淫羊藿苷促进骨髓间充质干细胞成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.001

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (24): 3501-3507.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.001

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淫羊藿苷促进骨髓间充质干细胞成骨分化

鲍远，黄俊明，靖兴志，李兴艳，董永辉，张津铭，郭风劲，陈安民

华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市 430030

出版日期:2016-06-10 发布日期:2016-06-10
通讯作者: 陈安民，博士，教授，主任医师，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市 430030
作者简介:鲍远，男，1986年生，浙江省杭州市人，汉族，在读博士，主要从事软骨再生修复及骨髓间充质干细胞的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171696，81472082)

Icariin promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Bao Yuan, Huang Jun-ming, Jing Xing-zhi, Li Xing-yan, Dong Yong-hui, Zhang Jin-ming, Guo Feng-jin, Chen An-min

Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Online:2016-06-10 Published:2016-06-10
Contact: Chen An-min, M.D., Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
About author:Bao Yuan, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171696 and 81472082

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
RUNX2：即runt相关转录因子2，是一种与成骨分化相关的转录因子，在成骨分化过程的早期即有表达。它与DNA的特定区域结合，并调控OCN、OSX等促成骨分化相关基因的转录活性。RUNX2缺陷小鼠膜内成骨和软骨内成骨过程均不能发生，说明它是成骨分化不可缺少的转录因子。
骨小梁和骨皮质的结构参数：骨体积密度(BV/TV)，即相对骨体积或相对骨体积分数；骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，即骨小梁的平均厚度；骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)，即给定长度内骨组织与非骨组织的交点数量；骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)，即骨小梁之间的髓腔平均宽度。

摘要
背景：传统中药淫羊藿应用于各类骨科疾病有着悠久的历史，其主要成分之一淫羊藿苷有多种生物学效应。
目的：探讨淫羊藿苷在体内及体外对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制。
方法：在体外存在或不存在成骨诱导培养的条件下，用淫羊藿苷作用于骨髓间充质干细胞，通过RT-PCR检测runx2、ocn和osx基因的表达情况，以及通过茜素红染色检测成骨细胞分泌的钙结节数量。用淫羊藿苷喂养大鼠(2 mg/d)5周后，进行MicroCT扫描并分析胫骨上段骨结构。
结果与结论：①无论是否存在成骨诱导培养条件，淫羊藿苷均能促进成骨分化相关基因的表达；②在成骨诱导培养时，淫羊藿苷能明显增加钙结节沉积；③动物实验表明淫羊藿苷能显著促进骨小梁的生成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-3592-9904(鲍远)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 淫羊藿苷, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, runt相关转录因子2, 骨钙素, 成骨细胞特异性转录因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Herba epimedii, a traditional Chinese medicine, has a long time in dealing with various orthopedic disorders. Icariin with many biological activites is one of the most important compositions of Herba epimedii.
OBJECTIVE: To investigate the effects of icariin on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and the underlying mechanisms.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were treated using icariin with or without osteogenic medium in vitro. Osteogenic differentiation markers, including runt-related transcription factor 2, osteocalcin and osterix, were detected by real time-qPCR. Alizarin red staining was used to measure calcium nodes generated by osteoblasts induced from bone marrow mesenchymal stem cells. The proximal tibia bone structure of rats fed with icariin (2 mg per day) for 5 weeks was detected and analyzed by MicroCT.
RESULTS AND CONCLUSION: Icariin was able to promote the expression of genes related to osteogenic differentiation in the absence or presence of osteogenic induction. Icariin could obviously increase the quantity of calcium nodes when mesenchymal stem cells were cultured in the osteogenic medium. The animal experiment showed that icariin improved formation of trabecular bone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Epimedium, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Osteocalcin, Core Binding Factor Alpha 1 Subunit, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

鲍远，黄俊明，靖兴志，李兴艳，董永辉，张津铭，郭风劲，陈安民. 淫羊藿苷促进骨髓间充质干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(24): 3501-3507.

Bao Yuan, Huang Jun-ming, Jing Xing-zhi, Li Xing-yan, Dong Yong-hui, Zhang Jin-ming, Guo Feng-jin, Chen An-min. Icariin promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(24): 3501-3507.

图/表（结果） 2

2.1 淫羊藿苷促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因的表达单纯用淫羊藿苷(10^-6mol/L)分别干预骨髓间充质干细胞3，5，7 d，结果显示runx2、ocn、osx基

因表达比对照组明显增加且随着作用时间的延长而逐渐增加(图1A)，说明淫羊藿苷具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的能力。

在成骨诱导培养条件下，用淫羊藿苷 (10^-6 mol/L)分别干预细胞3，5，7 d后发现runx2、ocn、osx基因表达明显高于对照组，且随着作用时间的延长而逐渐增加(图1B)，结果说明淫羊藿苷与成骨诱导培养基有协同促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。

2.2 淫羊藿苷促进骨髓间充质干细胞成骨诱导培养时的钙结节生成骨髓间充质干细胞单纯成骨诱导培养以及在成骨诱导培养时加入淫羊藿苷(10^-6 mol/L)干预，

诱导培养11 d后进行茜素红染色。结果显示，成骨诱导+淫羊藿苷组中钙结节的数量明显多于单纯成骨诱导组(图2)。证明淫羊藿苷与成骨诱导培养基在促进骨髓间充质干细胞成骨分化时具有协同效应。

2.3 动物实验结果以淫羊藿苷(2 mg/d)喂养大鼠5周后将其处死，取下胫骨并用MicroCT扫描并分析胫骨上段骨结构。结果显示：淫羊藿苷组大鼠胫骨的骨体积密度大于对照组，但经统计学分析，两者差异无显著性意义；淫羊藿苷组大鼠的骨小梁厚度及骨小梁数目明显大于对照组，与此同时，骨小梁间距明显小于对照组(图3A)。

胫骨干骺端石蜡切片组织化学染色显示，淫羊藿苷组大鼠的胫骨干骺端骨小梁数目明显多于对照组(图3B)，说明口服淫羊藿苷可明显促进骨小梁骨的生成，诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

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引言

骨髓间充质干细胞具备多向分化潜能，可以在体外诱导条件下向骨、软骨、脂肪等方向分化^[1]。在骨组织工程的种子细胞研究中，它已成为人们研究的热点。自体骨髓间充质干细胞移植或结合细胞支架移植已广泛应用于修复骨缺损、骨折不愈合、股骨头缺血性坏死等研究中^[2-4]。然而在体内骨髓间充质干细胞的分化方向很难被人为控制，因此移植的骨髓间充质干细胞向目的细胞分化的效率不高，导致干细胞治疗效果并不理想^[5]。为了提高局部骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的效率，寻找一种安全、有效的诱导因子至关重要。

淫羊藿苷(Icariin，ICA)是从中国传统中药淫羊藿中提取出来的黄酮类化合物，是淫羊藿的主要有效成分^[6]。大量研究证明，淫羊藿苷具有促进骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化，抑制破骨细胞分化成熟和抑制骨质疏松等作用^[7-9]。由于来源广泛，价格低廉以及毒副作用小等特点，淫羊藿苷在骨组织工程研究中的应用越来越广泛。研究表明，淫羊藿苷能明显增加骨质疏松模型大鼠的骨密度并促进其分泌骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2等成骨相关蛋白^[10-12]。淫羊藿苷能明显促进骨保护素缺陷小鼠的新骨形成，并促进RUNX2和骨钙蛋白的表达^[13]。然而，在正常动物体内淫羊藿苷能否促进骨组织形成以及骨密度增加的问题却鲜有人研究。为此，实验研究淫羊藿苷在体内及体外对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制，为其在骨组织工程治疗骨质缺损和骨折不愈合等方面提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机分组对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年10月在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。

1.3 材料 6周龄雄性SD大鼠16只(4只用于细胞培养，12只用于动物实验)，体质量约180 g，来源于华中科技大学同济医学院实验动物中心。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养脊椎脱臼法处死SD大鼠，在无菌条件下，取下胫骨和股骨，剔除附着在其上的肌肉、韧带和关节软骨，剪去两侧的干骺端暴露骨髓腔，用10 mL无菌注射器抽取含体积分数

淫羊藿苷促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化实验所用主要试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
淫羊藿苷	Sigma公司
胎牛血清、胰蛋白酶	Gibco公司
DMEM/F12	Hyclone公司
Trizol试剂	Invitrogen公司
总RNA提取试剂盒、RT-QPCR试剂盒	Azanno Biotehch 公司
反转录试剂盒	东洋纺(上海)生物科技有限公司
SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基、茜素红染液	赛业(广州)生物科技有限公司
Micro CT	SCANCO公司
实时荧光定量PCR仪	Bio-Rad公司

为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基反复冲洗骨髓腔。再将冲洗液转移到25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的细胞培养箱内培养。48 h后首次更换培养基，以后每隔1 d更换培养基。细胞融合度达到80%时，用0.25%胰酶消化后按1︰3的比例传代。按上述方法将细胞培养至第3代，以进行后续实验。

1.4.2 成骨诱导及茜素红染色取第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-1，接种于6孔板内，每孔1 mL细胞悬液，再加1 mL完全培养基，细胞融合度达到约80%时，用成骨诱导培养基以及含终浓度为10^-6 mol/L淫羊藿苷的成骨诱导培养基培养^[14]。每3 d换液1次，干预11 d后进行茜素红染色。染色步骤：弃去培养基，用4 ℃预冷PBS洗3遍，40 g/L多聚甲醛在室温下固定15 min，弃去多聚甲醛，PBS洗3遍，茜素红染色15 min，弃去染液，双蒸水洗2遍，最后在显微镜下观察。

1.4.3 RT-QPCR测定基因表达用浓度为10^-⁶mol/L的淫羊藿苷干预细胞3，5，7 d^[14]，以及在成骨诱导培养中用相同浓度的淫羊藿苷干预细胞3，5，7 d。总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，总RNA浓度由分光光度计测得。取1 μg各样本的RNA分别加入反转录试剂盒的反应体系，在反转录仪中进行反转录生成cDNA后，置于-20 ℃保存。反转录反应条件为：42 ℃，15 min；95 ℃，5 min；4 ℃，30 min。取样本cDNA进行实时荧光定量PCR，反应体系为10 μL，包括0.5 μL样本、4 μL无RNA酶水、0.5 μL引物和5 μL SYBR^® Green。反应程序为：步骤1，95 ℃预变性2 min；步骤2，95 ℃变性10 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，该步骤循环40次；步骤3，熔解曲线。

实时荧光定量PCR引物序列：
基因	引物序列	引物长度
GAPDH	上游(5’-3’): GGC AAG TTC AAC GGC ACA G 下游(5’-3’): CGC CAG TAG ACT CCA CGA CAT	19 bp 21 bp
runx2	上游(5’-3’): GCA CCC AGC CCA TAA TAG A 下游(5’-3’): TTG GAG CAA GGA GAA CCC	19 bp 18 bp
osx	上游(5’-3’): CCT CTC GAC CCG ACT GCA GAT C 下游(5’-3’): AGC TGC AAG CTC TCT GTA ACC ATG AC	22 bp 26 bp
ocn	上游(5’-3’): CAC TCC TCG CCC TAT TGG C 下游(5’-3’): CCC TCC TGC TTG GAC ACA AAG	19 bp 21 bp

1.4.4 动物实验 6周龄雄性SD大鼠随机分为淫羊藿苷组和对照组，每组6只。淫羊藿苷以1 g/L的质量浓度与水配置成混悬剂。通过灌胃的方式，给淫羊藿苷组大鼠每日喂养2 mL淫羊藿苷和水的混悬剂，对照组大鼠每日喂养等体积的水。

1.4.5 骨结构分析喂养5周后将其处死，应用MicroCT对大鼠胫骨上段进行扫描，通过MicroCT自带软件重建骨骼三维结构图像，并分析骨小梁和骨皮质的结构参数，包括：骨体积密度(BV/TV)，即相对骨体积或相对骨体积分数；骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，即骨小梁的平均厚度；骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)，即给定长度内骨组织与非骨组织的交点数量；骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)，即骨小梁之间的髓腔平均宽度。

1.4.6 组织化学染色切取胫骨上段，在40 g/L多聚甲醛中固定48 h，然后在10%的EDTA溶液中脱钙30 d，用乙醇脱水后再用石蜡包埋。蜡块用切片机切成约5 μm厚的薄片，贴到载玻片上。最后用苏木精和伊红染色。

1.5 主要观察指标 ①淫羊藿苷干预后runx2、osx、ocn基因的表达。②淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成骨诱导培养时钙结节形成的影响。③淫羊藿苷对大鼠胫骨近端骨小梁结构的影响。

1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计软件分析处理数据，统计方法为单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

淫羊藿是传统中医用来补肾阳、强筋骨的常用药物。现代医学研究发现，淫羊藿苷作为其主要有效成分之一，对人体的肌肉骨骼系统有广泛的生物学效应^[6]。这些效应包括：对抗骨质疏松、抑制破骨细胞分化成熟、促进成骨细胞和软骨细胞的增殖与分化、促进血管形成以及抗炎作用^[7^，^15-20]，其中诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用使淫羊藿苷在干细胞替代治疗、骨组织工程等方面具有广泛的应用前景。

研究结果显示，淫羊藿苷能上调runx2、ocn和osx基因的表达，且随着药物作用时间的延长，这些基因的

表达也逐渐升高。RUNX2是一种与成骨分化相关的关键转录因子，具有调节成骨基因表达的作用，在成骨分化过程的早期即有表达^[21]。OCN是由成骨细胞分泌的一种非胶原蛋白，参与骨组织基质形成和矿化过程，这种蛋白表达升高标志着骨组织的形成^[22-23]。OSX属于Sp基因家族成员，随着Runx2的表达而升高，对成骨分化过程中的重要特征蛋白的表达起调控作用^[24-25]。Nakashima等^[24]学者发现，OSX缺失鼠即使在RUNX2表达的情况下，它们的成骨分化也完全受到抑制。在成骨分化过程中，ocn和osx作为runx2的靶基因，有促进早期成骨分化标志表达的作用^[26-27]。因此，淫羊藿苷促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化是通过上调runx2、ocn和osx的表达来实现的。有文献报道，在缺乏地塞米松的成骨诱导培养基中，加入淫羊藿苷仍然可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，且诱导分化的效果甚至比完全的成骨诱导培养更好^[28]。而此研究结果显示，在完全的成骨诱导培养的条件下淫羊藿苷也能发挥明显的促进成骨分化的作用。在成骨诱导培养基和淫羊藿苷的共同作用下，runx2、ocn和osx基因表达比在单纯成骨诱导培养中更加明显，而且随着作用时间的延长两者的差异逐渐增加。此外，茜素红染色结果显示在诱导培养第11天即可出现明显的钙结节沉积，进一步说明淫羊藿苷具有明显促进成骨分化的作用，并且两者对骨髓间充质干细胞的成骨分化具有协同刺激作用。

在动物实验中，与正常的对照组大鼠相比，口服淫羊藿苷可以显著增加骨小梁数量以及减少骨小梁间距。该结果说明除了骨质疏松模型大鼠，淫羊藿苷还能对正常大鼠的骨组织形成产生明显的促进效果，为它在骨缺损的治疗中提供理论依据。骨组织工程支架是治疗骨缺损这一世界性难题的首选方法^[6]。良好的骨组织工程支架除了适合细胞存活以及促进细胞增殖外，还须具备促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。否则，支架内骨髓间充质干细胞的成骨分化效率低下会影响骨组织再生从而影响治疗效果。为了提高成骨分化效率，成骨诱导因子如骨形态发生蛋白被应用到骨组织工程支架中。骨形态发生蛋白属于转化因子β超家族成员，在骨组织工程研究中应用广泛^[29]。骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7已应用于临床研究，Garrison、Schmidmaier等学者应用骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7治疗开放性骨折及难自愈的骨缺损^[30-31]。尽管骨形态发生蛋白有显著促进成骨的作用，但由于价格昂贵以及在使用中出现的不良反应，导致其无法被进一步应用和推广^[32-33]。与骨形态发生蛋白相比，淫羊藿苷具有来源丰富、价格低廉以及无明显不良反应等特点^[34]，并且研究结果显示不论在体外还是体内，淫羊藿苷均具有促进成骨的作用，因此有希望在骨组织工程中广泛应用。然而，淫羊藿苷在局部使用的最佳有效浓度以及如何使淫羊藿苷在支架内缓慢释放等问题仍然需要进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Icariin promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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