可溶性血管内皮生长因子受体1对动脉粥样硬化斑块的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

动脉粥样硬化：是冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。

可溶性血管内皮生长因子受体1：是血管内皮生长因子受体1的胞外部分，其产生机制之一是血管内皮生长因子受体1转录产物经不同的剪接形成的，另一机制可能是由于跨膜受体在蛋白水解酶的作用下将胞外部分水解脱落形成。体外实验表明，可溶性血管内皮生长因子受体1能够与血管内皮生长因子结合，中和血浆中血管内皮生长因子，减少其与膜表面受体的结合，同时，可溶性血管内皮生长因子受体1还能够与与膜受体结合形成异源二聚体，阻断血管内皮生长因子介导的受体酪氨酸磷酸化及激活下游的信号转导途径而抑制血管内皮生长因子的激活。因此，可溶性血管内皮生长因子受体1可以作为血管内皮生长因子受体拮抗剂，阻断血管内皮生长因子诱导的细胞增殖和迁移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0003-2637-7036(周仪华)

关键词: 实验动物, 心肺损伤与修复动物模型, 可溶性血管内皮生长因子受体1, 动脉粥样硬化, 斑块, 新生血管, 免疫组化, 免疫印迹, 质粒, 基因转染

Abstract:

BACKGROUND: Angiogenesis in atherosclerotic plaque occurred on the basis of atherosclerotic lesions, and the new formed blood vessels promoted the development of angiogenesis. Soluble vascular endothelial growth factor receptor 1 (sFlt-1) gene transfection reduces neointimal formation after vascular injury in rabbits, also reduces early vascular inflammation and proliferation, and the formation of neointima lately.

OBJECTIVE: To observe the effects of highly expressed sFlt-1 on atherosclerotic plaque.

METHODS: A total of 48 male New Zealand rabbits were divided into four groups randomly: normal control group (n=8), sham operation group (n=8), balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1 group (n=16) and balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1-sFlt-1 group (n=16). Normal control group and sham operation group were supplied with normal diet. Balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1 group and balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1-sFlt-1 group were supplied with high lipid diet and injured by balloon 2 weeks later. Balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1 group was transfected with pEGFP-N1 and balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1-sFlt-1 group was transfected with pEGFP-N1-sFlt-1.

RESULTS AND CONCLUSION: In the balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1 group and balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1-sFlt-1 group, blood lipid levels apparently increased. At 3 days after model establishment, sFlt-1 expression levels noticeably increased, and atherosclerotic plaque formed to different degrees. Plaque area, plaque perimeter, plaque maximum thickness and the number of positive-cells within the plaque were significantly less in the balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1-sFlt-1 group than in the balloon injury+high lipid diet+pEGFP-N1 group. These results confirm that sFlt-1 gene may express effectively in iliac artery wall of rabbit, inhibited the formation of atherosclerotic plaque and delayed the development of atherosclerotic plaque.
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Key words: Receptors, Vascular Endothelial Growth Factor, Atherosclerosis, Transfection, Tunica Intima.

周仪华，王舒，袁影. 可溶性血管内皮生长因子受体1对动脉粥样硬化斑块的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(18): 2697-2702.

Zhou Yi-hua, Wang Shu, Yuan Ying. Effect of soluble vascular endothelial growth factor receptor-1 on atherosclerotic plaque[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(18): 2697-2702.

图/表（结果） 5

2.1 造模成功动物数量球囊损伤+高脂饮食+ pEGFP-N1组因麻醉意外死亡1只，剩余兔均进入结果分析。
2.2 模型创新性通过球囊损伤兔血管内皮细胞，在机械损伤的基础上再予以高脂饮食，建立模型比较迅速，可以确定粥样斑块形成的部位。另外，以往高脂饲料的配方一般都含有1%-5%不等的胆固醇，大部分配方含有猪油，以致因饲料过于油腻导致腹泻及消化不良等造成死亡或者进食减少。饲料配方选择了较多成分的胆固醇和较少组成的猪油，未加其他成分。实验结果证明，兔血中的胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇明显升高，整个实验过程中动物无明显腹泻，进食量无明显减少，实验过程中未出现因喂养饮食不当等并发症致兔死亡的情况。
2.3 模型更接近临床实践兔是草食动物，因此对高脂饲料比较敏感。单纯高脂饮食造成的脂质斑块和粥样斑块的成分相差较大，只适合于作为早期动脉粥样硬化模型的研究。而根据损伤反应学说，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化产生的初始环节，这就成为机械损伤血管内膜建立模型的理论依据。采用兔高脂饲料喂养结合动脉球囊扩张后，可以形成与人类粥样斑块组成有较多相似之处的模型。
2.4 主要观察结果和次要观察结果
2.4.1 目的基因在髂动脉血管壁的表达基因转染3 d时，Western blot结果显示，可溶性血管内皮生长因子受体1在动脉粥样硬化局部的表达。与球囊损伤+高脂饮食+ pEGFP-N1组相比，球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1- sFlt-1组兔髂动脉可溶性血管内皮生长因子受体1表达明显增加(图1)。

2.4.2 血脂水平与造模前相比，正常对照组和假手术组兔血清总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇未见明显改变，而球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组和球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1-sFlt-1组兔血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和三酰甘油升高(P < 0.01或P < 0.05；表1)。

2.4.3 斑块形态及斑块内CD34阳性细胞数量苏木精-伊红染色显示，正常对照组和假手术组兔髂动脉层次清晰，内膜薄，可见锯齿状结构，中层平滑肌均匀，厚度正常，未见动脉粥样硬化斑块，外层为疏松结缔组织。球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组髂动脉层次欠清晰，内膜增厚，厚薄不均，锯齿状结构消失，可见斑块形成且管腔明显狭窄。球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1- sFlt-1组髂动脉内膜也有增厚，且厚薄不均，但较球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组明显减少(图2)。

球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1-sFlt-1组兔斑块面积、斑块周径、斑块最大厚和度斑块内阳性细胞数量明显少于球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组(P < 0.05；表2，图3)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2009年在南昌大学完成。

1.3 造模动物及材料雄性新西兰大白兔48只，兔龄2-4个月，体质量2.0-2.5 kg，由南昌大学医学院动物科学部提供。实验符合动物伦理学要求并通过南昌大学动物伦理委员会批准。噪声35 dB左右，室温23-27 ℃，相对湿度50%左右，光照时间7：00-19：00，照度 100勒克斯。适应性饲养一周并观察新西兰大白兔情况。实验兔随机分为4组：正常对照组(n=8)、假手术组(n=8)、球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组(n=16)和球囊损伤+高脂饮食+pEGFP- N1-sFlt-1组(n=16)。

1.4 方法

1.4.1 造模方法球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组和球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1-sFlt-1组普通饲料适应性喂养1周后给予高脂饮食(高脂饮食配方为：2%的胆固醇+ 7%的猪油+15%蛋黄粉，其余部分由正常饲料补足)，高脂饮食1周后行球囊损伤。戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉动物，暴露股动脉，取无菌2.5×20.0 mm PCI球囊导管(美国Medtronic公司)，在引导钢丝引导下，进入股动脉，以0.5-1.0个大气压(0.66-101.33kPa)充盈，然后慢慢将球囊回拉出血管，将球囊外撤。重复上述动作3次，常规青霉素8×10⁵U肌肉注射预防感染，连续3 d。正常对照组及假手术组均给予普通饲料饲养；假手术组分离髂动脉但不行球囊损伤血管内皮。各组动物饮水不限。

1.4.2 基因转染用去离子水将pEGFP-N1和pEGFP- N1-sFlt-1重组质粒(上海吉凯基因公司)DNA调制成 1 g/L的溶液。取Lipfectamine TM2000(美国Invitrogen 公司)溶液1 mL，加入pEGFP-N1和pEGFP-N1-sFlt-1重组质粒DNA液20 μL，充分混匀，室温放置30 min。用上述方法损伤髂动脉后分离、暴露、结扎髂动脉段的所有侧枝循环，髂动脉近端动脉夹夹紧暂时阻断血流，抽除局部血管腔内的残留血液，用去离子水冲洗干净，向每只实验兔右髂动脉腔内注入将pEGFP-N1+ Lipfectamine ^TM2000和pEGFP- N1-sFlt- 1+Lipfectamine ^TM2000溶液混合液各0.5 mL，相当于导入10 μg的pEGFP-N1和pEGFP-N1-sFlt-1 DNA，15 min后释放动脉夹，重新恢复血流，逐层关闭手术切口，常规抗生素抗感染，3 d后组织匀浆提取蛋白，Western blot法检测目的基因在局部血管壁的表达。

1.4.3 造模成功的判断基因转染3 d后球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组和球囊损伤+高脂饮食+ pEGFP-N1- sFlt-1组各处死实验动物8只，取出靶血管，提取总蛋白，Western blot检测可溶性血管内皮生长因子受体蛋白在靶血管壁的表达。

1.4.4 血脂测量于造模前和造模后3个月时检测，禁食12 h后经兔耳缘静脉采血5 mL，以3 000 r/min离心 15 min取血清，ELISA法检测总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇的水平，操作按说明书进行。

1.4.5 斑块形态学测量造模后3个月时下腹部正中切口沿腹主动脉下段解剖骼动脉，所截取的髂动脉被均分为4段，将组织脱水，石蜡包埋，在每一段的近端连续切片，每段标本切8-10张，片厚5 μm。行常规苏木精-伊红染色，采用Image-pro-Plus6.0(美国Media Cybernetics公司)专业图像分析软件进行图像分析，测量斑块面积、斑块周径及斑块最大厚度。每一张切片的斑块面积为内弹力膜所包围的面积与管腔面积之差，除以血管的横截面积，以百分数表示，避免了由于血管的大小引起的误差。每一张切片的斑块周径为斑块的周径与管腔的周径之比，以百分数表示。每一张切片的斑块最大厚度选斑块最厚处测厚度，以mm表示。

1.4.6 内皮细胞中CD34阳性细胞数量的计算造模后3个月时进行检测。CD34在正常及肿瘤性的小血管内皮中都有表达，是一种与新生小血管相关的抗原^[4]。动脉粥样硬化斑块上凡有CD34阳性染色，即证明有内皮细胞形成，用Image-pro-Plus6.0(美国Media Cybernetics公司)专业图像分析软件进行分析^[5]。

1.5 主要观察指标可溶性血管内皮生长因子受体1蛋白在动脉粥样硬化局部的表达，血清总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇水平，动脉粥样硬化斑块形态及新生血管的密度。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示。采用SPSS 13.0软件处理各组数据，方差齐时应用方差分析，方差不齐时用秩和检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

动脉粥样硬化的形成过程是内皮细胞的激活和氧化低密度脂蛋白在血管内膜的沉积引起动脉壁的炎症反应的过程^[6]。动脉粥样硬化发生时，动脉壁的增厚增加氧和营养物质从血液到细胞之间的扩散距离，氧供应与氧的需求失衡，激活缺氧诱导的转录因子促进新生血管生成；同时，激活的炎症细胞产生血管源性生长因子和细胞因子，诱导新生血管形成，使血管壁的厚度进一步增加，促进动脉粥样硬化的进一步发展^[7]。动脉粥样硬化中新生微血管密度明显增加，且向斑块内膜延伸，为斑块运输氧气，营养及脂质^[8]。动脉粥样硬化的形成与各种炎症反应关系密切，包括生物性炎症、免疫性炎症和化学性炎症等^[9]。急性渗出性炎症主要见于动脉粥样硬化早期，如单核巨噬细胞浸润；而慢性增生性炎症见于动脉粥样硬化进展期，主要表现为血管平滑肌细胞大量增殖及细胞外基质过度合成。

目前对动脉粥样硬化动物模型的建立并无公认的金标准。实验依据血脂升高作为动脉粥样硬化启动的重要诱因，兔高脂饲料喂养结合动脉球囊扩张后，可以形成与人类粥样斑块组成有较多相似之处的模型。在基因转染 3 d后，Western blot检测结果表明，与球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组相比，球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1- sFlt-1组可溶性血管内皮生长因子受体1表达明显增加，证实模型是成功的，基因转染方法是切实可靠的。

研究显示，可溶性血管内皮生长因子受体1显著增加慢性肾病患者心血管风险，且血清可溶性血管内皮生长因子受体1浓度与患者肾功能呈负相关，而患有慢性肾病的心功能不全大鼠的心血管风险与可溶性血管内皮生长因子受体1浓度息息相关^[10]。Youssry等^[11]发现可溶性血管内皮生长因子受体1可能为镰状细胞肾病的新型标志物。Zhu等^[12]发现可溶性血管内皮生长因子受体1能抑制小鼠肿瘤细胞的生长，提高肿瘤小鼠的生存期，可溶性血管内皮生长因子受体1基因治疗或许为治疗癌症患者比较有前景的方法。在IgA肾病中，患者血浆中可溶性血管内皮生长因子受体1 的含量明显升高^[13]。有轻度蛋白尿的患者，可溶性血管内皮生长因子受体1的含量显著低于中度与重度的蛋白尿患者^[14]。可溶性血管内皮生长因子受体1是抑制各种疾病包括炎症反应的一个重要靶点^[15]。

载脂蛋白E缺失的动脉粥样硬化的小鼠模型中，内皮抑素明显抑制斑块的进展^[16]。血管生成抑素和内皮抑素抑制血管生成的机制尚未完全阐明，抑制内皮细胞的移行和诱导凋亡为其可能机制^[17]。实验将血管生成抑制因子可溶性血管内皮生长因子受体1基因导入实验动物髂动脉损伤局部血管壁，发现目的基因组动脉粥样硬化斑块明显缩小、新生血管数目明显降低。以往的研究表明，新生血管形成是促进稳定型斑块向不稳定型斑块发展的重要机制，与斑块内出血、斑块破裂高度相关，上述这些病理过程的发生与巨噬细胞的浸润及新生血管的不成熟、发育不完全、通透性较高有关^[18]；由此推测动脉粥样硬化斑块的缩小以及新生血管密度降低可能是因为血管生成抑制因子可溶性血管内皮生长因子受体1抑制局部动脉粥样硬化斑块新生血管形成进而阻碍斑块发生发展而实现的。
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