含钙化层仿生组织工程骨支架对运动性踝关节损伤的修复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
组织工程支架材料：是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的不同组织，并根据具体替代组织具备的功能的材料。为了使种子细胞增殖和分化，需要提供一个由生物材料所构成的细胞支架，支架材料相当于人工细胞外基质。
软骨组织工程：是将软骨种子种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，然后再把该复合物植入软骨缺损处，生物材料自行降解的过程中，种植的细胞形成新的软骨来填充缺损。

背景：在体育运动或日常生活中，由于受力的突发性，尤其是受到非生理性剥离运动时造成的损伤比较普遍，如篮球、足球、橄榄球和武术运动中，该类运用均为对抗性、爆发性运动导致踝关节损伤发生率较高。常规方法虽然能改善患者症状，但是长期治疗欠佳，治疗后并发症发生率较高，容易引起二次伤害。

目的：制备含钙化层仿生组织工程骨支架，观察其对运动性踝关节损伤的修复效果。

方法：选取成都体育学院2014年12月至2015年12月诊治的80例武术运动踝关节损伤患者，随机分为对照组和含钙化层仿生组织工程骨支架组，每组40例。利用羊软骨制备脱细胞微粒悬液，加入预冷磨具中制备直径为8 mm的含钙化层骨软骨组织块，且利用冻干法和化学交联法能获得含钙化层仿生组织工程支架，含钙化层仿生组织工程骨支架组采用含钙化层仿生组织工程骨支架植入方法治疗，对照组给予药物治疗。

结果与结论：①制备的支架形态：骨软骨组织切取表面透明部分后，保留骨软骨钙化层，透明软骨呈白色，正常骨软骨之间存在钙化层，软骨下骨为松质骨；将制备的骨软骨钙化层脱细胞组织块进行苏木精-伊红染色，结果显示：骨软骨钙化层仅剩下细胞空巢，但是骨软骨块中软骨、骨软骨钙化层以及软骨下骨结构保持良好；②患者疼痛情况：两组患者治疗前疼痛评分差异无显著性意义(P > 0.05)；含钙化层仿生组织工程骨支架组治疗后1，4周疼痛评分显著低于对照组(P < 0.05)；③疗效：含钙化层仿生组织工程骨支架组治疗疗效率显著高于对照组(P < 0.05)。④结果证实，试验成功制备含钙化层仿生组织工程支架，将其用于修复运动性踝关节损伤效果较好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-2320-6901(陈会鹏)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 含钙化层仿生组织工程骨支架, 制备方法, 武术运动, 踝关节损伤, 治疗效果, 冻干法, 化学交联法, 疼痛评分, 生物化学, 组织学

Abstract:

BACKGROUND: In sports or in daily life, damage due to sudden power, especially due to non-physiological release, is commonly seen. For example, during basketball, soccer, rugby, or martial arts movement, oppositional and explosive movements result in a higher incidence of ankle injuries. While conventional methods can improve symptoms, the long-term efficacy is unsatisfactory, accompanied by a higher incidence of complications that are likely to cause secondary damage.

OBJECTIVE: To prepare a calcified biomimetic scaffold for bone tissue engineering and to observe the therapeutic effect of this scaffold on martial arts-induced ankle injuries.

METHODS: Eighty patients with martial arts-induced ankle injury were selected from Chengdu Sport Institute between December 2014 and December 2015. These patients were randomly assigned to control group with drug treatment and biomimetic scaffold group with calcified biomimetic scaffold implantation (n=40 per group). Acellular suspension prepared by goat cartilage was used to make cartilage tissue blocks with a calcified layer with a diameter of 8 mm in a prechilled abrasive apparatus. Then, the calcified biomimetic scaffold for bone tissue engineering was prepared using lyophilization and chemical crosslinking methods.

RESULTS AND CONCLUSION: Osteochondral tissues were partially hyalinized on the surface with the presence of osteochondral calcified layer. The hyalinized cartilage was white in color, the calcified layer existed between normal osteochondral tissues, and the subchondral bone was considered as the cancellous bone. Then the calcified layer was stained using hematoxylin-eosin. We found that cartilage cells in the calcified layer were basically removed, forming “empty nests” one by one. But the structure of bone cartilage in the tissue block, the calcified layer and the subchondral bone retained well. For pain assessment, visual analog scale scores were detected and showed no difference between two groups prior to treatment (P > 0.05), but became significantly higher in the biomimetic scaffold than the control group at 1 and 4 weeks after treatment (P < 0.05). Besides, the biomimetic scaffold exhibited better therapeutic efficacy than the drug treatment (P < 0.05). Overall, this study successfully prepare the calcified biomimetic scaffold for bone tissue engineering that is suitable for repair of sport-induced ankle injuries.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Biocompatible Materials, Ankle Joint

中图分类号:

R318

陈会鹏，刘玲娜. 含钙化层仿生组织工程骨支架对运动性踝关节损伤的修复[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(21): 3065-3070.

Chen Hui-peng, Liu Ling-na. A calcified biomimetic scaffold for bone tissue engineering in the treatment of martial arts-induced ankle injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(21): 3065-3070.

图/表（结果） 5

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引言

踝关节是人体的弹跳启动器，也是落地缓冲器，在人们日常运动、生活尤其是多项体育运动中均发挥了重要的作用^[1]。从结构组成来说：踝关节由胫骨、腓骨远端和距骨组成，胫骨下方的关节面、内踝关节面以及腓骨外踝关节面则又共同组成了关节窝，胫骨下段底部与内踩关节面相互连接^[2-3]。武术运动属于是一项剧烈运动，身体在弹跳、下落时需要保持身体的平衡，容易引起骨软骨损伤，且伴有不同成都的机械应力改变，导致足前外侧着地、内翻，引起踝关节损伤，患肢功能障碍，生活质量下降^[4-5]。

人体关节软骨主要由软骨、软骨下骨及之间的钙化层组成。关节软骨基本无血液、淋巴及神经，仅包含单一的软骨细胞，导致关节软骨自身修复能力相对较差。关节软骨峡谷主要对人体关节软骨起到支持作用，软骨下骨替代物由于血管化不足，难以将其进行修复，大块软骨下骨缺损将明显影响其支持效果。同时，骨软骨之间的钙化层包括深层透明软骨、潮线、钙化软骨、黏合线及上层软骨下骨，其结构相对微细，难以在体外进行构建，影响机体生理功能。常规方法虽然能帮助患者修复，但是长期修复效果欠佳，预后较差，难以保证踝关节恢复到损伤前状态^[6]。

理想的骨代替物必须具备以下特征：①具备骨传导性，符合人体骨解剖生理结构^[7-8]；②能与人体相互融合，避免生物排斥，保证良好的组织生物相容性；③能分泌细胞外基质，在机体特定条件下转化为成骨细胞^[9-10]。④具备促进新骨成长的细胞生长因子^[11]。含钙化层仿生组织工程骨支架是一种理想的多孔生物支架，该支架含有多孔软骨支架和深层透明软骨、黏合线等生理骨软骨钙化层和脱细胞软骨结构，但是对于含钙化层仿生组织工程骨支架的制备方法及在武术运动踝关节损伤中的修复尚缺乏报道^[12-13]。

文章选取成都体育学院2014年12月至2015年12月进行诊治的80例武术运动踝关节损伤患者资料进行分析，研究含钙化层仿生组织工程骨支架的制备方法，探讨含钙化层仿生组织工程骨支架在武术运动踝关节损伤后效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照调查分析。

1.2 时间及地点于2014年12月至2015年12月成都体育学院完成。

1.3 对象选取成都体育学院2014年12月至2015年12月进行的诊治的80例武术运动踝关节损伤患者资料进行分析，随机分为对照组和含钙化层仿生组织工程骨支架组各40例。

纳入标准：①入选患者均符合《中医病症诊断疗效标准》中关于运动踝关节损伤临床诊断标准^[14-15]。②年龄≥15岁。③试验经过成都体育学院伦理委员会同意批准。

排除标准：①排除不符合临床诊断标准者。②排除合并其他类型骨折或脱位者。③排除不能顺利完成试验者或拒绝参加试验者。

患者及家属对治疗方法及护理措施等完全知晓，且自愿签署知情同意书。

1.4 方法

1.4.1 含钙化层仿生组织工程骨支架的制备 ①含钙化层软骨片脱细胞制备：在无菌超净台条件下，采用新鲜羊股骨踝部制备直径为8 mm的骨软骨组织块，并用手术刀切片切除部分透明软骨，在游标卡尺下测量100 μm为宜。用PBS(美国Gibco公司)冲洗后置入含有蛋白酶抑制剂的Tris-HCl中，离心3 min，速度为7 000 r/min^[16-17]。将获得的软骨微粒中加入Tris-HCl缓冲液，在横温震荡机(美国Savat公司)上震荡24 h，去除细胞成分后进行7 min离心，速度为7 000 r/min。采用PBS进行3次冲洗，并加入消化酶液进行24 h消化，离心冲洗后放入4 ℃冰箱中备用^[18-19]。②含钙化层软骨片脱细胞支架构建：将制备的含钙化层软骨片注入预冷磨具中，放入-20 ℃冷冻 24 h后取出备用。③软骨脱细胞基质来源支架交联：将获得的支架浸泡在体积分数40%的乙醇溶液中，采用 48 mmol/L EDAC以及6 mmol/L NHS(美国Sigma公司)混合水溶液进行2 h交联，采用PBS(美国Gibco公司)冲洗3次后冷冻干^[20-21]。

1.4.2 治疗方法两组患者入院后早期遵循运动伤害的PRICE原则，包括：保护、休息、冷敷、压迫以及抬高。

对照组给予药物治疗方法。根据患者损伤情况给予中药药敷，药物包括：熟地、肉苁蓉各20 g，巴戟天 15 g，杜仲12 g，骨碎补12 g，伸筋草15 g，威灵仙、十大功劳各12 g，川芎15 g，川断15 g，红花15 g，姜活10 g，制川乌10 g，熟附子6 g，鸡血藤15 g，细辛4 g，血竭10 g，将药物与体积分数90%乙醇浸泡2周，每日治疗1次，每次30 min，连续治疗4周^[22-23]。

含钙化层仿生组织工程骨支架组采用含钙化层仿生组织工程骨支架植入方法治疗：患者在局部麻醉下行手术治疗，手术过程中根据损伤情况植入含钙化层仿生组织工程骨支架。

治疗后根据两组患者恢复情况给予相应的功能锻炼，促进损伤早期恢复^[24-25]。

1.4.3 疗效标准显效：患者关节肿胀、疼痛和活动不便等临床症状消失，踝关节功能恢复正常；好转：患者临床症状得到改善，踝关节功能有所提升；无效：患者病情变化不明显或病情加重^[26]。

1.5 主要观察指标观察含钙化层仿生组织工程骨支架大体，将软骨脱细胞基质浆均匀的涂抹在载玻片上，在显微镜下观察含钙化层仿生组织工程骨支架结构。

观察骨软骨钙化层脱细胞组织块苏木精-伊红染色结果：①切片准备。软骨脱细胞微粒离心沉淀后在体积分数10%中性甲醛固定12 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规包埋，5 μm切片；②抹片制备。将软骨脱细胞将300 μL涂抹在载玻片上，自然风干，并浸入苏木精染色5-10 min，采用显微镜下观察。

观察两组患者治疗治疗前、治疗后1周以及治疗后4周疼痛评分(总分10分，得分越高，疼痛越明显)^[27]。

对两组患者进行1-12个月随访，观察统计两组患者临床治疗疗效率。

1.6 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 18.0软件进行数据处理，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析和LSD检测。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

流行病学调查显示，无论是成人还是青少年踝关节损伤发生率均比较高^[28-29]。体育运动中踝关节损伤严重影响运动参与者的运动技术水平提高，严重者甚至引起残疾等，影响武术健康。武术运动损伤相对较多，且常见的损伤主要以踝关节扭伤为主，患者主要以疼痛、活动不便等为主^[30-31]。同时，踝关节是人体重要的负重运动关节，也是促进人体运动的部位。武术属于是一种特殊的运动方式，该方式主要以爆发力为主，容易导致武术运动员发生突发性、复杂性损伤。常规方法主要以药物治疗，如中药敷和推拿等，这些方法虽然能改善患者症状，但是长期疗效欠佳，治疗预后较差，难以短时间内缓解患者疼痛^[32]。

武术运动踝关节损伤中可以选择或试验的方法主要包括关节镜下手术治疗以及微骨折技术。关节镜下肢体骨软骨转移以及异体骨软骨转移包含或不包含细胞因子合成支架植入，尽管这些方法都是运动踝关节损伤可选择的方案，但是总体修复效果难以达到预期目标^[33-34]。目前，对骨软骨复合构建方案包括：①单纯骨支架。通过骨支架再生骨软骨。②分开构建骨软骨以及支架，待二者形成后将其融合在一起。③一体构建骨软骨支架。试验中主要采用第2种构建方法，采用生理骨软骨钙化层脱细胞方法结合胶原交联方法构建骨软骨支架，从而能够获得比较完成的骨软骨钙化层^[35-36]。试验显示，骨软骨组织切取表面透明部分后，保留骨软骨钙化层，透明软骨呈白色，正常骨软骨之间存在钙化层，软骨下骨为松质骨。

目前，对软骨组织工程关于天然材料的研究有：胶原、透明质酸、壳聚糖、纤维蛋白和人工合成多肽等，天然材料包括突出的优点是生物相容性好，结构成分与细胞外基质相似，适合种子细胞的生长、增殖及分化，对细胞的形态、表型和细胞的运动具备生理作用。研究中获得的含钙化层仿生组织工程支架虽然钙化层相对比较薄，但是仍具备重要的生理功能，能够支撑、隔离、缓冲应力，并且能维持细胞的微环境^[37]：①含钙化层仿生组织工程支架植入后软骨和软骨能够根据骨软骨钙化层紧密联系，并且可以抑制软骨向外侧张力，避免软骨受力后引起的裂纹，能减轻患者疼痛，促进机体恢复^[38]。试验结果显示，试验组治疗后1，4周疼痛评分显著低于对照组。②从软骨到骨组织，支架的机械性能也从软到硬逐渐过渡，人体在受外力后能分散一部分机械应力，钙化层能充当转换区，不会导致踝关节受力而引起组织结构破坏^[39]；③含钙化层仿生组织工程支架植入机体后成骨区域氧、营养含量相对比较丰富，再加上软骨区域无血管及神经淋巴结等，从而能形成稳定的微坏境，更加利于机体踝关节的恢复。试验显示，含钙化层仿生组织工程骨支架组疗效率显著高于对照组。④支架植入后骨软骨连接区和不同的组织之间能相互胶合，并进行相应的营养物质交换，能帮助受损的踝关节快速恢复，提高临床治疗效果^[40]。

综上所述，采用天然羊软骨离心后制备脱细胞微粒悬液能制备直径为8 mm的含骨软骨钙化层的骨软骨组织块，且利用冻干法和化学交联法能获得含钙化层仿生组织工程支架，将其运用与武术运动踝关节损伤效果理想，能促进关节功能恢复，具有较高的临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程