2.1  实验动物数量分析  实验共纳入Wistar大鼠32只，分为4组，每组8只大鼠，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2  各组大鼠给药后复发百分率对比  由表1可见，给药1周后，对照组与实验组比较，对照组复发距离明显高于实验组，对照组与各组实验组比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，实验组组间平行比较：10 mg/L组复发距离与复发百分率低于5 mg/L组、15 mg/L组。给药4周后对照组复发百分率达到93.94%，实验组明显低于对照组，两者差异有显著性意义(P < 0.05)。10 mg/L组的复发距离低于5 mg/L组和15 mg/L组，且组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3  各组大鼠给药后牙周组织的变化  在装置去除后1周时，两组苏木精-伊红染色情况可见，对照组牙周膜相对变窄有复发趋势，实验组牙周膜宽度较好，复发趋势相对较小。实验组牙周膜内成骨细胞均匀分布，对照组细胞排列紊乱，牙周膜变窄复发趋势明显，镜下见有少量破骨细胞产生，以及可见少量骨吸收及骨陷窝。大鼠牙周组织张力侧成骨细胞数量的变化如表2，实验组与对照组比较，给药第1周和第4周时，实验组成骨细胞的数量均高于对照组，且差异有显著性意义(P < 0.05)。组内比较10 mg/L组的成骨细胞数量高于5 mg/L组、15 mg/L组，组内比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4  各组大鼠免疫组织化学观察结果  给药1周时可见实验组骨保护素阳性表达略高于对照组，但不是十分明显，给药4周时实验组骨保护素阳性表达明显高于对照组。实验组组内比较给药1周时川芎嗪10 mg/L组与川芎嗪5 mg/L组、川芎嗪15 mg/L组不存在明显差异，给药4周时，川芎嗪10 mg/L组骨保护素阳性表达明显高于川芎嗪5 mg/L，15 mg/L组。见图1。

2.5  各组大鼠牙周组织苏木精-伊红染色结果  可见对照组牙周膜宽度变窄复发趋势明显，成骨细胞计数少，均低于实验组。川芎嗪10 mg/L组牙周膜宽度较好，复发趋势较小。实验组组内比较川芎嗪10 mg/L组明显好于川芎嗪5，15 mg/L组，川芎嗪10 mg/L组成骨细胞明显增多，从而达到了抑制复发的作用。见图2。

随着社会的进步，通过正畸手段治疗牙齿不齐、反等问题越来越被人们所接受。然而随着正畸的人数增加一个新的问题又出现了，那就是正畸结束后的复发与保持问题，尤其对于拔牙矫治以及内收的患者容易出现复发^[1]。对于抑制牙移动复发和缩短保持时间的问题，临床上的应对方法有应用钙离子导入，物理保持器等。许多学者认为找出复发的原因是保持效果的决定性问题。有关于复发的研究主要为生长发育方面、下切牙位置的变化、第3磨牙矫治结束后萌出以及牙槽骨改建未结束等^[2]。

Simonet等^[3]发现了参与骨密度调节的一种分泌性蛋白，将其命名为骨保护素(osteoprotegerin，OPG)。Tsuda等^[4]发现了破骨细胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF)，它是可抑制破骨细胞发生的细胞因子^[5]。骨保护素属于肿瘤坏死因子受体的一种，它与破骨细胞表面的特异性受体RANK相结合，骨保护素与RANK的竞争性结合抑制了RANKL与RANK的结合，促进破骨前体细胞分化成熟形成具有骨吸收功能的破骨细胞。

影响正畸骨改建的因素主要有物理因素和药物生物因素^[6]，如弱激光^[7]、磁场^[8]、超声波等物理手段^[9]，或前列腺素、二膦酸盐、辛伐他汀等药物制剂^[10-11]。骨改建主要包括新骨形成和骨吸收两方面，新骨形成主要是成骨细胞，而骨吸收相关的是破骨细胞。

许多的中医理论和中药药理都可以深入开发并与西医相结合并用^[12]。口腔医学领域应用有利于骨改建的药物，发现细胞因子、中药等能够通过全身局部作用影响牙周组织的功能性细胞促进牙槽骨改建^[13]，但研究表明一些消炎类药物会出现合成难、有恶心、头晕等不良反应的问题。因此，避免强烈的不良反应，药性温和持久成为国内外学者研究的焦点^[14]。 

随着中药与临床治疗的结合，对于临床正畸牙移动过程中骨改建来说，更需要一种高效、温和的药物来调控。Sassa等^[15]研究表明利用川芎嗪对去卵巢SD大鼠进行喂食8周后，结果显示可增加大鼠血清雌激素以及孕激素水平，而且可以提高碱性磷酸酶活性，提高胫骨的骨密度。何康等^[16]用3月龄SD雄性大鼠建立了环磷酰胺相关骨丢失的模型，模型建立后给予川芎嗪50 mg/(kg•d)治疗共14 d，结果实验组大鼠的骨钙、骨羟脯氨酸含量、血白细胞数、胸腺质量都显著增加，此研究结果说明川芎嗪可以达到预防环磷酰胺致大鼠骨丢失的效果^[15，17]。

川芎嗪在临床上的广范应用与研究表明，川芎嗪除具有治疗心血管疾病的作用外，还具有广泛的药理应用，但在正畸牙移动复发方面鲜少研究，实验探讨川芎嗪在保持阶段的作用及其在牙周组织中的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2015年3至10月在佳木斯大学动物实验中心完成。

1.3  材料  选用8周龄健康、雄性Wistar大鼠32只^[25]，体质量为(230±250) g，佳木斯大学动物中心提供，许可证号：SCXK(黑)2013-001。

实验过程中对动物的处置符合2009 年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.4  实验方法

1.4.1  实验分组干预方法  选用健康雄性Wistar大鼠32只，随机分为实验组和对照组，实验组又分为5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L 3个亚组，每组8只大鼠。按照King等加力方法建立正畸牙移动动物模型^[26-32]，以大鼠前牙为支抗，牵引上颌第1磨牙向近中移动，力约为50 g^[29-30]，持续加力21 d。实验组从加力装置去除前1 d开始进行局部注射川芎嗪溶液(50 µL)，质量浓度分别为5，10，15 mg/L(此质量浓度源于前期实验获得)，每隔2 d注射1次，注射于第1磨牙远中牙龈黏膜骨膜下，对照组在同一时间同一部位注射生理盐水50 µL，每隔1 d注射1次。在牙移动模型取出后1，4周后用心脏灌注法处死。

1.4.2  牙齿移动距离测量方法  在大鼠去除加力装置后第1周和第4周后取有正畸装置侧上颌第1磨牙区及其周围牙周组织的石膏模型，测量石膏模型上的第1磨牙远中与第2磨牙近中邻面的水平距离，每次测量3次取平均值。牙齿移动复发的距离，为牙齿移动前后距离测量的差值。

1.4.3  组织学标本制作  用体积分数10%的水合氯醛(1.0-1.2 mL/kg)给大鼠腹腔注射麻醉，断头处死，用40 g/L多聚甲醛(0.1 mol/L PBS，pH 7.0-7.6，含0.1% DEPC)进行固定。用10%EDTA溶液脱钙，石蜡包埋。进行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。

1.4.4  组织学观察和图像分析  每个免疫组织化学染色的标本选取部位接近的视野，采出10张片子，选出4张视野清晰的片子，在光镜下对比，观察实验组、对照组的骨保护素的分布及其变化规律，以及成骨细胞及牙周膜组织的变化。

1.4.5  苏木精-伊红染色  光镜下观察牙体牙周组织牙周膜宽度及成骨细胞数量情况，选取10个具有阳性成骨细胞的高倍镜头(×200)，该样本的最终结果，为所有细胞计数结果取平均数。

1.5  主要观察指标  ①大鼠给药后牙齿移动的复发百分率的比较。②大鼠牙周膜中骨保护素染色图像的分析。③大鼠牙周膜张力侧成骨细胞的数量。

1.6  统计学分析  实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件数据处理，进行方差分析。实验组与对照组之间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

正畸治疗在经历长时间的矫治结束之后又迎来了漫长的保持时间，此时的患者往往已经产生了厌倦心理从而不能积极的配合。牙周组织重建加快可以直接缩短保持时间，防止复发^[33]。临床保持器佩戴的时间不够与方法不对，导致复发的患者占大多数。

牙齿移动的主要机制是正畸力作用于牙齿，引起局部的牙槽骨改建。提高牙槽骨改建的速度可在加力时，应增加成骨和促进破骨的因素。复发的组织学基础为牙周膜及牙槽骨的变化，牙周膜纤维的张力收缩占其主要部分。复发时原张力侧的牙周膜纤维弯曲，有甚者出现透明样变性，产生足以引起原张力侧新生牙槽骨再吸收的牵张力^[34]。正畸牙移动时受力的牙齿牙周膜区域，在张力侧，牙周膜展现拉伸状态，牙周膜增宽，骨钙素与骨保护素上调张力侧有新骨形成^[35]。原压力侧牙槽骨吸收的部分可见成骨细胞排列，原有骨陷窝形成的部分可见新生牙槽骨形成。原张力侧牙周膜拉抻的位置可见牙周膜纤维收缩弯曲，新骨形成的部分可见成骨细胞变少，有少量破骨细胞出现，并出现骨陷窝及骨吸收现象，其厚度反映了牙复发程度^[36-37]。实验中，通过苏木精-伊红染色检测可以观察出，在复发1周时，对照组原张力侧牙周膜间隙变窄，复发趋势明显，实验组原张力侧牙周膜有复发趋势，但牙周膜宽度无明显变化，在第4周时，对照组牙周膜间隙缩窄明显，并且细胞排列紊乱，复发呈度明显增加，实验组牙周膜间隙变窄，有复发趋势，但与对照组相比较，牙周膜宽度明显宽于对照组，说明实验组复发程度明显小与对照组，说明川芎嗪溶液对牙移动复发，有明显的抑制作用。

丁寅^[38]研究发现牙移动复发时原张力侧牙周膜纤维收缩缩造成了与原张力侧相同的牙周膜内微循环的改变，正是因为牙周膜纤维的弹性回缩是的牙移动复发，这种复发移动刺激了破骨细胞在与张力侧行成骨陷窝，成骨细胞减少，相反在原压力侧形成成骨细胞，形成过渡性骨小梁，呈横行排列^[37]。在牙齿移动中，其转动中心位于牙根中1/3部位，再复发过程中形成同样的压力与张力区，复发时牙受力与牙齿受牵引时受力相反，在牙齿受到牵引力时压力侧牙周膜纤维收缩，张力侧牙周膜纤维变直，复发时则相反，在原牙槽骨吸收区可见成骨细胞排列，并伴有牙槽骨形成，在原新生牙槽骨侧可见破骨细胞，并伴有骨吸收^[38]。实验采用局部注射的方法使药物直接作用于第1磨牙远中也就是复发时的原张力侧，通过加速其原张力侧成骨细胞增加抑制骨吸收，从而达到抑制复发的效果。

通过实验研究证明，中药具有增加新骨形成速度，调节牙周组织血液循环，促进牙槽骨改建和抑制骨吸收等作用^[39]。在骨基质沉积的过程中，在钙化的骨基质中成骨细胞的前体细胞逐渐被包埋，蛋白质合成功能逐渐降低，胞浆内细胞器数量逐渐减少，最终终退化为成骨细胞，正常的骨改建过程需要骨吸收与骨形成保持动态的平衡，维持骨量的稳定。

骨保护素能够影响破骨细胞的功能途径有，骨保护素可以通过竞争抑制RANK与RANKL的结合，达到对破骨细胞的影响，还可以直接对破骨细胞的功能产生影响。Shiotani等^[40]通过研究证明了对破骨细胞的分化和重吸收的作用主要是RANKL-骨保护素系统。SahTlon等^[41]发现调控破骨细胞的活化和功能的其他细胞因子均是通过RANKL/RANK/骨保护素环路来实现的^[42]。Lacey等^[43]研究证明，骨保护素调节骨吸收的作用机制要复杂于阻止RANKL与RANK的结合机制，骨保护素通过促进蛋白酶抑制因子和蛋白酶的表达直接影响破骨细胞功能^[44]。骨保护素有利于保持成骨破骨的平衡，有利于维护牙周的生态平衡，防止骨吸收促进骨形成^[45]。有研究者在实验中对小鼠进行促进骨保护素表达，当骨保护素过度表达时，实验小鼠出现石骨症，在实验中对小鼠进行骨保护素的基因敲除，该实验小鼠出现骨质疏松的症状^[46]。

公柏娟等^[47]研究兔牙正畸过程中牙周膜内胰岛素样生长因子1的表达发现，牙移动过程中，移动牙齿的张力侧以骨生成为主，牙齿移动的压力侧以持续的骨吸收为主^[48]。通过大量的研究，骨保护素对破骨细胞作用第一可抑制破骨细胞前体细胞分化，破骨细胞内的破骨因子激活，第二能促进破骨细胞其凋亡^[49]。因此骨保护素-RANKL系一直被认为是骨改建中重要的调节因子。通过一些列的研究表明，骨保护素与成骨细胞，新骨形成的以及牙槽骨改建有着密切的关系，实验通过免疫组织化学染色来观察川芎嗪溶液对骨保护素的影响，从而探讨川芎嗪溶液对牙槽骨改建的作用。

在前期实验中证明川芎嗪能够有效地促进成骨细胞增殖，并且在质量浓度为10 mg/L成骨细胞增殖最快。在此次实验中为了能够更直观的理解川芎嗪对牙槽骨改建的作用机制采用了局部注射的方法，避免了灌胃的一些列作用。在第1周和第4周时骨保护素的阳性表达平均积分吸光度值，川芎嗪10 mg/L组分别为0.178、0.198均高于川芎嗪5 mg/L组与川芎嗪15 mg/L组，说明在细胞实验中川芎嗪的最佳质量浓度，在体外实验中同样能够促进骨保护素阳性表达达到最高值。说明川芎嗪与骨保护素成正相关，两者关系密切。

通过实验研究，骨保护素在张力侧更为重要。实验数据显示骨保护素灰度值高时，牙动复发百分比最低，这说明张力区骨改建加快，抑制了牙移动，作用机制可能是川芎嗪促进成骨细胞增殖，同时促进成骨细胞分泌骨保护素，加快新骨形成，抑制RANK与RANKL的结合从而抑制破骨细胞的产生，但具体机制还有待进一步探讨。

结论：实验将中药与正畸保持阶段结合在一起，并采取局部注射的方式使药物直接作用在牙移动复发的压力侧，经过实验证明川芎嗪在剂量为10 mg/L时最能有效抑制正畸复发。通过促进成骨细胞增殖来增加骨保护素从而调控破骨细胞，这可能是其加速牙周组织改建的分子机制。

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实验首次把川芎嗪与正畸牙齿保持和骨改建联系在一起，目前对它的药理作用机制的研究大多集中在其对心血管疾病的治疗，较少将其与抑制正畸复发联系在一起，国内外目前还没有实验证明川芎嗪 与正畸保持阶段有确切的关系。

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