3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯负载人骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (21): 3057-3064.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.003

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3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯负载人骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用

张俊标^1，2，3，何志旭^2，4，叶川^2，5，王永^3，6，王梅⁷，刘琴^2，3，杨龙²，李靖²，马敏先^3，6

¹贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学，²细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室，³口腔医学院，⁴儿科教研室，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院，⁵骨科，⁶口腔科，贵州省贵阳市 550004；⁷贵阳市口腔医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2016-03-09 出版日期:2016-05-20 发布日期:2016-05-20
通讯作者: 马敏先，副主任医师，贵州医科大学附属医院口腔修复科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:张俊标，男，1990年生，贵州省贵阳市人，汉族，贵州医科大学口腔修复学在读硕士，主要从事干细胞与组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360232)；贵州省科学技术联合基金项目(黔科合LG字[2012]002号)；贵阳市科技计划项目(筑科合同[20141001]号)

Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) scaffolds carrying human bone marrow mesenchymal stem cells for bone tissue engineering

Zhang Jun-biao^{1, 2, 3}, He Zhi-xu^{2, 4}, Ye Chuan^{2, 5}, Wang Yong^{3, 6}, Wang Mei⁷, Liu Qin^{2, 3}, Yang Long², Li Jing², Ma Min-xian^{3, 6}

¹Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ²National and Guizhou Joint Engineering Laboratory for Cell Engineering and Biomedicine Technique,³School of Stomatology, ⁴Department of Pediatrics, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ⁵Department of Orthopedics,⁶Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ⁷Guiyang Stomatological Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2016-03-09 Online:2016-05-20 Published:2016-05-20
Contact: Ma Min-xian, Associate chief physician, School of Stomatology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Zhang Jun-biao, Studying for master’s degree, National and Guizhou Joint Engineering Laboratory for Cell Engineering and Biomedicine Technique, School of Stomatology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360232; the Science and Technology Joint Foundation of Guizhou, No. 2012002; the Science and Technology Project of Guiyang, No. 20141001.

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

骨组织工程：利用组织工程学原理和方法能够再生骨组织，为骨缺损的修复提供了一种新的思路和方法。骨组织工程原理是将具有活力的种子细胞采用不同的构建技术负载在可供细胞黏附生长的可吸收支架材料上异位或原位植入体内。随时间的增加，支架材料逐步降解吸收，种子细胞沿支架材料生长，逐渐形成成熟的骨组织以修复骨缺损。

3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯：是聚羟基烷酸酯家族中第3代生物可降解材料，它由多种微生物细菌合成，具有良好的生物降解性和生物相容性。3-羟基丁酸酯的含量决定了材料的强度和硬度，表现为脆性，4-羟基丁酸酯的含量用于改变材料的韧性，因此通过调节3-羟基丁酸酯、4-羟基丁酸酯的含量可以制备出从弹性材料到刚性材料不同特性的产品，应用于组织工程研究。

背景：3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)是近年来受到重视的聚羟基脂肪酸酯族组织工程支架材料，具有良好的生物相容性和细胞黏附性以及优良的力学性能，在组织工程研究领域显示出良好的应用前景。

目的：验证P3HB4HB支架材料与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性及体内异位成骨能力。

方法：①将第5代人骨髓间充质干细胞种植于P3HB4HB三维支架上使用成骨诱导液培养5 d，采用吖啶橙荧光染色及扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况；②将第5代人骨髓间充质干细胞种植于P3HB4HB支架上体外使用成骨诱导液培养为实验组，不使用成骨诱导液培养为对照组，两组培养14 d后分别植入裸鼠皮下，植入后16周时取出行苏木精-伊红染色，Vonkossa染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色检测植入物体内异位成骨情况。

结果与结论：①吖啶橙荧光染色显示细胞黏附于支架材料表面，生长良好；②扫描电镜观察成骨诱导的人骨髓间充质干细胞在P3HB4HB支架上生长良好，细胞产生丰富的细胞外基质；③植入16周时大体观形成骨样组织，Vonkossa染色、Ⅰ型胶原染色呈阳性，苏木精-伊红染色见较多成骨细胞，有典型的骨陷窝出现，对照组无骨组织形成；④研究表明P3HB4HB适合作为骨组织工程支架材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-1177-6528(马敏先)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 生物相容性, 人骨髓间充质干细胞, 3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯, 异位成骨, 组织工程支架, 种子细胞, 体内实验, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: As a noticeable tissue engineering material of polyhydroxyalkanoates family, poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)(P3HB4HB)exhibits good biocompatibility, adhesion and mechanical properties, presenting a extensive application future in tissue-engineered research.

OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility in vitro and ectopic osteogenic differentiation in vivo of P3HB4HB and human bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Passage 5 human bone marrow mesenchymal stem cells transplanted onto the three-dimensional P3HB4HB scaffold were incubated with osteogenic induction medium (test group) or with no osteogenic induction(control group), respectively. After 5-day incubation, the cell growth was assessed by acridine orange staining and scanning electron microscopy; after14-day incubation, both kinds of cell-scaffold composites were subcutaneously implanted into the nude mice. At 16 weeks after implantation, the cell-scaffold composites were removed to observe ectopic osteogenic differentiation in vivo using hematoxylin-eosin staining, von Kossa staining and collagen type I immunohistochemical staining.

RESULTS AND CONCLUSION: Acridine orange staining showed that cells adhered well on the surface of the scaffold; under the scanning electron microscope, induced cells grew well on the P3HB4HB scaffold and produced abundant extracellular matrixes. In addition, at 16 weeks after implantation, there were osteoid tissues in the test group, positive for von Kossa staining as well as collagen type I immunohistochemical staining; furthermore, hematoxylin-eosin staining showed numerous osteoblasts and bone lacunas. In contrast, no bone tissues appeared in the control group. To conclude, P3HB4HB is a suitable material for bone tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, 3-Hydroxybutyric Acid, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张俊标，何志旭，叶川，王永，王梅，刘琴，杨龙，李靖，马敏先. 3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯负载人骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(21): 3057-3064.

Zhang Jun-biao, He Zhi-xu, Ye Chuan, Wang Yong, Wang Mei, Liu Qin, Yang Long, Li Jing, Ma Min-xian. Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) scaffolds carrying human bone marrow mesenchymal stem cells for bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(21): 3057-3064.

图/表（结果） 9

2.1 人骨髓间充质干细胞的原代、传代培养培养2 d，大部分细胞贴壁，细胞开始生长、展开，随培养时间的增加细胞数目逐渐增多，原代培养7 d，细胞呈形态较一致的长梭形并开始融合，细胞成聚集性生长(图1A)。传代培养六七天细胞融合，聚集排列，方向一致，多为螺旋状、漩涡状，生长状况良好(图1B)。

2.2 向成骨细胞诱导分化鉴定体外成骨诱导14 d，BCIP/NBT碱性磷酸酶染色呈阳性，碱性磷酸酶活性部位位于细胞胞质中，成蓝紫色表达。茜素红染色呈阳性，出现圆形的矿化结节呈红色。Ⅰ型胶原免疫组化染色阳性，胞膜及细胞外基质呈棕黄色，提示局部有Ⅰ型胶原合成和分泌，见图2。

2.3 支架大体观、光镜及扫描电镜观察 P3HB4HB支架材料显示为白色，表面及内部为蜂窝状，质地韧，扫描电镜观察显示孔隙直径为20-200 μm，将第5代人骨髓间充质干细胞种植于P3HB4HB支架上使用成骨诱导液培养5 d时，扫描电镜观察向成骨分化的细胞黏附于支架材料上，呈多角形，细胞胞体丰满有伪足伸出，见较多细胞外基质分泌覆盖在支架材料表面，见图3，4。

2.4 吖啶橙荧光染色结果人骨髓间充质干细胞滴加到P3HB4HB支架上体外成骨诱导培养5 d，吖啶橙染色显示活细胞DNA为绿色荧光，支架材料较厚部分难以区分细胞与支架，在支架材料较薄的部分可见大量细胞黏附生长，细胞均匀分散于支架材料表面，见图5。

2.5 植入物体内组织学染色评价实验组植入裸鼠皮下16周取出，大体观显示为黄红色，质地较硬，表面见大量微小血管形成，见图6A；苏木精-伊红染色见编织样骨组织形成，组织结构清楚，大量骨小梁形成，其内见较多骨细胞，有骨陷窝形成，见图7A；Vonkossa染色显示钙盐沉积部位成黑色，见图8A；Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性，细胞外基质有大量的棕黄色异染区，见图9A。对照组植入后16周取出，大体观显示植入物呈灰白色，质地韧，见图6B；苏木精-伊红染色未见骨组织形成，见少量细胞存在，见图7B；Vonkossa染色(图8B)和Ⅰ型胶原免疫组化染色(图9B)阴性。

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引言

人类的预期寿命随医疗的进步不断增加，与年龄增长相关的疾病也在不断增长，由于创伤、疾病、年龄增长等原因引起的骨骼疾病发病率不断增加，同时也显著提高了社会经济成本，因此需要新的、更可靠的促进骨再生的方法^[1]。骨组织工程已被认为是修复骨缺损最有希望的方法而成为研究的热点^[2]。骨组织工程学是以种子细胞、支架材料和其他生物活性成分为核心框架，模拟骨组织的自然发生过程，从组织学水平恢复骨组织的形态、结构和功能的完整性。理想的骨组织工程支架材料要求材料降解与骨组织再生同步，而且支架材料与宿主骨组织的力学性能相匹配^[3]。组织工程研究的原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，接种于载体或者组织工程支架上，放置到生物反应器中接受化学和机械刺激形成细胞/支架复合物^[4]，将细胞/支架复合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。

自体成骨细胞和骨髓间充质干细胞都可以作为骨组织工程的种子细胞，然而成骨细胞存在来源有限，体外扩增能力有限的弊端，骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，具有强大的增殖能力，能分化成为多种间充质组织，其经体外诱导培养为成骨细胞后可作为自体骨组织修复的来源，无免疫排斥反应，是理想的骨组织工程种子细胞^[5-7]。

人工骨替代材料已成为生物材料领域的研究热点^[8]，具有良好的生物相容性和生物降解性是作为组织工程支架材料的必备条件^[9-12]。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类来源于微生物的聚合物，具有良好的生物相容性和生物降解性^[13]。目前研究最广泛的是高结晶度的3-羟基丁酸聚合物，它是一种可快速处理的聚酯，如与4-羟基丁酸酯形成3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)，与3-羟基戊酸酯形成3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯[P(3HB-co-3HV)]或者与3-羟基己酸脂形成3-羟基丁酸酯-3-羟基己酸脂(PHBHHx)^[14]。马敏先等^[15]将鼠骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞后接种至PHBHHx支架上，扫描电镜见材料上的成骨细胞融合成片状，边缘有许多不规则的突起细胞，伸出多个伪足固定于孔隙之间，部分细胞间以突起相互连接；MTT实验证实PHBHHx支架上的细胞生长、增殖良好。P3HB4HB是聚羟基脂肪酸酯中降解速度最快的生物材料，比同族的其他材料更易于加工，它可能有望取代传统非生物降解材料，已被应用到组织工程领域^[16-17]。除此之外，还应用于如心血管系统、伤口愈合、骨科、负载药物等^[18-19]。研究表明P3HB4HB具有良好的表面特性，能促进细胞附着、增殖和分化，且具有良好的机械性能^[20-21]。实验将人骨髓间充质干细胞接种于P3HB4HB支架，并经体外成骨诱导液培养，观察细胞在P3HB4HB上的生长情况，然后植入裸鼠皮下，观察细胞支架复合物的体内成骨情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

http://www.crter.org/CN/folder/folder1977.shtml

材料方法

1.1 设计体外观察性实验及动物体内实验。

1.2 时间及地点实验于2014年3月至2015年10月在贵州医科大学组织工程与干细胞中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 8周龄雄性裸鼠8只，体质量18-23 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。

1.3.2 试剂和仪器 P3HB4HB支架材料由清华大学高分子所提供；DMEM培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠购于美国Sigma公司；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒购于南京建成生物工程研究所；茜素红购于美国Solarbio公司；Vonkossa染色试剂盒购于上海杰美基因医药科技有限公司；Ⅰ型胶原免疫组化染色试剂盒购于武汉博士德生物有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞的分离和培养抽取骨折患者的髂骨骨髓(所有供者对实验知情同意^[22])，放置于含肝素离心管中，按照1∶1加入低糖DMEM混匀，按 1 000 r/min离心5 min(离心半径为13.5 cm)，去除上清液，加入含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的低糖DMEM培养基重悬细胞，放置于75 cm²培养瓶内，在37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下培养，每2 d或3 d更换1次培养基。当细胞生长融合达到90%时，加入0.05%胰蛋白酶和0.53 mmol/L EDTA混合液进行传代培养。

1.4.2 人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化鉴定选择第5代人骨髓间充质干细胞，以细胞密度为3×10⁵/孔接种至6孔板中的细胞爬片上，培养1 d后更换为成骨诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、1×10^-8 mol/L 地塞米松、 50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的高糖DMEM)，诱导培养14 d后行碱性磷酸酶(BCIP/NBT)染色、茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色。

碱性磷酸酶(BCIP/NBT)染色：将细胞爬片取出，TBS清洗4次(每次5 min)，按1 mL蒸馏水加1滴BCIP/NBT×20倍浓缩液和1滴TRIS×20倍浓缩液(pH9.4)混匀后滴加于爬片上，常温下避光孵育10-30 min，蒸馏水充分清洗终止染色，封固、观察。

茜素红染色：取细胞爬片，PBS清洗3次，体积分数为95%乙醇固定30 min，加入0.1%茜素红染液37 ℃ 下避光孵育30-60 min，蒸馏水充分清洗，封固、观察。 Ⅰ型胶原免疫组化染色：取细胞爬片，PBS漂洗2次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS缓慢冲洗2 min×3次，体积分数为3%双氧水室温孵育5-10 min以灭活内源性酶，蒸馏水缓慢冲洗2 min×3次，滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min，滴加1∶100稀释的Ⅰ型胶原兔抗鼠多克隆一抗(兔IgG)，4 ℃孵育过夜，PBS缓慢冲洗 2 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，20-37 ℃ 20 min，PBS缓慢冲洗2 min×3次，滴加试剂SABC， 37 ℃孵育20 min，PBS缓慢冲洗5 min×4次，DAB显色，室温避光显色，干燥，封固。

1.4.3 P3HB4HB支架材料大体观、光镜及扫描电镜观察将P3HB4HB支架材料裁剪为1 cm×1 cm正方形，干燥后喷金，样品用扫描电子显微镜观察；将500 μL人骨髓间充质干细胞滴加在P3HB4HB支架材料上(滴加细胞数量为1×10⁷个，细胞浓度为2×10¹⁰ L^-1)，体外使用成骨诱导液诱导培养5 d，吸出培养基，PBS清洗2次，使用4%戊二醛在4 ℃条件下固定3 h，PBS清洗3次，每次5 min，梯度乙醇脱水，干燥，喷金，样品用扫描电子显微镜观察。

1.4.4 吖啶橙(acridine orange，AO)荧光染色将人骨髓间充质干细胞滴加在P3HB4HB支架材料上，体外使用成骨诱导液诱导培养5 d后，吸出培养基，PBS清洗2遍，采用体积分数为95%乙醇室温下固定30 min，滤纸吸干，加入1%醋酸作用30 s，PBS清洗1 min，加入0.01%AO染液染色5 min，PBS清洗1 min，用0.1 mol/L CaCl₂分色2 min，PBS清洗3次，每次数秒，使用荧光显微镜观察(激发波长405 nm的滤光片)。

1.4.5 动物实验将人骨髓间充质干细胞滴加于P3HB4HB支架材料上使用成骨诱导液体外成骨诱导培养14 d为实验组，不使用成骨诱导液体外培养14 d为对照组，分别植入裸鼠背部皮下，每组4只。在植入后16周时取出植入物标本，体积分数为10%甲醛溶液固定，行苏木精-伊红染色、Vonkossa染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色。

苏木精-伊红染色：切片常规脱蜡水化，苏木精液浸染5-10 min，流水缓慢冲洗，0.5%盐酸乙醇分化10 s，流水缓慢冲洗，0.5%氨水返蓝，流水缓慢冲洗，伊红液浸染1 min，流水缓慢冲洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，镜下观察。

Vonkossa染色：切片常规脱蜡水化，滴加染色液铺满样品表面，室温下置于太阳光下直射60 min，清理液孵育2 min，干燥、封固、观察。

Ⅰ型胶原免疫组化染色：切片常规脱蜡水化，体积分数为3%H₂O₂去离子水孵育10 min，PBS冲洗2 min×3次，滴加Ⅰ型胶原兔抗鼠多克隆一抗(兔IgG)，4 ℃过夜，PBS冲洗2 min×3次，滴加HRP标记的抗体混合物，室温孵育30 min，PBS冲洗2 min×3次，DAB溶液显色2-10 min，自来水充分冲洗、苏木精复染、脱水、透明、封固。

1.5 主要观察指标 ①细胞在支架材料上经过成骨诱导液培养后的生长情况。②细胞支架复合物体内异位成骨情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

骨缺损修复一直是临床治疗过程的一个挑战，目前采用的自体骨移植能够提供骨组织再生的三大组成部分(成骨细胞、生长因子及支架)且无免疫排斥反应，是骨缺损修复的金标准，但其缺点是来源有限，同时造成供区伤害；同种异体骨或异种骨移植是一种可行的替代治疗方法，但有传播疾病的风险并可能导致周围组织愈合延迟等^[23-27]。骨组织工程是治疗骨缺损的一种新兴的治疗途径^[28]。以支架材料作为种子细胞的载体，将二者复合植入体内期望达到骨组织的再生和修复。Ye等^[29]将人脂肪间充质干细胞负载于PHB/PHBHHx支架，发现细胞在支架材料上生长良好，具有良好的生物相容性，细胞在支架上进行体外成软骨诱导14 d后植入裸鼠背部可异位构建组织工程软骨。 P3HB4HB作为聚羟基烷酸酯族的第3代材料，不仅具有聚羟基烷酸酯族材料的优点，在体内降解时产生二氧化碳和水^[30]，且不产生酸性代谢产物而避免出现体内无菌性炎症，同时可以通过改变3HB和4HB含量的变化来调节材料的刚性和韧性，满足不同组织器官的组织工程支架要求^[31]。Siew等^[32]研究通过致畸实验和致突变实验证实P3HB4HB的溶解产物不会引起遗传毒性，具有良好的生物相容性，是一种有潜力的生物材料。Rao等^[33]研究显示将P3HB4HB与维生素E混合、与胶原蛋白混合或三者混合来提高其生物性能，将小鼠成纤维细胞接种于支架材料上，通过增殖速率和细胞形态观察可见P3HB4HB混合维生素E和胶原蛋白具有最好的生物相容性。Xu等^[34]将神经干细胞分别负载于聚羟基烷酸酯族支架材料和聚乳酸材料研究细胞在不同材料上的生理活动，通过扫描电镜显示各组材料上的细胞均能良好生长。细胞在材料上进行体外培养10 d，通过CCK-8测试表明P3HB4HB和PHBHHx两组材料细胞活力比其他材料高，表明P3HB4HB和PHBHHx具有良好的生物相容性。2007年，Tepha研究的由P3HB4HB制成的手术缝合线已获得美国FDA的批准。P3HB4HB通过调节4HB的含量以改变材料的韧性，使其基础研究更多的应用于组织血管工程及软骨组织工程^[35]，而在骨组织工程方面目前报道较少。组织工程支架材料应该是多孔结构，这种结构可以使更高密度的细胞接种于支架材料上，通过支架材料提供良好的机械稳定性和大量连通的网格结构，促进细胞长入到支架内部^[36]。在此项实验中，扫描电镜观察支架材料为多孔蜂窝状结构，孔隙直径20-200 μm，孔隙大小不均匀，多孔状的结构增大了材料的比表面积，细胞可以黏附于孔隙内部及表面，使相同接种面积上可以接种更多的种子细胞，大量孔隙结构之间相互连通，细胞及营养物质能渗透进入支架材料内部，增加细胞接种率的同时，可以促进细胞新陈代谢以及摄取外界营养物质。人骨髓间充质干细胞接种于支架材料后使用成骨诱导液培养第5天，细胞形态由长梭形变为多角形，产生较多的细胞外基质，表明人骨髓间充质干细胞在P3HB4HB支架材料上可以正常生长，在体外成骨诱导培养后，人骨髓间充质干细胞仍然可以向成骨细胞方向分化。吖啶橙荧光染色可见，大量细胞附着于支架材料表面及内部，也证实了人骨髓间充质干细胞接种于P3HB4HB上进行体外成骨诱导时，并不会影响成骨诱导过程中细胞的黏附和生长。在体内实验中，大体观见实验组为黄红色，质地硬，表面见较多微血管形成，苏木精-伊红染色见较多骨陷窝，有微血管的生成。正常的骨组织中由70%的无机磷酸钙结晶和30%的胶原纤维组成^[37]。骨组织的无机成分主要是钙盐沉积形成，Von kossa染色证实，实验组出现钙盐沉积，表明细胞支架复合物在裸鼠皮下随时间的增加出现钙盐沉积，向形成骨组织方向发展。骨组织基质主要由90% Ⅰ型胶原和少量的Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ型胶原组成，胶原的主要作用为保持住骨组织有机支架的结构^[38]。实验组免疫组化显示Ⅰ型胶原为棕黄色，呈阳性表达，提示细胞支架复合物在体内有Ⅰ型胶原的局部合成和分泌，形成骨组织的有机成分。然而，单一的材料充当骨组织支架，并不能同时满足理想骨支架所有的性能要求。例如材料的降解速率应该与骨组织形成速率相匹配^[39]，通过改变材料与细胞接触的界面将有利于植入材料与骨组织之间的结合，研究发现支架材料表面粗糙以及晶体颗粒更加细化将有利于细胞和蛋白的黏附^[40-41]。

实验通过体外细胞生物相容性检测及体内成骨研究，初步异位构建出组织工程骨，这项研究表明P3HB4HB可以成为骨组织工程支架材料。在未来的研究中，将利用P3HB4HB在有机溶剂中良好的溶解性，结合天然生物材料及骨相关生长因子，制备更加符合骨组织工程要求的组织工程支架，探讨其体外及体内的成骨能力。

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3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯负载人骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用

Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) scaffolds carrying human bone marrow mesenchymal stem cells for bone tissue engineering

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