腺病毒介导脑源性神经营养因子与脑出血模型大鼠内源性神经干细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
神经营养因子：具有多种功能，可对损伤后感觉神经元的存活予以有效维持，促进神经纤维的延伸，并对神经前体细胞的分化产生良好的调节作用。神经营养因子具有维持神经干细胞的存活，促进脑源性神经干细胞增殖、分化及迁移，抑制细胞凋亡，营养神经元，保护和修复受损神经等效应，有助于中枢神经系统损伤后神经的再生及修复。
神经干细胞治疗脑出血：可采取两种策略，一种是内源性神经干细胞的活化，另外一种是外源性神经干细胞的移植。在成体哺乳动物脑内，神经干细胞和神经祖细胞主要存在于脑的室管膜下区、齿状回等部位。当脑组织或脊髓组织损伤时，这些细胞在神经营养因子等因子的诱导下，向损伤部位迁移并分化为神经细胞，补充或替代损伤的上、下运动神经元。

摘要
背景：以往的研究表明，神经营养因子具有多种功能，可对损伤后的神经元存活予以有效维持。
目的：利用腺病毒对脑源性神经营养因子进行介导，观察其对大鼠脑出血后内源性神经干细胞分化的影响。
方法：取90只SD大鼠，制备脑出血模型，脑出血后12 h开始腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷，2次/d，连续注射10 d；造模成功后随机分为3组，每组30只，分别在脑部立体定位注射腺病毒载体、腺病毒介导脑源性神经营养因子、生理盐水，注射后1 d、3 d、1周、2周、3周、4周，评估神经功能缺失评分，检测脑出血后血肿周围区生长相关蛋白吸光度值；注射后4周，免疫双标检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷/神经元、5-溴脱氧尿嘧啶核苷/神经胶质纤维酸性蛋白的表达。
结果与结论：①随着时间的推移，3组神经功能缺失评分不断减小，腺病毒介导脑源性神经营养因子组注射1-4周的神经功能缺失评分低于腺病毒载体组、生理盐水组(P < 0.05)；②随着时间的推移，3组血肿周围区生长相关蛋白平均吸光度值先升高后降低，腺病毒介导脑源性神经营养因子组注射3 d-4周的血肿周围区生长相关蛋白平均吸光度值均高于腺病毒载体组、生理盐水组(P < 0.05)；③腺病毒介脑源性神经营养因子组5-溴脱氧尿嘧啶核苷/神经元、5-溴脱氧尿嘧啶核苷/神经胶质纤维酸性蛋白双阳性率显著高于腺病毒载体组、生理盐水组(P < 0.05)；④结果表明，利用腺病毒对脑源性神经营养因子进行介导并对脑出血大鼠进行干预，可有效促进内源性神经干细胞的分化，促进动物神经功能的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0001-5718-7281(谢强)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 腺病毒, 病毒介导, 脑源性神经营养因子, 脑出血, 内源性神经干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies showed that neurotrophic factor has a variety of functions, which can effectively maintain the survival of neurons after injury.
OBJECTIVE: To observe the effect of adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor on the differentiation of endogenous neural stem cells after intracerebral hemorrhage in rats.
METHODS: A total of 90 Sprague-Dawley rat models of cerebral hemorrhage were made. At 12 hours after cerebral hemorrhage, 5-bromodeoxyuridine (BrdU) was intraperitoneally injected, twice a day, for 10 consecutive days. After model establishment, rats were randomly divided into three groups, 30 rats in each group, and were respectively subjected to brain stereotaxic injection of adenovirus vector, adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor and physiological saline. At 1 day, 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 4 weeks, neurological deficit score was evaluated. Absorbance value of growth associated protein around the area of hematoma after intracerebral hemorrhage was measured. At 4 weeks after injection, double immunostaining was used to detect the expression of BrdU/NeuN and BrdU/glial fibrillary acidic protein (GFAP).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the passage of time, nerve function defect score decreased in the three groups. At 1-4 weeks after injection, nerve function deficit scores were lower in the adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor group than that in the adenovirus vector group and saline group (P < 0.05). (2) With the passage of time, the average absorbance of three groups in the peri-hematoma region first increased and then decreased. The absorbance value was higher in the adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor group than in the adenovirus vector group and saline group at 3 days-4 weeks (P < 0.05). (3) BrdU/NeuN and BrdU/GFAP rates were significantly higher in the adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor group than that of adenovirus vector group and saline group (P < 0.05). (4) The results show that the brain-derived neurotrophic factor mediated by adenovirus, and intervention on cerebral hemorrhage in rats can effectively promote the differentiation of endogenous neural stem cells, and promote the recovery of neural function in animal.

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Key words: Cerebral Hemorrhage, Brain-Derived Neurotrophic Factor, Neural Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

谢强，王飞，周国平，张惠，马进显 . 腺病毒介导脑源性神经营养因子与脑出血模型大鼠内源性神经干细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4029-4035.

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图/表（结果） 3

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引言

干细胞是一类具有自我更新和多项潜能的细胞，在一定条件下，它可分化成多种功能的细胞和组织器官^[1]。细胞凋亡是机体生长、分化、发育和病理过程中，由基因编码调控的细胞主动自杀过程。机体通过凋亡将那些衰老、畸变和病变的细胞清除。干细胞移植治疗脑梗死的可能机制主要有重建神经环路、分泌神经营养因子、减少神经细胞凋亡，促进移植区域血管的再生^[2-3]。内源性神经干细胞是一种重要的干细胞类型，可发挥出良好的修复神经缺损效果^[4-5]。但内源性神经干细胞的增殖、迁移能力有限，分化成神经元的数量不多，难以形成损伤区神经组织结构和功能的重建^[6]。为此，对内源性神经干细胞进行有效激发，以促进细胞新生，更好地修复脑损伤，成为治疗脑出血的新思路。

正常的基因表达控制已足够修复普通的损伤，但在脊髓损伤中，继发性损伤造成的组织及神经细胞坏死、凋亡等使得正常基因控制手段无法满足组织的修复需要。腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体，被广泛应用于外源基因转导哺乳动物细胞。原因是腺病毒基因组结构稳定，可插入大片段外源基因，不发生基因重排，对宿主细胞要求不严，可感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞。有报道腺病毒对哺乳动物细胞的感染率可接近100%。传统构建腺病毒的方法是采用细胞内同源重组，这种方法采用在含有互补缺陷病毒包装信号基因的哺乳类细胞中进行同源重组，同源重组导致缺陷病毒在包装细胞中能够复制。尽管这种方法非常有用，但存在同源重组效率低、需要多次空斑纯化、产生重组病毒时间长等缺点，使它的应用受到限制。另外，腺病毒基因组不与宿主基因组发生整合，安全可靠。研究已证实，经胸锁孔突肌注射腺病毒载体进行逆行基因传递，可有效减少因颈部脊髓损伤导致的神经细胞和少突胶质细胞调亡。神经营养因子属于细胞因子家族，是一类特异性维持和促进神经元生长、存活和分化并影响突触可塑性的可溶性多肽因子。研究表明，神经营养因子具有多种功能。在实验中，选择利用腺病毒介导的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，对脑出血大鼠进行注射治疗，观察其对脑出血后内源性神经干细胞产生的影响。

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材料方法

1.1 造模动物与材料 SD大鼠90只，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，许可证号：SYXK(京) 2015-0008，均饲养于南阳市中心医院动物中心SPF环境。实验相关方案均提交南阳市中心医院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。大鼠BDNF基因腺病毒重组体由南阳市中心医院自行构建。

1.2 实验方法

实验分组与治疗：取90只SD大鼠，参照文献方法制备脑出血模型^[7]。对大鼠进行常规麻醉，固定在立体定向仪上，使上门齿钩平面比耳间线平面低2.4 mm。暴露前囟，于前囟前0.2 mm、中线右侧旁开3.5 mm处，在颅骨表面钻一直径约1 mm的孔。在距离大鼠尾巴末端约5 mm处剪断鼠尾，利用微量进样器吸取新鲜血液50 μL，迅速将微量进样器固定在立体定位仪并沿颅骨钻孔进针，深度5.5 mm。注血超过5 min，留针10 min后，缓慢退针。封闭创口，缝合头皮。课题组已构建大鼠BDNF基因腺病毒重组体，质粒含有报告基因绿色荧光蛋白^[8]。脑出血造模成功后即刻将大鼠随机分为3组，每组30只，分别设为腺病毒载体组、腺病毒介导BDNF组、生理盐水组，对各组大鼠进行脑部立体定向注射，在大鼠脑出血血肿周围前后右右四点各旁开2 mm、硬膜下5.0 mm，用微量注射器向各点分别注入腺病毒载体、腺病毒介导脑源性神经营养因子、生理盐水2.5 μL，每只注射10 μL。注射完毕利用骨蜡对颅骨创口机械能封闭，缝合头皮之后碘酒消毒。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)标记：用生理盐水将BrdU配制成溶液(5×10³ g/L，在各组动物脑出血后12 h开始进行BrdU腹腔注射(50 mg/kg)， 2次/d，连续注射10 d。

1.3 主要观察指标

神经功能缺失评分：注射后1 d、3 d、1周、2周、3周、4周，参照神经损害评分量表对3组大鼠进行神经功能缺失评分^[8]：0分，神经功能正常；1分，轻度神经功能缺损(提尾时左前肢屈曲)；2分，中度神经功能缺损(行走时向左侧转圈)；3分，中度神经功能缺损(向左侧倾斜)；4分，无自发行走，意识减退；5分，与缺血有关的死亡。

血肿周围区生长相关蛋白吸光度值检测：注射后 1 d、3 d、1周、2周、3周、4周，麻醉后处死各组5只大鼠，获得颅脑标本后制备切片，厚度16 μｍ。添加大鼠GAP-43抗体，检测各组脑出血血肿周围区生长相关蛋白平均吸光度值。

免疫双标检测：注射后4周，获得标本，对各组进行免疫双标检测，包括BrdU/神经元、BrdU/神经胶质纤维酸性蛋白。PBS洗涤3次，切片，添加加入0.1%Triton破膜，PBS洗涤3次后，添加正常羊血清封闭。添加加入一抗鼠抗BrdU，置于4 ℃环境下过夜。过夜后再次PBS洗涤3次，添加荧光二抗羊抗鼠TRITC，37 ℃避光孵育。1 h后PBS洗涤3次，添加一抗兔抗NeuN(1∶200)或兔抗GFAP(1∶200)，37 ℃避光孵育。1 h后PBS洗涤3次，添加荧光二抗羊抗兔FITC，避光反应，置于荧光显微镜下进行观察。

1.4 统计学分析 研究过程中得到的所有研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件，计量资料利用x(_)±s形式进行表示，采用t 检验和单因素方差分析，计数资料利用百分率进行比较，均采用χ²检验。检测P 值，P < 0.05代表数据差异有显著性意义。

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讨论

随着干细胞理论和相关技术的不断发展，为脑出血的治疗提供了新思路^[9]。神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能特性，在哺乳动物胚胎和成体中枢神经系统均存在^[10]。神经干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，是细胞替代治疗策略的基础。目前，利用神经干细胞治疗脑出血可采取两种策略，一种是内源性神经干细胞的活化，另外一种是外源性神经干细胞的移植^[11-13]。在成体哺乳动物脑内，神经干细胞和神经祖细胞主要存在于脑的室管膜下区、齿状回等部位。当脑组织或脊髓组织损伤时，这些细胞在神经营养因子等因子的诱导下，向损伤部位迁移并分化为神经细胞，补充或替代损伤的上、下运动神经元^[14-16]。

内源性神经干细胞是一种重要的神经干细胞类型，可对出血性脑损伤进行修复。内源性神经干细胞的激活与脑或脊髓损伤区释放的神经生长因子、炎症因子及趋化因子有关，其中生长因子对神经干细胞的增殖、迁移和分化起重要作用^[17-19]。但受到损伤等因素的影响，往往无法获得足够的内源性神经干细胞^[20]。为此，对内源性神经干细胞进行有效激发，以促进细胞新生，更好地修复脑损伤，成为治疗脑出血的新思路^[21]。研究中，分别采用腺病毒载体干预、BDNF干预、生理盐水同剂量注射方式对脑出血大鼠进行治疗。实验结果显示，随时间的推移，3组神经功能缺失评分均出现不断减小情况且腺病毒介导BDNF组减小幅度更为明显。注射后1周开始，腺病毒介导BDNF组神经功能缺失评分均显著小于腺病毒载体组和生理盐水组，但腺病毒载体组和生理盐水组之间各时间点比较差异均无显著性意义。即表明腺病毒介导下的BDNF可更好地促进脑源性神经干细胞的分化，达到改善动物神经功能的效果。神经营养因子是一种特殊的蛋白质因子，可为神经细胞的分化和增殖及存活等提供所需的营养物质^[22-23]。神经营养因子具有多种功能，可对损伤后感觉神经元的存活予以有效维持，促进神经纤维的延伸，并对神经前体细胞的分化产生良好的调节作用^[24-26]。神经生长因子具有维持神经干细胞的存活，促进脑源性神经干细胞增殖、分化及迁移，抑制细胞凋亡，营养神经元，保护和修复受损神经等效应，有助于中枢神经系统损伤后神经的再生及修复^[27]。

生长相关蛋白是一种特殊的快速轴突转运胞膜磷酸蛋白，具有一定的神经系统特异性^[28]。该蛋白与脑神经的神经发育和轴突再生及突触重建之间存在十分紧密的联系，会对神经的发育和再生产生十分重要的影响^[29-31]。在发育的神经元中，生长相关蛋白可沿着整个轴突进行表达。在出现中枢神经损伤之后，会出现生长相关蛋白表达水平显著上升的情况^[32-35]。因此，生长相关蛋白的高水平表达也被视为神经再生的典型特征之一^[36]。在实验中，注射后各组在脑出血后血肿周围区生长相关蛋白平均吸光度值均出现显著增大的情况，并在注射后1周达到高峰，之后均随时间推移逐渐下降。经统计学分析，注射后3 d开始，腺病毒介导BDNF组的血肿周围区生长相关蛋白平均吸光度值均显著大于腺病毒载体组与生理盐水组，但腺病毒载体组与生理盐水组之间各时间点比较差异无显著性意义。脑出血后，生长相关蛋白表达水平会发生一定的改变，推测相应的神经元再塑能力也随之出现一定改变。因此，采取有效措施促进生长相关蛋白表达水平的提高，并延长其表达时间，可以促进中枢神经系统损伤的再生和修复。实验结果显示，腺病毒介导BDNF可有效促进生长相关蛋白表达水平的提高，由此也可推断，利用外源性 BDNF的进行干预，可对受损中枢神经系统的再生产生一定的促进作用。研究中，还对腺病毒介导BDNF对内源性神经干细胞分化的影响进行了分析。在实验中，利用BrdU累积标记方法进行检测。术后对各组进行免疫双标检测，经统计学分析，腺病毒介导BDNF组BrdU/神经元、BrdU/神经胶质纤维酸性蛋白双阳性率显著高于腺病毒载体组与生理盐水组；但腺病毒载体组与生理盐水组之间比较差异均无显著性意义。上述结果表明，腺病毒介导BDNF可对内源性神经干细胞的分化产生有效促进作用。

综上所述，利用腺病毒对BDNF进行介导，并对脑出血大鼠进行干预，可有效促进内源性神经干细胞的分化，促进动物神经功能的恢复。通过高水平神经营养因子对内外源性神经干细胞的增殖、迁移和分化的促进作用，可达到治疗脑出血之目的。

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