椎间盘退变患者血清及髓核组织中基质金属蛋白酶1及抑制剂1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
基质金属蛋白酶：基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成：①疏水信号肽序列；②前肽区，主要作用是保持酶原的稳定，当该区域被外源性酶切断后，基质金属蛋白酶酶原被激活；③催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；④富含脯氨酸的铰链区；⑤羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。基质金属蛋白酶成员上述结构的基础上各有特点，各种基质金属蛋白酶间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种基质金属蛋白酶可降解多种细胞外基质成分，而某一种细胞外基质成分又可被多种基质金属蛋白酶降解，但不同酶的降解效率可不同。
腰椎退变：其实质是关节软骨发生退变，继发以关节边缘和软骨下骨质以增殖性新形成的一种关节病变。腰椎开始退变后，首先出现椎间盘的变性，使椎间盘容易被压缩而丧失其正常的高度，椎体间距离缩短、脊椎骨前后的韧带因此而变得松弛，造成椎体之间的不稳定，相互之间活动过度。椎体间活动度增大后，在椎体边缘易于出现微小的、反复的、积累性损伤，可以导致微小的局部出血及渗出。经过一段时间以后，出血及渗出被吸收纤维化，以后可逐步形成钙化。

摘要
背景：基质金属蛋白酶现被公认为能降解所有的细胞外基质，基质金属蛋白酶分泌过多或金属蛋白酶抑制剂的分泌减少能破坏细胞外基质的动态平衡。
目的：试图阐明基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1在椎间盘退变的发病机制。
方法：选择60例椎间盘退变患者，根据磁共振(MRI)检查结果分为椎间盘有轻度的退变信号、椎间盘中度抑制信号及椎间盘严重的退变信号3个亚组；对照组20例椎体骨折(颈椎为主)但椎间盘正常的患者。在术前收集静脉血液样品，随后收集病变的椎间盘组织。
结果与结论：①椎间盘退变组患者血清和组织中的基质金属蛋白酶1水平显著高于对照组(P < 0.05)；②在所有亚组之间的进一步比较发现，重度椎间盘退变患者相比轻度或中度患者有较高的基质金属蛋白酶1表达水平(P < 0.05)；③然而金属蛋白酶抑制剂1的表达水平在椎间盘退变组和对照组之间的组织或者血清中没有显著差异(P > 0.05)。金属基质蛋白酶1的表达在椎间盘退变患者中得到增强，金属蛋白酶抑制剂1的表达与椎间盘退行性变无关。

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ORCID: 0000-0002-4454-0047(邓斌)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 椎间盘退变, 基质金属蛋白酶1, 金属蛋白酶抑制剂1

Abstract:

BACKGROUND: Matrix metalloproteinases are now generally considered to be able to degrade all extracellular matrices. Hypersecretion of matrix metalloproteinases or reduction in tissue inhibitors of matrix metalloproteinases leads to destruction of the dynamic balance of extracellular matrix.
OBJECTIVE: To elucidate the role of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in the pathogenesis and progression of intervertebral disc degeneration.
METHODS: A total of 60 patients with intervertebral disc degeneration were included. Mild, moderate, and severe degeneration signals appeared on MRI imaging of the patients. Meanwhile, 20 patients with vertebral fracture, mainly cervical spine fracture, were selected as the control group. Venous blood samples were collected before the surgery; the intervertebral disc specimens were sequentially collected.
RESULTS AND CONCLUSION: Serum and tissue levels of matrix metalloproteinase-1 in patients with intervertebral disc degeneration were significantly increased compared with the control group (P < 0.05), and furthermore those were significantly increased in patients with severe disc degeneration compared with patients with mild and moderate disc degeneration (P < 0.05). However, serum and tissue levels of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases did not differ significantly between the disc degeneration and control groups (P > 0.05). These results indicate that hypersecretion of matrix metalloproteinase-1 occurs in patients with intervertebral disc degeneration; however, the expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 is not correlated with intervertebral disc degeneration.

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Key words: Matrix Metalloproteinases, Spine, Intervertebral Disk, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

邓斌，王叶新，孟纯阳. 椎间盘退变患者血清及髓核组织中基质金属蛋白酶1及抑制剂1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4303-4310.

Deng Bin, Wang Ye-xin, Meng Chun-yang. Serum and tissue levels of matrix metalloproteinase-1 and its tissue inhibitor in patients with intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4303-4310.

图/表（结果） 2

2.1 参与者数量分析纳入患者80例，分为2组，80例患者全部进入了结果分析。
2.2 两组基线资料分析两组患者的性别、年龄等具有可比性，见表1。

2.3 基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1的血清水平使用ELISA来测定椎间盘退变组和对照组血清中基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1的水平。结果发现椎间盘退变患者组基质金属蛋白酶1的水平高于对照组(P < 0.05，图1A)。

进一步比较椎间盘退变的3个亚组，发现第3阶段(严重椎间盘退变)的患者血清金属基质蛋白酶1水平比那些在第1阶段(轻度)或第2阶段(中度)的患者显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05)。然而对血清金属蛋白酶抑制剂1的检测发现，3个等级的椎间盘退变组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05，图1B)。

2.4 基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1蛋白在组织中的表达进一步用IHC染色检查基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1蛋白在对照组和椎间盘退变组中表达的差异。

显微图像表明，对照组细胞形状不规则，含有蓝色圆形细胞核，粉红色的细胞质和均匀分布的细胞外基质。然而椎间盘退变组的组织中是圆形细胞核，细胞质中含有空泡，细胞外基质中纤维分散，细胞增殖显著升高(图2)。基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1都表达在细胞膜和细胞质中并显示为褐色和黄色的颗粒。

3个椎间盘退变组的金属基质蛋白酶1阳性率较对照组显著增高(表2，P < 0.05)；和第1阶段或第2阶段相比，椎间盘退变第3阶段患者具有最高(95%)的金属基质蛋白酶1阳性率(P < 0.05)。对照组和椎间盘退变组中的金属蛋白酶抑制剂1阳性率差异无显著性意义(P > 0.05)。

参考文献

[1] Baliga S,Treon K,Craig NJ.Low Back Pain: Current Surgical Approaches. Asian Spine J. 2015;9(4): 645-657.
[2] 黄庆华.椎间盘退变分子机制的研究进展[J].医学信息(中旬刊).2011,24(4)：1672-1674.
[3] Lotz JC,Colliou OK,Chin JR,et al. Compression- induced changes in intervertebral disc properties in a rat tail model.Spine.1999;24:996-1002.
[4] Rastogi A, Kim H, Twomey JD, et al.MMP-2 mediates local degradation and remodeling of collagen by annulus fibrosus cells of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther.2013;15(2):R57.
[5] Leung VY, Tam V, Chan D, et al.Tissue engineering for intervertebral disk degeneration. Orthop Clin North Am. 2011;42(4): 575-583.
[6] Hulboy DL,Rudolph LA,Mamsian LM. Metalloproteinase as mediators of reproductive functionI．Mol Hum Reprod.1997;3:27-45．
[7] Baillet A,Grange L,Trocmé C,et al.Differences in MMPs and TIMP-1 expression between intervertebral disc and disc herniation. Joint Bone Spine.2013;80(3): 341-342.
[8] Zou J,Huang GF,Zhang Q,et al.Effects of electroacupuncture stimulation of "Jiaji" (EX-B 2) on expression of matrix metalloproteinase-13 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in intervertebral disc tissue in rabbits with lumbar intervertebral disc degeneration. Zhen Ci Yan Jiu. 2014;39(3): 192-197.
[9] Gruber HE, Hoelscher GL,Ingram JA,et al.Matrix metalloproteinase-26, a novel MMP, is constitutively expressed in the human intervertebral disc in vivo and in vitro. Exp Mol Pathol.2012;92(1):59-63.
[10] 刘海心,王德春,胡有谷.椎间盘的营养与退变[J].中国矫形外科杂志,2006,14(1):863.
[11] 李小川,李雷.Fas/FasL基因在退变腰椎间盘组织中的表达及诱导凋亡作用[J].中华医学杂志,2005,25(24):1718.
[12] 王守丰,邱勇.生物力学因素对椎体生长板的影响和临床意义[J].中国脊柱脊髓杂志,2006,16(4):301.
[13] Hatano E, Fujita T, Ueda Y, et al. Expression of ADAMTS-4 (aggrecanase-1) and Possible Involvement in Regression of Lumbar Disc Herniation. Spine.2006;31(13):1426.
[14] 王湘达,陈伯华.Ⅳ型胶原在退变椎间盘中的表达及意义[J].青岛大学医学院学报,2003,39(3):318.
[15] Zetser A, Bashenko Y, Miao HQ,et al. Heparanase effects adhesive and tumorigenic potential of human glioma cells. Cancer Res. 2003;63(22):7733-7741.
[16] Wu WP,Jiang JM, Qu DB,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha and matrix metalloproteinase-2 in degenerative lumbar intervertebral disc. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2010;30(5):1152-1155.
[17] Mavrogonatou E, Angelopoulou MT, Kletsas D.The catabolic effect of TNFalpha on bovine nucleus pulposus intervertebral disc cells and the restraining role of glucosamine sulfate in the TNFalpha-mediated up-regulation of MMP-3. J Orthop Res.2014;32(12): 1701-1707.
[18] Yuan Y,Zhao J,Li YM, et al.Expression and significance of NF-κB, MMP-1/TIMP-1 in intervertebral disc degeneration. Shandong Med J. 2011;19: 004.
[19] Canbay S, Turhan N, Bozkurt M, et al.Correlation of matrix metalloproteinase-3 expression with patient age, magnetic resonance imaging and histopathological grade in lumbar disc degeneration. Turk Neurosurg. 2013; 23(4):427-233.
[20] Gomis-Rüth FX. Catalytic domain architecture of metzincin metalloproteases.J Biol Chem. 2009；284(23): 15353-15357.
[21] Zawilla NH, Darweesh H, Mansour N, et al.Matrix metalloproteinase-3, vitamin D receptor gene polymorphisms, and occupational risk factors in lumbar disc degeneration. J Occup Rehabil.2014;24(2): 370-381.
[22] Valdes AM, Hassett G, Hart DJ, et al.Radiographic Progression of Lumbar Spine Disc Degeneration Is Influenced by Variation at Inflammatory Genes: A Candidate SNP Association Study in the Chingford Cohort. Spine (Phila Pa 1976). 2005;30(21): 2445-2451.
[23] Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res.2003; 92(8): 827-839.
[24] Zcharia E, Zilka R, Yaar A, et al. Heparanase accelerates wound angiogenesis and wound healing in mouse and rat models. FASEB J.2005;19: 211-221.
[25] Wolf M, Lommes P, Sock E, Reiprich S,et al. Replacement of related POU transcription factors leads to severe defects in mouse forebrain development. Dev Biol.2009;332: 418-428.
[26] Takebayashi-Suzuki K, Arita N, Murasaki E,et al.The Xenopus POU class V transcription factor XOct-25 inhibits ectodermal competence to respond to bone morphogenetic protein-mediated embryonic induction. 2007;124: 840-855.
[27] Sotnikov I, Hershkoviz R, Grabovsky V,et al. Enzymatically quiescent heparanase augments T cell interactions with VCAM-1 and extracellular matrix components under versatile dynamic contexts. J Immunol 2004;172: 5185-5193.
[28] 魏见伟,王德春,胡有谷．基质金属蛋白酶及其抑制因子与腰椎间盘退变关系的研究进展[J].中国脊柱脊髓杂志, 2006,16(4):304.
[29] Bachmeier BE，Nerlich A，Mittennaler N，et al，Matrix metallopreteinase expression levels suggest distinct enzyme roles during 1umbar discherniation and degeneration.Eur Spine J.2009;18:1573-1586.
[30] Kanemoto M,Hukuda S,Komiya Y,et al. Innnunohistochemical study of matrix metalloproteinase-3 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in human intervertebral disc. Spine.1996;21:1-8．
[31] Kimura K, Cheng XW, Nakamura K,et al.Matrix metalloproteinase‐2 regulates the expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase‐2. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2010;37(11):1096-1101.
[32] Carvalho RV, Ogliari FA, de Souza AP,et al.2‐Hydroxyethyl methacrylate as an inhibitor of matrix metalloproteinase-2. Eur J Oral Sci. 2009;117(1): 64-67.
[33] Pockert AJ, Richardson SM, Le Maitre CL,et al. Modified expression of the ADAMTS enzymes and tissue inhibitor of metalloproteinases 3 during human intervertebral disc degeneration. Arthritis&Rheumatism. 2009;60(2): 482-491.
[34] Vo NV, Hartman RA, Yurube T, et al.Expression and regulation of metalloproteinases and their inhibitors in intervertebral disc aging and degeneration.Spine J. 2013;13(3): 331-341.
[35] Yurube T, Takada T, Suzuki T, et al.Rat tail static compression model mimics extracellular matrix metabolic imbalances of matrix metalloproteinases, aggrecanases, and tissue inhibitors of metalloproteinases in intervertebral disc degeneration. Arthritis Res Ther.2012;14(2):R51.
[36] Furtwängler T, Chan SC, Bahrenberg G, et al. Assessment of the matrix degenerative effects of MMP-3, ADAMTS-4, and HTRA1, injected into a bovine intervertebral disc organ culture model. Spine (Phila Pa 1976).2013;38(22): E1377-1387.

引言

根据美国骨伤病学会调查，1995年以来因椎间盘退变丧失生活自理能力而使用轮椅的人仅次于脑血管病，名列“致残率最高的头号疾病第二位”！^[1]。中国约有80%的成年人出现过腰腿疼。轻度椎间盘退变患者在出现酸胀、僵硬、腰腿疼痛、麻木、无力等症状后，由于治疗不及时，会相继出现痉挛性剧痛、行走困难、活动受限等中度症状；严重者会导致尿便失禁等^[2]。通过分析椎间盘的病变过程发现纤维环细胞基质的合成与降解的失衡，会引起非聚合性蛋白多糖向更高浓度聚集，进而减少与水分子的结合，出现失水、降低弹性；另外纤维化的胶原类型越来越多的代替正常的胶原，也使椎间盘的弹性逐渐丢失^[3]。

在分子代谢水平上研究引起椎间盘退变的原因已经成为国内外的热点，近年来发现基质金属蛋白酶是一组需要Zn²⁺、Ca²⁺等金属离子作为辅助因子的同工酶，其功能为参与细胞外基质的降解，具有减少细胞外和基膜组分的作用，能降解除多糖以外几乎所有细胞外基质成分，是降解细胞外基质的关键酶类。基质金属蛋白酶的上调可导致细胞外基质的降解升高，交替的胶原组分，纤维环的破损和椎间组织的损伤，最后导致髓核的变性，从而引起相应的椎间盘病变的症状^[4]。

金属蛋白酶抑制剂是基质金属蛋白酶的抑制剂，也参与椎间盘的退变^[5]。同基质金属蛋白酶家族类似，金属蛋白酶抑制剂也是一种多基因家族，至少包括4个成员。目前研究较多的是金属蛋白酶抑制剂1和金属蛋白酶抑制剂2，相对分子质量分别是21 000和29 500，二者具有相关的氨基酸序列，均能以非共价键形式与活性状态的基质金属蛋白酶相结合，并因此抑制其活性。

金属蛋白酶抑制剂1可与所有活化状态的基质金属蛋白酶相结合，但相比而言抑制基质金属蛋白酶1更为迅速有效，金属蛋白酶抑制剂2则在抑制明胶酶A方面较金属蛋白酶抑制剂1更有效。研究显示金属蛋白酶抑制剂的作用机制不但在于可直接与活化的基质金属蛋白酶相结合而抑制其活性，同时还可通过干扰后者的激活的过程而发挥有效的作用^[6]。

Baillet等^[7]研究发现，椎间盘的手术损伤可引起基质金属蛋白酶1的表达升高，这一结果提示了基质金属蛋白酶1参与细胞外基质的降解，并能够被金属蛋白酶抑制剂所抑制以减缓椎间盘退变的发生。基质金属蛋白酶分泌过多或者是金属蛋白酶抑制剂的分泌减少可破坏细胞外基质的动态平衡，导致椎间盘的退变。国内外学者通过一系列研究发现，损伤的椎间盘组织中有大量的基质金属蛋白酶，其表达水平与椎间盘损伤病情呈正相关的^[8-9]。

基质金属蛋白酶、金属蛋白酶抑制剂的研究已经在医学领域中显示出其广泛的应用前景，而且其致病机制及应用的研究成果还在不断突破中。两者在椎间盘退变患者中表达水平的测定，将为人们更加完整地提示椎间盘退变的规律和发生机制，为人类进行椎间盘退变的诊断防治和新药开发提供重要的理论基础。

现国内外很少有学者同时研究基质金属蛋白酶及金属蛋白酶抑制剂在椎间盘退变发生中的作用，因此在课题中大胆提出了二者在椎间盘退变中的联合效用，并对此做出了相应研究。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计病例-对照观察试验。

1.2 时间及地点病例来自于2013年3月至2014年9月邹城市人民医院骨外科。

1.3 对象

1.3.1 椎间盘退变组入选标准选择60例椎间盘退变患者，男性30例，女性30例，年龄在22-55岁之间，平均为(35.6±1.8)岁。

诊断标准：所有患者均经磁共振(MRI)检查，分为3个不同进展阶段：第1阶段，椎间盘有轻度的退变信号；第2阶段，椎间盘中度抑制信号；第3阶段，椎间盘严重的退变信号。

纳入标准：①单纯椎间盘退变的患者；②对试验方案知情同意，且得到医院伦理委员会批准者。

排除标准：患有类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的患者。

1.3.2 对照组入选标准选择了20例患者，年龄在21-56岁，平均为(34.7±2.2)岁。

诊断标准：外伤导致椎体骨折，经X射线、CT或MRI检查确诊。

纳入标准：①单纯椎体(颈椎为主)骨折的患者。②对试验方案知情同意，且得到医院伦理委员会批准者。

排除标准：外伤导致椎间盘损伤的患者。

1.4 方法

1.4.1 血清蛋白水平测定抽取患者的静脉血，离心，分离取得上层血清，冷冻以供进一步使用。在酶联免疫吸附试验(ELISA)之前，所有试剂均在室温下预温。用于基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1的ELISA试剂(Roche公司，瑞士)按照描述的手工方法使用。

操作步骤：①标准品的稀释：试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照图表在小试管中进行稀释；②加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 µL，待测样品孔中先加样品稀释液 40 µL，然后再加待测样品10 µL(样品最终稀释度为 5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；③温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 min；④配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干；⑥加酶：每孔加入酶标试剂50 µL，空白孔除外；⑦温育：操作同③；⑧洗涤：操作同⑤；⑨显色：每孔先加入显色剂A50 µL，再加入显色剂B 50 µL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min；⑩终止：每孔加终止液50 µL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；?测定：以空白孔调零，用紫外分光光度计在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A值)。测定应在加终止液后15 min以内进行。每个浓度下制作5个重复样本，然后洗涤，反应和终止。参照使用标准样品绘制的基准曲线，确定靶蛋白的浓度。

1.4.2 免疫组织化学(IHC) 收集椎间盘退变患者及对照组的髓核组织样本，并切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块。在体积分数4%甲醛溶液中固定，然后经过脱水、石蜡包埋、脱蜡和复水后，用枸橼酸缓冲液进行抗原修复。然后通过体积分数3%过氧化氢酶处理切片，以灭活内源性过氧化物酶。通过山羊抗血清封闭非特异性结合位点，孵育1 h加入一抗，随后孵育10 min加入辣根过氧化物酶标记的二抗。切片脱水并盖盖玻片。图像都由倒置光学显微镜(奥林巴斯，日本)获取。

图像分析：平行的阴性对照组中用PBS代替一抗。获取图像后，一张玻片随机选取5个视野。在细胞质或细胞膜中，基质金属蛋白酶1或金属蛋白酶抑制剂1阳性信号表现为深棕/黄棕色颜色，在细胞核中不出现。计算一个视野中的阳性细胞百分率，并获得5个视野阳性百分率的平均值。

染色被定义为4个等级：①阴性(-)：<10%的阳性细胞；②弱阳性(+)：11%-25%的阳性细胞；③阳性(++)：26%-50%的阳性细胞；④强阳性(+++)：超过50%的阳性细胞。全部阳性率被定义为：每组中②、③、④级样本数之和/总样本数。

1.5 主要观察指标血清及组织中基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1的表达。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0软件处理所有收集到的数据，其中运用卡方检验分析计数资料，运用方差分析(ANOVA)分析计量资料。组间对比运用LSD检验。所有测量数据均表示为x(_)±s。当P < 0.05时差异有显著性意义。

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讨论

椎间盘退变是退行性椎间盘突出的前提条件，椎间盘退变的主要表现为蛋白多糖的降解和合成的减少、髓核含水量的逐渐减少，进而造成椎间盘的弹性和抗负荷能力减退^[10-11]。由于椎间盘突出症的显著病理改变，临床上表现的症状包括颈部、腰腿部疼痛和疲劳。通过体格检查，则会发现神经支配区域的感觉麻痹、丧失，偶可见感觉异常、感觉过敏、肌肉萎缩、尿便功能异常、神经牵拉疼痛。脊髓型脊椎病还会出现下肢肌张力升高、共济失调。

由椎间盘的解剖和组织学知识可知：腰椎间盘的位置位于两个椎体之间，是一个具有流体力学特性的结。椎间盘由髓核、纤维环和软骨板3部分构成，其中中央部分为髓核，纤维环为周围部分，包绕髓核，软骨板为上、下部分，直接与椎体骨组织相连，整个腰椎间盘的厚度为8-10 mm。椎间盘的退变，继而出现了纤维环的断裂和髓核的突出，通过力学或化学的因素刺激神经根引起上述症状及体征^[12]。以往认为椎间盘退变是一种单纯的生物力学现象，但现在的研究结论认为生物力学的作用是次要的，更强调生物化学机制，也就是炎症因子导致的无菌性炎症发挥着至关重要的作用^[13-15]。

髓核组织由髓核细胞和细胞外基质组成，髓核细胞主要是软骨细胞，数量非常少。而细胞外基质在椎间盘中占绝大部分，约占99%，椎间盘外基质的正常结构取决于组成物质合成、更新及修复的能力，椎间盘细胞合成蛋白多糖、胶原纤维及其他成分明显减少，或者修复破坏的椎间盘物质能力降低，使基质发生改变而出现椎间盘的退变^[16]。

椎间盘细胞外基质主要成分是蛋白多糖，它可以与胶原相互作用以形成稳定的外基质，具有润滑并具有减少椎间隙压力的作用^[17-18]。椎间盘中不同部位的胶原含量不同，主要类型是Ⅰ型和Ⅱ型，约占80%。在纤维环中，胶原纤维主要由Ⅰ型胶原(80%)和Ⅱ型胶原构成，Ⅲ型次之，并含有少量Ⅴ，Ⅵ和Ⅸ型胶原。而髓核中的细胞如透明状的软骨细胞主要合成Ⅱ型胶原，约占80%，而没有Ⅰ型胶原，但是也包含Ⅵ型胶原(占15%-20%)，Ⅸ型胶原(占1%-2%)及Ⅺ型胶原(约3%)^[19-20]。Ⅰ和Ⅴ型胶原是由类成纤维细胞合成，而Ⅱ型胶原是由软骨细胞合成，因此，Ⅰ型胶原主要见于外成纤维环，过渡区则包括了所有的Ⅱ型胶原。椎间盘中的蛋白多糖与关节软骨中的多聚糖相似，含有硫酸软骨素和硫酸角质素富含区及N-端球形核心蛋白区，以便使其通过连接蛋白和透明质酸结合成聚合体。胶原网和蛋白多糖共同维持髓核的黏胶状态。蛋白多糖及核心蛋白的表达在髓核最高，由内向外逐渐减弱，且随着年龄的增长其表达出现降低趋势，蛋白多糖逐渐被富含胶原的纤维组织所替代，最后导致髓桉纤维化，水分随之丧失。变性的髓核组织弹性消失，硬度增加，失去均匀传递压力的作用，髓核易于纤维环薄弱处突出。

最近的研究表明细胞因子和炎症因子在椎间盘退变的发病机制中发挥重要作用^[21]。现已知基质金属蛋白酶对腰椎间盘组织中细胞外基质的合成和降解进行调节，而且与椎间盘退变形成密切相关^[4^，^22]。作为存在于细胞之间的动态网状结构，细胞外基质由胶原、蛋白聚糖及糖蛋白等大分子物质组成。这些大分子物质可与细胞表面上的特异性受体结合，通过受体与细胞骨架结构直接发生联系或触发细胞内的一系列信号传导而引起不同的基因表达^[23-24]，从而导致细胞的生长和分化。作为降解细胞外基质成分最重要的酶-基质金属蛋白酶及其组织抑制因子在这一过程中起着非常重要的作用。

基质金属蛋白酶是一类依赖金属离子锌并以细胞外基质成分为水解底物的蛋白水解酶^[25-26]，其在转录水平的表达受到生长因子、细胞因子及激素等因素的严格调控，在蛋白质水平其活性也受到其激活剂和抑制剂的调节。基质金属蛋白酶通过对细胞外基质成分的水解来影响其降解与重组的动态平衡而参与多种细胞的生理和病理过程^[27]。基质金属蛋白酶的上调可能导致细胞外基质的降解升高，交替的胶原组分，纤维环的破损和椎间组织的损伤，最后导致髓核的变性^[28]。

Bachmeier等^[29]研究表明，在椎间盘退变的过程中，基质金属蛋白酶1的信使RNA表达都有增加，认为可以作为基质金属蛋白酶的代表，是生理和病理状态下细胞外基质代谢的关键酶。Kanemoto等^[30]用免疫组织化学的方法表明，突出椎间盘中的基质金属蛋白酶3比非突出的多，而脱出和游离性的更多，有显著性差异，非突出椎间盘和突出型的椎间盘中的金属蛋白酶抑制剂1为阴性，反而脱出型和游离型中为阳性，但差异无显著性，也提示基质金属蛋白酶3和金属蛋白酶抑制剂1的不平衡表达，也许是椎间盘退变的因素。

基质金属蛋白酶在椎间盘退变的调节是多因素、多水平的调节，包括激活/抑制因子、细胞因子和生长因子及椎间盘细胞的调节，并依赖于其特异性抑制因子在组织里的含量。此外，细胞外基质被基质金属蛋白酶降解的同时，伴有新基质的合成，导致细胞与细胞外基质的相互作用不断的改变，因此反馈调节基质金属蛋白酶的合成与激活状态。

以往的文章认为椎间盘损伤主要原因是由于基质金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂之间的不平衡所导致椎间盘基质的过度降解^[31-32]。金属蛋白酶抑制剂是基质金属蛋白酶的抑制剂，可以通过一对一复合体的形成抑制基质金属蛋白酶的活性^[33]。

在这项研究中，作者把所有的椎间盘退变患者根据MRI信号强度的不同分成3个阶段(轻度，中度和重度)。收集所有参与者术前静脉血样本，并测定基质金属蛋白酶1和金属蛋白酶抑制剂1水平。结果表明，椎间盘退变患者血清中的基质金属蛋白酶1的水平相对于对照组显著增高。同时在进一步的组内比对表明，严重的椎间盘退变患者的表达水平相对轻度或中度的患者有明显升高。但是金属基质蛋白酶的水平在椎间盘退变组和对照组个体之间没有显著差异。免疫组织化学得到类似的结果：①严重椎间盘退变患者比那些中度或轻度患者有显著增高的基质金属蛋白酶1阳性率；②所有患者基质金属蛋白酶1阳性细胞数较对照组明显增高；③金属蛋白酶抑制剂在所有的组中具有相似的水平。所有这些结果表明，椎间盘退变患者的属基质蛋白酶1表达升高明显，特别是在相对严重的个体，而金属蛋白酶抑制剂的表达则基本相同。其他研究也为作者的结果提供了支持，表明损伤的椎间盘组织中有大量的基质金属蛋白酶，其表达水平与椎间盘损伤病情呈正相关的。

Baillet等^[7]研究发现，椎间盘的手术损伤可导致金属基质蛋白酶1的表达升高^[7^，^34]，提示后者参与细胞外基质的降解，并能够被金属蛋白酶抑制剂抑制以减缓椎间盘退变的发生。一些研究将椎间盘退变产生归因于细胞因子和炎性因子的释放，这两者都可导致基质金属蛋白酶1的升高和金属蛋白酶抑制剂1的降低^[35]。

虽然上述两者在退行性和正常椎间盘组织都表达，但是显然在退化性椎间盘组织中基质金属蛋白酶1显著升高，金属蛋白酶抑制剂1降低引起了细胞外基质降解的不平衡。当细胞外基质降低的金属蛋白酶抑制剂水平无法抑制金属基质蛋白酶的时候，导致了椎间盘弹性降低和椎间盘突出^[36]。所有这些结果与作者的研究是一致的。此次研究病例数较少，且来源于同一地区同一家医院就诊患者，试验时间跨度较短，可能存在选择偏倚，影响试验结果的准确性。

综上所述，基质金属蛋白酶1在椎间盘病变的进展中表达较高，和椎间盘病变的严重程度成正相关。然而，金属蛋白酶抑制剂1在正常和退行性椎间盘组织中均表达。基质金属蛋白酶1/金属蛋白酶抑制剂1表达失平衡及髓核外基质中胶原的降解是导致椎间盘退变发病的一个重要原因，能加速椎间盘的退变过程，最终表现为椎间盘内细胞数量减少和功能降低，聚合蛋白聚糖和主要胶原进行性减少。因此调节上述两者的相对表达以及进一步调节细胞外基质代谢可能为治疗椎间盘突出症提供新的战略方案，随着未来研究的进展，明确基质金属蛋白酶活化的具体机制，从基因或分子生物水平调节后者的活化进程，阻止或延缓椎间盘退变，从根本上治疗椎间盘退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程