AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (29): 4297-4302.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.006

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AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义

赵泉来，郑权，徐宏光，沈祥，王弘，刘平，王凌挺，杨晓明，陈学武，张玙，李逸峰，俞宏星

皖南医学院第一附属医院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市 241001

收稿日期:2016-04-29 出版日期:2016-07-08 发布日期:2016-07-08
通讯作者: 徐宏光，博士，主任医师，教授，硕士生导师，皖南医学院第一附属医院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市 241001
作者简介:赵泉来，男，1986年生，安徽省当涂县人，2013年皖南医学院毕业，硕士，医师，主要从事脊柱外科临床及基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81272048)；卫生部公益性行业专项基金(201002018)；安徽省自然科学基金(1308085MH152)

Expression of AMP-activated protein kinase in subcultured rat endplate chondrocytes

Zhao Quan-lai, Zheng Quan, Xu Hong-guang, Shen Xiang, Wang Hong, Liu Ping, Wang Ling-ting,
Yang Xiao-ming, Chen Xue-wu, Zhang Yu, Li Yi-feng, Yu Hong-xing

Department of Spine Surgery, Yijishan Hosptial, Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China

Received:2016-04-29 Online:2016-07-08 Published:2016-07-08
About author:Zhao Quan-lai, Master, Physician, Department of Spine Surgery, Yijishan Hosptial, Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81272048; Special Fund of the Public Service of the Mnistry of Health of China, No. 201002018; the Natural Science Foundation of Anhui Province, China, No. 1308085MH152

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
终板软骨：终板软骨为附着于椎体上下缘的一层透明软骨，它能够将椎体末端血管中的营养物质通过渗透作用运输至髓核和内层纤维环，是椎间盘主要的营养途径，终板营养途径阻断，可致椎间盘内Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等表达减少，椎间盘发生退变。
AMP活化蛋白激酶：AMP活化蛋白激酶(AMPK)是真核生物中一种重要的蛋白激酶，其在各种与代谢相关的器官中均有表达，能够协调调节细胞的合成代谢和分解代谢，因此被称为细胞能量调节器，近年的研究表明AMP活化蛋白激酶活性与软骨的形成和降解也有重要的关系。

摘要
背景：终板软骨功能障碍是椎间盘退变的始动因素，AMPK在软骨的形成和降解过程中也具有相应的调节作用。
目的：观察AMP活化蛋白激酶(AMPK)在终板软骨细胞体外自然传代退变模型中的作用。
方法：分离大鼠腰椎终板软骨细胞，体外自然传代培养，取原代细胞(P0)、第2代细胞(P2)及第5代细胞(P5)，倒置显微镜及细胞骨架染色观察终板软骨细胞形态的变化，甲苯胺蓝染色观察终板软骨细胞表型的改变；MTT法检测3组细胞的增殖能力；通过Real time-PCR评价3组终板软骨细胞中软骨标志基因(Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9)以及基质金属蛋白酶3和13的表达变化，Western blot检测终板软骨细胞中AMPK蛋白磷酸化的改变。
结果与结论：①随着传代次数的增加终板软骨细胞形态发生改变，增殖能力降低，软骨细胞表型逐渐丢失；②P5代终板软骨细胞中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及SOX-9基因表达明显下调(P < 0.05或0.01)，而基质金属蛋白酶3, 基质金属蛋白酶13基因表达较P0代及P2代均明显增高(P < 0.01)；③Western blot 结果显示P5代终板软骨细胞中AMPK蛋白磷酸化水平明显降低。提示：AMPK磷酸化的水平与终板软骨细胞体外自然传代过程中软骨细胞的退变密切相关，调控AMPK活性有可能减轻或阻止终板软骨及椎间盘的退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-5619-8082(赵泉来)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 椎间盘, 终板软骨细胞, 传代培养, AMPK, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Endplate cartilage degeneration initiates intervertebral disc degeneration. AMP-activated protein kinase (AMPK) regulates the formation and degradation of cartilage.
OBJECTIVE: To explore the role of AMPK in an in vitro natural degeneration model of chondrocytes derived from endplate of rat intervertebral discs.
METHODS: Morphology of in vitro subcultured endplate chondrocytes of rat intervertebral discs at passages 0, 2, and 5 were observed under an inverted microscope following cytoskeleton staining. Chondrocyte phenotype, proliferation, and the cartilage marker genes (type II collagen, proteoglycan, SOX-9, matrix metalloproteinase-3 and -13), and AMPK phosphorylation were determined by toluidine blue staining, MTT assay, real-time PCR analysis, and western blot assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The altered morphology, decreased proliferation ability, and phenotype loss were observed in chondrocytes with increased passage number. Gene expression of type II collagen, proteoglycan, SOX-9 was significantly decreased; while gene expression of matrix metalloproteinase-3 and -13 was significantly increased in endplate chondrocytes at passage 5 compared with those at passages 0 and 2. AMPK phosphorylation in endplate chondrocytes at passage 5 was significantly decreased. These findings indicate that AMPK phosphorylation is involved in in vitro natural degeneration of chondrocytes derived from the endplate of rat intervertebral discs, and the degeneration of endplate chondrocytes and intervertebral discs can be inhibited through the regulation of AMPK activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Intervertebral Disk, Chondrocytes, Matrix Metalloproteinases

中图分类号:

R318

赵泉来，郑权，徐宏光，沈祥，王弘，刘平，王凌挺，杨晓明，陈学武，张玙，李逸峰，俞宏星. AMP活化蛋白激酶在终板软骨细胞体外传代培养中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4297-4302.

Zhao Quan-lai, Zheng Quan, Xu Hong-guang, Shen Xiang, Wang Hong, Liu Ping, Wang Ling-ting, . Expression of AMP-activated protein kinase in subcultured rat endplate chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4297-4302.

图/表（结果） 3

2.1 终板软骨细胞形态及软骨表型在自然传代过程中的变化倒置相差显微镜下观察可见P0代及P2代终板软骨细胞呈多角形、铺路石状单层覆盖于培养皿底部，而P5代软骨细胞形态则明显发生改变，有明显的纤维化趋势(图1A)；鬼笔环肽染色显示P0代及P2代细胞骨架呈多向散射状分布，而P5代细胞骨架则呈单向梭形分布(图1B)；甲苯胺蓝染色显示P5代软骨细胞较P0代及P2代细胞基质染色明显减淡，周围异染物质增多(图1C)。

2.2 终板软骨细胞自然传代过程中细胞增殖能力的变化 MTT实验结果显示，P0代细胞在培养3 d内的增殖较慢，7 d左右铺满培养皿；P2代软骨细胞培养前3 d增殖较快，4 d左右长满；与P0代及P2代终板软骨细胞相比较，P5代细胞的增殖能力明显降低(图2)。

2.3 传代过程中软骨合成基因及分解基因的表达变化 Realtime-PCR结果显示与P0代相比较，P2代终板软骨细胞软骨合成代谢基因以及分解代谢基因的表达未见明显差异；而P5代细胞中软骨合成代谢基因Ⅱ型胶原(P5/P0=0.35，P=0.005)、蛋白聚糖(P5/P0=0.51，P=0168)及SOX-9 (P5/P0=0.43，P=0.008)基因表达较P0代及P2代明显下调(图3A)，软骨分解代谢基因基质金属蛋白酶3(P5/P0=1.68，P=0.005)，基质金属蛋白酶13(P5/P0=1.83，P=0.002)的表达明显增高(图3B)。

2.4 终板软骨细胞自然传代过程中AMPK的表达变化Realtime-PCR结果显示在P0代、P2代及P5代终板软骨细胞中，AMPK基因mRNA的表达未见明显改变(图4A)；Western blot结果则显示，3组终板软骨细胞中AMPK总蛋白表达未见明显差异，而P5代终板软骨细胞中AMPK蛋白磷酸化水平较P0代及P2代明显降低(图4B)。

参考文献

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引言

材料方法

设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年11月至2015年10月在皖南医学院第一附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物清洁级SD大鼠10只(6周龄)，体质量(160±20) g，雌雄不限(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，合格证号：SCXK (沪)2014-0034。

1.3.2 试剂和仪器 DMEM/F12培养液(Hyclone,美国)；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(Sigma．Aldrich，美国)；胎牛血清(Gibico，美国)；Trizol裂解液(Invitrogen，美国)； Nano-Drop 2000(Thermo&Scientific，美国)；PCR反应体系和反转录试剂盒(Fermentas，美国)； Real-Time PCR仪(Roche LightCycler 480，德国)；Odyssey红外成像系统(Li-Cor；英国)；激光共聚焦显微镜(Leica，德国)；MTT试剂盒(碧云天生物科技公司，中国)；兔抗鼠AMPK抗体(Abcam，英国)；兔抗鼠磷酸化AMPK抗体(Abcam，英国)；山羊抗兔二抗(Bioworld Technology，美国)；鬼笔环肽(Invitrogen，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠终板软骨细胞的分离与培养取SD大鼠10只，颈椎脱臼法处死，体积分数75%乙醇浸泡15 min，置于超净台内剪开背部皮肤与肌肉，取出整个腰椎，4倍解剖显微镜下仔细剥离L₁-L₅椎间盘的终板软骨。按徐宏光等^[7]方法用酶消化法分离培养终板软骨细胞。当终板软骨细胞单层融合至80%-90%时开始传代，具体步骤为：弃培养液，PBS洗涤1次，1 mL 0.25%胰蛋白酶37 ℃消化2 min，2 mL DMEM/F12培养液(含体积分数10%胎牛血清)终止消化，1 000 r/min离心5 min后收集细胞，均匀种植于培养皿中。细胞传至第5代时终止传代。分别分为原代细胞(P0)组、2代细胞(P2)组以及5代细胞(P5)组。其中P0代为对照组，P2代及P5代为自然传代组。

1.4.2 细胞骨架及甲苯胺蓝染色分别取P0代、P2代及P5代终板软骨细胞行细胞爬片，当软骨细胞单层融合至60%时，取出细胞爬片，进行染色。细胞骨架染色：40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，每次10 min，体积分数5%牛血清白蛋白的封闭液室温孵育2 h，鬼笔环肽(5 mg/L)室温孵育30 min，PBS洗涤3次，封固剂封固后激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架(F-actin)的变化。甲苯胺蓝染色：40 g/L多聚甲醛固定30 min，自来水清洗15 min，0.5%甲苯胺蓝染色2 h，自来水清洗3次，每次10 min，自然晾干后，封片剂封固后，倒置显微镜观察终板软骨细胞形态的变化。

1.4.3 MTT法检测终板软骨细胞增殖将P0代、P2代及P5代终板软骨细胞分别接种于96孔培养板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中连续培养8 d，每24 h往96孔板每孔中加入20 µL 5 mg/L MTT 溶液，继续置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养4 h。弃去各孔中的培养液，加入200 μL二甲基亚砜后摇床震荡10 min。570 nm波长处测定96孔板上每个孔的吸光度值(A)值。

1.4.4 RNA提取及实时反转录聚合酶链反应(Real time RT-PCR) Trizol法提取终板软骨细胞的总RNA，采用NanoDrop 2000检测RNA纯度与浓度；取1 µg总RNA样品，20 μL体系一步法反转录合成cDNA，将反转的cDNA稀释5倍后，进行Real time RT-PCR反应。采用10 μL扩增体系[上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，稀释cDNA模板4 μL，SYBR Premix ExTaq^TM(2X)5 μL]，引物序列见表1。样品混合均匀后置于实时PCR仪上反应，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸25 s，扩增50个循环。熔解曲线分析：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s；每模板3个复孔，灭菌超纯水为阴性对照，GAPDH为内参，结果采用2^-^??Ct方法分析相对定量^[8]。检测3组终板软骨细胞中软骨标志基因(Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9)以及基质金属蛋白酶(基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13)。

表1 Real time RT-PCR 引物序列

Table 1 Real-time RT-PCR primers

基因	引物序列(5’→3’)	产物长度(bp)
Ⅱ型胶原	上游：CCT GAA ACT CTG CCA CCC AG 下游：GTT CTT CCG AGG CAC AGT CG	151
蛋白聚糖	上游：ACA CCC CTA CCC TTG CTT CT 下游：AAA GTG TCC AAG GCA TCC AC	124
SOX 9	上游：CGT CAA CGG CTC CAG CA 下游：TGC GCC CAC ACC ATG A	69
基质金属蛋白酶3	上游：ATG ATG AAC GAT GGA CAG ATG A 下游：CAT TGG CTG AGT GAA AGA GAC C	99
基质金属蛋白酶13	上游：GCG GTT CAC TTT GAG GAC AC 下游：TAT GAG GCG GGG ATA GTC TTT	108
AMPK	上游：TTT GCC TAG AAT CCC CAC AG 下游：TAA GGA GCC CAG AAA ACA GC	71
GAPDH	上游：CTC AAC TAC ATG GTC TAC ATG TTC CA 下游：CTT CCC ATT CTC AGC CTT GAC T	81

1.4.5 蛋白提取及Western blot 弃去培养液，收集细胞，PBS洗3次，加100 μL蛋白提取缓冲液(radioimmunoprepciption assay，RIPA)，冰上裂解30 min，12 000 r/min 4 ℃离心5 min，吸取上清，二辛可宁酸(bicinchonininc acid，BCA)法检测蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液后95 ℃煮沸5 min。每组取20 μg蛋白样品，SDS-PAGE凝胶电泳分离，300 mA恒流湿转法转膜 90 min。5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭2 h，一抗(5%BSA 1∶1 000)4 ℃孵育过夜。洗膜缓冲液(TBST)洗3次每次10 min，二抗(5%BSA 1：5000)室温孵育1 h，TBST洗3次，Odyssey红外扫描仪扫描成像，检测终板软骨细胞中AMPK蛋白磷酸化的改变。

1.5 主要观察指标 ①终板软骨细胞形态变化；②软骨合成基因二型胶原、蛋白聚糖、SOX9以及软骨降解代谢基因基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13表达变化；③AMPK表达以及磷酸化的变化。

1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 18.0进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析及LSD检验，以α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

椎间盘是人体最大的无血管组织，其营养供应主要是靠外侧纤维环以及椎体两端的终板软骨的渗透作用来完成。终板软骨表型的丢失以及功能障碍会阻断椎间盘的营养供应从而引起椎间盘退变。有研究发现在椎间盘退变的初期终板软骨即可见微骨折的发生，同时终板软骨表型也已经发生明显的改变^[9-10]。Xu等^[11]通过提取颈椎骨折以及颈椎病患者的终板软骨细胞进行体外培养后发现，颈椎间盘退变患者的终板软骨细胞增殖能力明显降低。实验在建立终板软骨细胞体外退变模型的基础上，发现随着传代次数的增加终板软骨细胞的正常形态及表型均发生改变，同时与原代以及二代终板软骨细胞相比较，传代培养至第5代时软骨细胞的增殖能力也明显降低。

终板软骨属于典型的透明软骨，主要由软骨细胞及细胞外基质构成，软骨细胞外基质是维持终板软骨细胞功能的重要成分。软骨细胞的合成代谢主要包括Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及Sox9等，Ⅱ型胶原在透明软骨中软骨细胞正常形态的维持以及分散周围应力的过程中发挥重要的作用，软骨细胞外基质中Ⅱ型胶原含量的减少将导致软骨结构和成分的改变，最终引起软骨退变。蛋白聚糖能够通过调节细胞外基质的有效孔径，促进营养物质在终板软骨中的运输，是保证终板软骨自身及椎间盘营养供应的关键^[12]。Sox9基因作为软骨发育过程中重要的转录因子，能够调控Ⅱ型胶原、蛋白多糖等基因在软骨中的表达^[13]。软骨表型的维持同时也受到软骨分解代谢相关基因的影响，基质金属蛋白酶如基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶13等能够通过促进软骨细胞外基质的降解而导致软骨退变^[14]。实验通过对大鼠腰椎终板软骨细胞进行连续传代培养后发现原代及2代终板软骨细胞中合成代谢基因与分解代谢基因表达差异并不明显；传代培养至第5代时，软骨细胞中软骨合成代谢基因表达明显降低而分解代谢基因表达增高，提示传代次数的增多能够明显促进终板软骨细胞表型的丢失。

AMP活化蛋白激酶(AMPK)是一种能够调节细胞的合成代谢和分解代谢重要的蛋白激酶，其结构是由一个α-催化亚基、一个β-调节亚基和一个γ-调节亚基组成的异源三聚体复合物。近年来有研究表明AMPK不仅能控制能量代谢同时还能够调节与蛋白合成及线粒体生物合成相关的生物学途径,细胞内AMPK的活性与钙离子水平及软组织的矿化密切相关^[15]。有研究表明AMPK能够通过调节NF-λB信号通路而抑制炎症反应，是一种新型的抗炎信号途径，此外，AMPK的活性与软骨的形成和降解也具有重要的关系^[16-17]。Terkeltaub等^[18]研究显示AMPK在骨关节炎患者关节软骨中的表达明显减少，调控AMPK活性则能够明显的抑制软骨炎症相关因子的表达。此外，AMPK活性降低还能够促进关节软骨基质的降解从而促进骨关节炎的形成^[19]。Srinivas等^[20]发现AMPK通过与mTOR、HIF等信号通路相互作用调节自噬进而促进生长板软骨的成熟。综上所述，AMPK在关节及生长板软骨的形成和降解过程中都具有重要的调节作用。终板软骨与关节软骨同属透明软骨，但二者在结够以及功能上都明显不同。研究中作者发现随着体外传代次数的增加，终板软骨细胞表型丢失，AMPK基因水平及蛋白水平的表达均未见明显差异，而AMPK磷酸化水平则随着传代次数的增多明显降低。

综上所述，此次研究在建立大鼠终板软骨细胞体外自然传代退变模型的基础上，发现终板软骨细胞软骨表型的丢失可能与AMPK的磷酸化密切相关，调控AMPK有可能成为阻止终板软骨及椎间盘退变的新的靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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