨骼肌卫星细胞分化形成肌管。

1.4.6 免疫组织化学鉴定取胰酶消化后的第4代细胞以1×10⁵/孔接种于放有盖玻片(0.1% L-多聚赖氨酸包被)的6孔培养板中进行细胞爬片，继续加入生长培养基进行培养，待细胞铺满80%时进行免疫组织化学鉴定。取出盖玻片，PBS冲洗3次后将盖玻片浸入40 g/L多聚甲醛固定15 min；PBS冲洗3次后浸入体积分数3%H₂O₂溶液避光处理15 min以灭活内源性过氧化物酶；蒸馏水洗涤3次后滴加封闭用山羊血清，室温下孵育30 min；滴加小鼠a-Sarcomeric Actin单克隆抗体(1∶200稀释)或PBS(阴性对照)4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次去除未结合的一抗，滴加试剂SABC，室温孵育30 min；PBS洗3次后用DAB显色液室温显色。

2名病理科医师根据免疫染色结果采用双盲法评估计数。每例镜下随机选取5个高倍视野(×200)，以阳性细胞绝对数进行分析，其中细胞胞质被染为淡黄色至棕黄色者为阳性细胞的标志。计数染色阳性细胞，并计算其平均数。

1.4.7 qRT-PCR定量检测MyoG表达第5代的兔骨骼肌卫星细胞达70%汇合时弃培养液，用预冷的PBS冲洗两三次后收集细胞样本。按照RNAiso Reagent试剂盒使用说明书提取细胞总RNA，加入500 μL RNAiso Reagent，用枪头反复吹打，加入0.1 mL氯仿后剧烈震荡以乳化充分。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，小心将上层水相吸取转移至经0.1% DEPC水预处理的新EP管中。4 ℃12 000 r/min离心10 min，可见有RNA沉淀于管底和管壁，弃上清，加1 mL体积分数75%乙醇洗涤沉淀。4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，室温干燥RNA沉淀，溶解于100 μL无RNA的0.1% DEPC处理水，-80 ℃保存备用。测定A₂₆₀/A₂₈₀比值，评定RNA纯度。

由GenBank检索得到家兔MyoG、GAPDH的mRNA序列，设计家兔骨骼肌卫星细胞相关基因的上、下游引物(表1)，BLAST检索验证了引物的特异性。引物序列委托上海秉新生物科技公司合成。严格按照PrimeScript^TM Rt-PCR kit试剂盒说明书配制反转录反应体系20 μL，进行反转录反应，合成cDNA。获得的cDNA稀释10倍后用作反应模板进行实时定量PCR扩增(反应条件见表2)，共进行43个循环。PCR反应结束后，对溶解曲线进行分析。采用Ct法，以GAPDH作为内部参照基因，根据公式2^-?Ct(?Ct=Ct_目的基因-Ct_GAPDH)对样本MyoG基因的表达量进行相对定量。

1.5 主要观察指标 ①取样前每天观察兔子进食、活动及创口愈合情况；②组织切片苏木精-伊红染色观察肌肉组织中是否出现肌纤维断裂、坏死，有无炎性细胞浸润等改变；③肌卫星细胞培养时每天观察细胞的形态和生长情况；④免疫组织化学鉴定肌卫星细胞和半定量分析染色结果；⑤qRT-PCR检测骨骼肌卫星细胞关键转录基因MyoG的mRNA表达水平。

表1 MyoG和GAPDH 基因引物序列

Table 1 Primers for MyoG and GAPDH by quantitative real-time PCR

基因	引物序列(5’−3’)	片段长度(bp)
MyoG	F: TCT ACG ACG GGG AGA ACT ACC T	186
FJ605115.1	R: CTG ACT TCC TCT TAC ACA CCT TGC
GAPDH	F: AGA GCA CCA GAG GAG GAC G	105
NM_001082253.1	R:TGG GAT GGA AAC TGT GAA GAG

表2 PCR反应条件

Table 2 PCR amplification conditions

基因	变性	退火	延伸
MyoG	95 ℃，15 s	60 ℃，20 s	72 ℃，15 s
GAPDH	95 ℃，15 s	59 ℃，20 s	72 ℃，15 s

1.6 统计学分析采用SAS9.1软件包进行统计学分析，结果表示为x(_)±s，使用独立样本t 检验分析两组差异显著性，以P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

大量实验和临床研究均证实，微波具有促进成骨细胞的增殖与成骨分化的作用，在促进骨折延迟愈合、骨折不愈合的康复有很好的疗效。传统观点认为，由于金属植入物对微波的反射和激发的涡流电流，会使金属植入物周围的肌肉组织迅速升温造成骨骼肌的不可逆损伤^[21-22]。成熟的骨骼肌细胞的再生能力极弱，一旦受到强烈不可逆的损害，就会永久性丧失分裂和增殖能力，代之以纤维化的瘢痕组织修复，造成组织和功能的永久性缺失。正因为骨骼肌发生不可逆损伤后产生的后果极难修复，使得临床医师不敢贸然对体内含内固定金属植入物的骨折患者应用微波照射进行治疗。作者团队早期通过一系列动物实验发现，连续低剂量的微波照射不会引起内固定植入物周围组织明显的升温(< 41 ℃)，并且能够加速骨折的愈合，但其对植入物周围骨骼肌的产生的影响和具体效应尚不清楚。从植入物周围的骨骼肌组织的苏木精-伊红染色光镜结果来看，治疗组在微波照射30 d后(累计热损伤最重的阶段)，与自然恢复组相比，肌节结构稍显紊乱，偶见肿胀的肌细胞，但肌组织排列更加紧凑。未见肌纤维变性、坏死，肌膜破坏，纤维结缔组织增生等骨骼肌不可逆损伤后的病理改变。这表明低剂量的微波治疗并不会造成植入物周围骨骼肌的不可逆的病理损害。

骨骼肌卫星细胞是一群位于肌纤维的肌膜与基底膜之间的具有增殖和自我更新能力的肌组织前体细胞^[23]。骨骼肌卫星细胞平时处于未激活的休眠状态，在外界因素刺激下可被激活，进入细胞有丝分裂的周期。在对两组骨骼肌卫星细胞进行分离培养时发现，与微波治疗组相比，自然恢复组骨骼肌卫星细胞的激活时间更早，更易从组织块潜出。结果说明在细胞培养的早期自然恢复组骨骼肌卫星细胞即呈现出旺盛的增殖再生能力，早期即表现出强增殖活性。提示微波抑制骨骼肌卫星细胞早期的增殖能力和活性，这可能是由于微波照射引起骨骼肌产生热应激造成的，可能是通过抑制卫星细胞早期细胞周期调节蛋白而发挥的作用，其具体抑制机制有待进一步研究。当培养到第7天时，两组细胞的数量和形态已无明显差异，提示低剂量微波抑制卫星细胞的增殖只是暂时性的，是可逆的。

a横纹肌肌动蛋白(a-sarcomeric actin，a-SCA)是只存在成熟骨骼肌细胞中的参与肌肉收缩活动的结构和功能蛋白。a-sarcomeric actin作为骨骼肌细胞特有的蛋白，是目前公认的用于鉴定骨骼肌卫星细胞的特异性标记蛋白^[24-25]。采用a-Sarcomeric Actin做为标志性蛋白可将骨骼肌细胞与成肌细胞、平滑肌来源的肌细胞等区别开来。a-sarcomeric actin的表达在卫星细胞分化形成肌管后增多，其量的多少与卫星细胞的分化状态密切相关。故可通过a-sarcomeric actin的表达来研究肌卫星细胞的分化活性。实验结果发现，95%的细胞胞浆呈现阳性反应，证实所培养的细胞就是卫星细胞，剩余少量染色阴性的细胞可能为残留的成纤维细胞。研究中利用了成纤维细胞比骨骼肌卫星细胞更易贴壁生长的特点，通过差速贴壁法对卫星细胞进行纯化，使得所得的骨骼肌卫星细胞纯度能满足后续实验的要求。微波治疗组阳性细胞绝对数目是自然恢复组的1.76倍，在数量上显著高于自然恢复组(P < 0.05)。说明微波治疗组骨骼肌卫星细胞的分化活力更强。上述结果表明低剂量微波能有效促进肌卫星细胞向肌管的分化。

Myogenin(MyoG)基因参与骨骼肌细胞生长及分化的调控，其蛋白在所有骨骼肌细胞系中均可表达，但主要在处于分化时和分化后期的细胞中表达^[26]。MyoG蛋白具有高度保守的结构，在体内、外都能够与肌肉特异基因eg：横纹肌肌动蛋白(a-Sarcomeric Actinin)基因上游的调控序列E-box 结合发挥转录因子的作用^[27]，从而激活肌管特异基因的表达。骨骼肌卫星细胞中MyoG基因表达量的上升，标志着卫星细胞退出细胞增殖周期，进入到分化融合成肌管的阶段^[28]。由于MyoG与卫星细胞的分化有着直接的联系，因此myoG成为卫星细胞分化的重要标记基因。为进一步研究20W微波对兔骨骼肌卫星细胞分化能力的影响，通过qRT-PCR对成肌关键因子MyoG mRNA的表达量进行检测，同自然恢复组相比，微波治疗组的肌卫星细胞MyoG mRNA的表达量更高(P < 0.05)。提示低剂量微波治疗能显著地提高骨骼肌卫星细胞MyoG mRNA的表达，增强了卫星细胞分化为肌管的能力。作者认为这可能与微波照射引起卫星细胞Myogenin基因表达的上调有关。

综合上述结果，研究表明20W微波能促进植入物周围骨骼肌卫星细胞的分化能力，对其增殖能力的抑制也是可逆的。提示低剂量的微波并不会引起植入物周围骨骼肌不可逆的损害，其应用是安全可行的。本实验为微波在内固定骨折康复的临床应用提供了一定的理论依据，具有十分积极的意义。在未来的研究中，作者将围绕低剂量的微波对植入物周围神经、血管的影响展开研究，进一步完善低剂量微波应用于内固定骨折康复安全性的证据链，可望为临床上内固定骨折患者的康复提供一种新的思路和手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程