亚低温对构建脑梗死模型大鼠梗死区神经再生微环境的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
亚低温：对脑血流有调节作用，降低脑氧代谢率和改善细胞能量代谢、减少兴奋性氨基酸的释放、减少氧自由基的生成、减少细胞内钙超载，增加神经元泛素的合成、减少神经元坏死和凋亡、促进细胞间信号传导的恢复、减少脑梗死的面积、减轻脑水肿和降低颅内压等，但对血压、血氧分压、二氧化碳分压、血pH值和血糖无影响，对实验动物心、肺、肾、小肠也无病理性损害。
微环境：指的是细胞间质及其中的体液成分，参与构成细胞生存的微环境，微环境的稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件，微环境成分的异常变化可使细胞发生病变。

摘要
背景：大量研究表明亚低温对脑梗死后的神经元具有很好的保护作用。
目的：观测亚低温对脑梗死模型大鼠神经再生微环境的影响，并分析其对脑梗死后神经功能恢复的可能作用机制。
方法：从65只成年雌性SD大鼠中随机取20只作为假手术组，其余45只结扎颈动脉建立脑梗死模型，排除造模失败及死亡的5只，余下40只大鼠随机等分为脑梗死组及亚低温组。脑梗死组应用半导体致冷低温仪诱导头部亚低温调节体温至(37±1) ℃，术后转移到温度为25 ℃的房间；亚低温组大鼠采用半导体致冷低温仪诱导头部亚低温，在大鼠脑缺血模型后13.0-14.0 min时，把缺血侧头颅与亚低温治疗仪的探头紧密连接，调置制冷器温度为6-8 ℃，使大鼠病灶侧脑组织温度控制在32.0-33.0 ℃，维持4 h。
结果与结论：与脑梗死组相比，亚低温组大鼠BBB评分明显增加，梗死灶体积缩小。造模后1 d，亚低温组大鼠脑组织中生长相关蛋白43 mRNA表达水平与脑梗死组接近，2周时亚低温组大鼠脑组织中生长相关蛋白43 mRNA表达水平较脑梗死组显著升高。提示亚低温治疗可通过对脑梗死引起的神经细胞损伤起到保护作用，改善神经功能的恢复，其机制可能与上调脑组织缺血半影区生长相关蛋白43的表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0001-7784-4365(郑瑞娟)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 亚低温, 脑梗死, 神经再生, 运动功能, 大鼠, 脑梗死模型, 微环境, 再生

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies have demonstrated that mild hypothermia has a better protective effect on neurons after cerebral infarction.
OBJECTIVE: To investigate the effect of mild hypothermia on nerve regeneration microenvironment of infarcted area in rat models of cerebral infarction and analyze its possible effects on neural functional recovery after cerebral infarction.
METHODS: Twenty out of 65 adult female Sprague-Dawley rats were randomly selected as the sham group. The remaining 45 rats were subjected to carotid artery ligation to establish rat models of cerebral infarction. Five rats were rejected because of modeling failure or death, the remaining 40 rats were randomly and evenly divided into cerebral infarction and mild hypothermia groups. The head temperature of rats in the cerebral infarction group was downregulated to (37±1) ℃ using a semiconductor refrigeration instrument. The rats were transferred to the room with the temperature of 25 ℃ after the operation. Brain hypothermia was also induced in rats from the mild hypothermia group. At 13.0-14.0 minutes after establishing rat models of cerebral ischemia, the head on the side of cerebral ischemia was tightly connected with the probe of the semiconductor refrigeration instrument. The refrigerator temperature was adjusted to 6-8 ℃, so as to make the temperature of brain tissue on the lesion side at 32.0-33.0 ℃ for 4 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the cerebral infarction group, the BBB scores of rats in the mild hypothermia group were distinctly increased, and the volume of infarcted area decreased. At 1 day after modeling, the expression level of growth associated protein 43 mRNA in brain tissue of rats in the mild hypothermia group was close to that in the cerebral infarction group. At 2 weeks after modeling, the expression level of growth associated protein 43 mRNA in brain tissue of rats in the mild hypothermia group was significantly increased compared with that in the cerebral infarction group. These results suggest that mild hypothermia therapy can protect nerve cells against injury caused by cerebral infarction and promote the recovery of neurological function. Its underlying mechanism may be related to the up-regulation of the expression of growth associated protein 43 in ischemic penumbra.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Infarction, Middle Cerebral Artery, Hypothemia, GAP-43 Protein, Apoptosis

中图分类号:

R318

郑瑞娟，高玉红. 亚低温对构建脑梗死模型大鼠梗死区神经再生微环境的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4013-4019.

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图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程 从65只大鼠中随机取20只作为假手术组，其余45只结扎颈动脉建立脑梗死模型，排除造模失败及死亡的5只，余下40只大鼠随机等分为脑梗死组及亚低温组。最终共60只大鼠进入结果分析。造模流程图见图1。

2.2 模型创新性 结扎颈内动脉制备的局灶性脑缺血大鼠模型可以选择性地阻断进入大脑中动脉的血流，阻断颈内动脉的下丘脑分支，仅少量出现下丘脑梗死，更

符合临床情况。

2.3 模型更接近临床实践 实验以结扎颈动脉方法建立脑梗死模型，经TTC染色确认脑梗死灶明显。

2.4 脑组织病理变化 苏木精-伊红染色显示，假手术组大鼠脑组织未见明显病理改变；脑梗死组大鼠脑组织可见大面积梗死灶，神经元出现典型的缺血性改变，在梗死区周围及梗死区可见散在胶质细胞增生，病变部位与周围组织界限较清楚，其中心区神经元数量明显减少；亚低温组大鼠脑组织较脑梗死组梗死灶明显减小，梗死灶内残存的神经元较多，可见轻度缺血性改变(图2)。

2.5 运动功能 造模前各组大鼠BBB评分差异无显著性意义(P > 0.05)。与假手术组相比，脑梗死组大鼠BBB评分降低(P < 0.05)。治疗2周后，亚低温组大鼠BBB评分较脑梗死组显著增加(P < 0.05；表2)。

2.6 脑梗死体积 TTC染色发现，假手术组大鼠脑组织未见梗死灶，脑梗死组大鼠梗死灶主要位于皮质和纹状体，而亚低温组大鼠梗死灶仅限于纹状体，且亚低温组大鼠梗死灶体积小于脑梗死组(P < 0.05；表3)。

2.7 脑组织中生长相关蛋白43 mRNA表达 反转录PCR检测结果显示，造模后1 d，亚低温组大鼠脑组织生长相关蛋白43 mRNA表达水平与脑梗死组接近(P > 0.05)，2周时亚低温组大鼠脑组织生长相关蛋白43 mRNA表达较脑梗死组显著升高(P < 0.05；图3，表4)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年5月至2014年10月在天津医科大学神经病学研究所完成。

1.3 材料 成年雌性SD大鼠65只，鼠龄1个月，体质量220-280 g，购自华北煤炭医学院，动物质量合格证号：SCXK20060008。所有大鼠于恒温下饲养，自由饮水和进食，于实验前1 d禁食不禁水。实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

RT-PCR两步法试剂盒方法(北京天根生化有限公司)；cDNA合成试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)；AMV反转录试剂盒(日本Takara公司)；RNA干扰序列，2.5%氯胺酮(大连宝生物公司合成)；PCR引物序列(上海闪晶生物公司设计并合成)；MMLV试剂盒(德国QIAGEN公司)；生长相关蛋白43抗体(美国Thermo公司)；β-actin兔抗鼠多克隆抗体，辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体(美国Santa Cruz 公司)；半导体致冷低温仪(专利号 ZL98230936.0)(哈尔滨工业大学热工教研室研制)；紫外分光光度仪(上海临丽驰计量仪器公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 大鼠以体积分数5%乙醇消毒颈部皮肤，于大鼠腹腔注射2.5%氯胺酮20 mg/kg进行麻醉后，行颈部正中切口，然后将右侧颈总、颈内和颈外动脉游离，分别结扎颈总动脉和颈外动脉，在颈总动脉近分叉处制作“v”形切口，将1.8号鱼线(多聚赖氨酸处理过)插入右颈内动脉，切断右侧大脑中动脉起始段及其所有血液供应，将外端鱼线固定好后缝合伤口并再次消毒皮肤，观察神经症状和体征。假手术组仅采取切开颈部皮肤和肌层暴露双侧椎动脉和颈动脉。

1.4.2 造模成功的检测标准 依据Zea longa 5分制评分标准^[2]，神经缺损评分大于2分者判为造模成功。

1.4.3 动物分组 未造模的20只作为假手术组；排除造模失败及死亡的5只，余下40只大鼠随机等分为脑梗死组及亚低温组。

1.4.4 亚低温治疗 亚低温组应用半导体致冷低温仪诱导头部亚低温，在大鼠脑缺血模型后13.0-14.0 min时，把缺血侧头颅与亚低温治疗仪的探头紧密连接，调置制冷器温度为6-8 ℃，使大鼠脑组织温度控制在32.0-33.0 ℃，维持4 h。脑梗死组应用半导体致冷低温仪诱导头部亚低温调节体温至(37±1) ℃，术后转移到温度为25 ℃的房间。

1.4.5 神经功能缺损评定 大鼠神经功能缺损评定参照BBB评分，BBB评分将大鼠后肢运动分为22个等级，全瘫为0分，完全正常为21分，评分采用盲法。分数越低，说明神经功能障碍越严重。

1.4.6 苏木精-伊红染色观察脑梗死组织病理变化 于脑梗死模型大鼠后2周，在每组随机取大鼠5只，行乙醚麻醉处死后，固定于手术扳上，取梗死处组织，立即将其保存于100 g/L多聚甲醛液中，室温固定24 h。脑组织标本用切片机进行皮质连续冠状切片，片厚3.0-4.0 μm，置烤箱内60 ℃放置4-6 h使切片紧密黏附，常规脱蜡后用蒸馏水洗2 min，伊红染色1.0-2.0 min，中性树脂封固，室温干燥后，显微镜下观察脑组织病理学形态。

1.4.7 TTC染色测量脑梗死体积 造模后48 h，予以体积分数3.5%的水合氯醛将大鼠过量麻醉，迅速断头取脑组织放入-20 ℃冰箱冰冻后，进行冠状位切片(片厚2 mm)；在37 ℃下放入2%TTC(避光)染色30 min，正常脑组织染成红色，梗死灶为白色。以40 g/L多聚甲醛固定24 h后拍照。采用Image-ProPlus 5.0图像处理软件(北京亿诚恒达科技有限公司)测定每张脑片的面积和梗死面积，计算出大鼠的梗死灶体积和体积百分比。梗死体积=梗死面积×切片厚度，全脑体积=全脑面积×切片厚度，梗死体积百分比=梗死灶体积/全脑体积×100%。

1.4.8 反转录PCR测定生长相关蛋白43 mRNA的表达水平 于造模后1 d及2周每组取8只大鼠，取100 mg脑组织，应用Trizol提取RNA，以紫外分光光度仪测定RNA含量，根据MMLV试剂盒中步骤将RNA反转录成cDNA。引物序列见表1。依据Trizol(Invitrogen公司)试剂说明书介绍的方法提取组织的总RNA，以Oligo(dT)为引物、总RNA为模板，根据反转录PCR两步法试剂盒方法(北京天根生化有限公司)将mRNA反转录成cDNA。PCR反应条件为：30 ℃，10 min →2 ℃，30 min→99 ℃，5 min→ 5 ℃，5 min。产物cDNA于-20 ℃保存。扩增参数：94 ℃，2 min→(94 ℃，30 s →55 ℃，30 s→72 ℃，30 s)×35个循环→72 ℃，5 min。以反转录所得cDNA为模板，相关引物序列见表1。上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，40 μL体系。电泳结果用凝胶图像分析系统进行电泳条带吸光度分析。采用Image-ProPlus 5.0图像处理与分析系统进行图像分析。

1.5 主要观察指标 大鼠行为能力、脑组织形态、脑梗死体积及生长相关蛋白43 mRNA的表达水平。

1.6 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件包进行分析，计量资料数据均以x(_)±s表示，选择t 检验；其计数资料对比选择χ²检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

大量研究表明，亚低温能显著减缓脑梗死后神经细胞的凋亡进程。尤其是在早期及术前使用亚低温，能够降低对脑梗死后神经元和神经胶质细胞的伤害^[17-19]。Horn 等^[20]发现，选择性头部降温(30 ℃)可降低实验性心脏骤停15 min后脑神经元的病理损害进程。对亚低温可以保护脑神经功能作用的研究目前越来越受到学者的关注^[21-23]，甚至有动物实验完全摒弃常规治疗方案，而仅使用亚低温联合钙和谷氨酸的拮抗剂、抗氧化剂的方案^[24-26]。

脑梗死发生后，因脑组织缺血而引起的能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性反应、细胞内钙超载等一系列的缺血级联反始动了神经元的损伤，也决定了脑梗死后神经元的预后，脑梗死后神经元死亡的表现形式主要为坏死和凋亡，而细胞的凋亡可能影响着最终梗死的体积^[27-30]。研究发现，大鼠脑梗死后在缺血半暗带区出现大量的凋亡细胞，尤其是生长相关蛋白43蛋白在神经元凋亡中起着重要作用^[31-34]。生长相关蛋白43是一种相对分子质量为43 000的结合蛋白，也是神经元特异性磷蛋白^[35-38]。生长相关蛋白43存在于轴突生长锥，在生长及再生的神经组织中含量非常高，尤其是在神经损伤状态下的表达量明显增加^[39-42]。因此生长相关蛋白43可能与神经再生的关系密切，生长相关蛋白43

的含量、分布及表达可以了解神经组织生长及再生情况，亦可反映缺血半暗带区的神经结构重组^[43-46]。研究发现，在生理状态下生长相关蛋白43的表达呈低水平，损伤等应激状态下生长相关蛋白43表达呈显著增高。因此其可作为衡量神经可塑性大小的一个指标^[47-57]。国际上将生长相关蛋白43列为研究神经再生和促进损伤恢复的首选分子探针^[58-61]。实验发现亚低温组造模后1周生长相关蛋白43 mRNA表达水平接近脑梗死组，造模后2周则较脑梗死组显著升高，证明亚低温可通过促进生长相关蛋白43 mRNA表达来发挥神经保护作用。

综上所述，亚低温可促使脑梗死区微循环的再建立，促进脑梗死后神经元损伤的修复及神经功能的恢复，从而发挥其对脑梗死后神经可塑性的有利作用。其机制可能通过上调梗死灶周围大脑皮质生长相关蛋白43的表达有关。且局部给予亚低温治疗具有安全、简便、无显著并发症，且不影响脏器功能，疗效确切。相信在不久的将来亚低温在临床的应用会渐进成熟起来。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程