1 对象和方法 Subjects and methods
1.1 设计 病例-对照分析。
1.2 时间及地点 病例来源于2010年10月至2013年10月右江民族医学院附属医院收治的壮族骨关节结核患者150例。
1.3 对象
1.3.1 骨关节结核组 选取右江民族医学院附属医院收治的壮族骨关节结核患者150例。
诊断标准:临床表现及术后病理确诊。
纳入标准:①诊断明确;②术前排除其他肺外结核且影像学检查未发现肺部结核病灶;③患者对治疗均知情同意。
排除标准:糖尿病、肿瘤、自身免疫性疾病、遗传病史等。
1.3.2 健康对照组 选取同期在右江民族医学院附属医院体检中心诊断的健康壮族体检者165人,排除结核病、糖尿病、肿瘤、自身免疫疾病及遗传病史。
1.4 方法
1.4.1 基因组DNA提取 用枸橼酸钠抗凝管于清晨抽取受试者肘正中静脉血2 mL,-80 ℃冰箱保存备用。
1.4.2 引物设计与合成 根据NCBI上查找的白细胞介素12A、白细胞介素12B基因DNA序列,选择包含白细胞介素12A基因rs568408位点和白细胞介素12B基因rs3212227位点的序列输入引物设计软件Primer 5,可得到用于特异性扩增的PCR上、下游引物和延伸引物。用在线Primer5 软件根据位点多态性和已知的DNA序列设计PCR引物,由上海天昊生物科技有限公司合成。
rs568408 G/A位点和rs3212227 A/C位点PCR扩增引物和延伸引物序列:
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位点
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引物名称
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序列
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rs568408
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上游引物
下游引物
延伸引物
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5’-GAG GTC CCT CCA AAC CGT TGT C -3’
5’-CAG GAT GGA TAT TTT CCC TTC TTA GCA-3’
5’-ATG TCA AAA ATA CTT GAT CAG AGG TAT-3’
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rs3212227
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上游引物
下游引物
延伸引物
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5’-GGC AAC TTG AGA GCT GGA AAA TCT -3’
5’-TCC AGG ATG AAA ATT TGG AGG AAA A -3’
5’-TTT TTT TTT GAT ATC TTT GCT GTA TTT GTA TAG TT -3’
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1.4.3 聚合酶链式反应 PCR扩增反应体系共20 μL,其中包括10×PCR 缓冲液2.0 μL,0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL,上、下游引物各1.0 μL,基因组DNA 1.0 μL,TaqDNA聚合酶1.0 U,不足体积用灭菌双蒸水补足至 20 μL。PCR 反应条件为:94 ℃,15 min;94 ℃×30 s, 60 ℃×30 s,72 ℃×20 s,共35个循环;72 ℃×10 min。PCR产物使用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得,4 ℃保存。
1.4.4 单碱基延伸反应和电泳测序 产物经虾碱酶(SAP)(from Promega)和外切酶I(EXO I)(from Epicentre)纯化后,用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。
延伸产物用虾碱酶(SAP)(from Promega)纯化后在ABI3730xl上样。单核苷酸多态性分型用GeneMapper 4.1(Appliedbiosystems)来分析。
1.5 主要观察指标 ①白细胞介素12基因多态性;②白细胞介素12基因单核苷酸多态性位点多态性与骨关节结核易感性的关系;③白细胞介素12基因单倍型分析及与骨关节结核易感性的关系;④骨关节结核组两位点野生基因型与突变基因型间白细胞介素12、血沉、C-反应蛋白水平的比较。
1.6 统计学分析 数据统计由SPSS 19.0软件包完成。根据基因测序结果直接计算病例组及对照组两位点的基因型和等位基因频率,Hardy-Weinberg遗传平衡采用χ2检验。基因型及等位基因频率比较采用χ2检验,P < 0.05为差异有显著性意义。并通过SHEsis软件完成单倍型分析,P < 0.05时有显著性意义。病例组白细胞介素12、血沉、C-反应蛋白水平直接采用前期实验数据结果[6],计量资料用x±s表示,各组间数据比较采用独立样本的t 检验,P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程