眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (18): 2634-2641.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.008

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眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达

刘慧影¹，王鹏琴²，边颖¹，王金春¹，魏颖鸿¹

1沈阳市第五人民医院神经内一科，辽宁省沈阳市 110023；2辽宁中医药大学附属第一医院康复科，辽宁省沈阳市 110032

收稿日期:2016-03-16 出版日期:2016-04-29 发布日期:2016-04-29
通讯作者: 王鹏琴，博士，主任医师，辽宁中医药大学附属第一医院康复科，辽宁省沈阳市 110032
作者简介:刘慧影，女，1982年生，辽宁省沈阳市人，汉族，辽宁中医药大学在读硕士，主治医师，主要从事脑血管病诊疗方法的研究。
基金资助:
辽宁彭氏眼针学术流派传承工作室建设项目(Lpgzs2012-09)

Effects of eye acupuncture therapy on neurological function and brain-derived neurotrophic factor expression in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury

Liu Hui-ying¹, Wang Peng-qin², Bian Ying¹, Wang Jin-chun¹, Wei Ying-hong¹

1First Department of Neurology, Shenyang Fifth People’s Hospital, Shenyang 110023, Liaoning Province, China; 2Department of Rehabilitation, First Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China

Received:2016-03-16 Online:2016-04-29 Published:2016-04-29
Contact: Wang Peng-qin, M.D., Chief physician, Department of Rehabilitation, First Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
About author:Liu Hui-ying, Studying for master’s degree, Attending physician, First Department of Neurology, Shenyang Fifth People’s Hospital, Shenyang 110023, Liaoning Province, China
Supported by:
a grant from Liaoning Peng’s Eye Acupuncture Therapy Academic Inheritance Studio Construction Project, No. Lpgzs2012-09

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

神经生长因子：是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。神经生长因子包含α，β，γ共3个亚单位，活性区是β亚单位，由2个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，与人体神经生长因子的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性。

脑源性神经营养因子：是体内含量最多的神经营养因子，它通过与酪氨酸激酶B的结合而发挥作用。酪氨酸激酶B的胞内区域具有内在的酪氨酸激酶活性，脑源性神经营养因子与酪氨酸激酶B结合后激活胞内区域，引起酪氨酸激酶B自身磷酸化作用增强，进而激活Ras-MAPK通路，最后在CAMP反应元件结合蛋白(CREB)的丝氨酸位点激活CREB。CREB通过增加脑源性神经营养因子基因及抗凋亡蛋白基因bcl-2的表达，来促进神经细胞生存，增加突触可塑性及神经发生。

背景：眼针疗法主要是针刺眼球周围、眼眶边缘的穴位，调整气血运行、疏经通络和调和阴阳，现已在临床广泛运用，对缺血性脑血管病等多种疾病疗效显著，但是具体作用机制尚不明确。神经营养因子是一类调控神经元存活、发展和发挥作用的蛋白家族，包括神经营养因子和脑源性神经营养因子等。

目的：观察眼针对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子表达的影响。

方法：将54只雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和眼针组，每组18只。后2组采用线栓法制备大脑中动脉闭塞模型，眼针组于缺血2 h后进行眼针干预，于大鼠眶周2 mm处取穴肝区、上焦区、下焦区和肾区。治疗第3，7，14天进行神经功能评分。治疗第1，2周，免疫组织化学染色检测神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性表达，治疗第2周采用TTC染色法检测脑梗死体积。

结果与结论：①眼针组治疗后第1，2周神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性表达细胞明显高于模型组(P < 0.05)，与治疗后第1周相比，第2周数量下降。②治疗后第7，14天眼针组神经功能评分明显降低，与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但仍高于假手术组 (P < 0.05)；③治疗后第2周，眼针组和模型组大鼠脑梗死体积均明显大于假手术组(P < 0.01)，但眼针组脑梗死体积明显小于模型组(P < 0.05)；④结果证实，眼针干预可能是通过增强脑缺血后神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达，从而改善神经功能，缩小脑梗死体积，对缺血性脑损伤具有一定的保护作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0003-3166-3344(刘慧影)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 眼针, 大脑中动脉闭塞, 脑梗死, 神经生长因子, 脑源性神经营养因子, 神经功能, 梗死体积, 神经营养因子, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Eye acupuncture therapy is a technique used to adjust qi-blood circulation, relax muscles and tendons, and activate collaterals by acupuncture at the acupoints around the eye balls and in the orbital border. This therapy has been widely used in the clinic because it exhibits remarkable therapeutic effects on many ischemic cerebrovascular diseases. However, the precise mechanism behind this therapy remains poorly understood. Neurotrophic factors are a protein family including neurotrophic factors and brain-derived neurotrophic factors that can regulate neuronal survival, development and functioning.

OBJECTIVE: To investigate the effects of eye acupuncture therapy on neurological function and nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression in the brain tissue of rat models of cerebral ischemia/reperfusion injury.

METHODS: Fifty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups with 18 rats per group: sham-operated, model and eye acupuncture therapy groups. Rat models of middle cerebral artery occlusion were established by the intraluminal suture method in the model and eye acupuncture therapy groups. Eye acupuncture was performed at the following acupoints liver area, upper-jiao area, lower-jiao area and kidney area located at the internal orbital margin at 2 hours after cerebral ischemia/reperfusion injury. Rat neurological function was evaluated at 3, 7, and 14 days after injury. Nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression in the rat brain tissue was detected using immunohistochemical staining method at 1 and 2 weeks after treatment. Cerebral infarct size was determined using TTC staining at 2 weeks after treatment.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 1 and 2 weeks after injury, nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression was significantly greater in the eye acupuncture therapy group than in the model group (P < 0.05), but nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression in the eye acupuncture therapy group was decreased at 2 weeks after injury compared to that at 1 week after injury. (2) At 7 and 14 days after treatment, neurological function scores in the eye acupuncture therapy group were significantly lowered, and there was significant difference between eye acupuncture therapy and model groups (P < 0.05), but they were significantly higher than those in the sham-operated group (P < 0.05). (3) At 2 weeks after treatment, cerebral infarct size was significantly greater in the eye acupuncture therapy and model groups than in the sham-operated group (P < 0.01), and it was significantly smaller in the eye acupuncture therapy group than in the model group (P < 0.05). (4)These results indicate that eye acupuncture therapy shows neuroprotective effects on ischemic cerebral injury by increasing nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression, improving neurological function, and reducing cerebral infarct size.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Infarction, Middle Cerebral Artery, Nerve Growth Factor, Brain-Derived Neurotrophic Factor, Acupuncture Points, Eye, Tissue Engineering

刘慧影，王鹏琴，边颖，王金春，魏颖鸿. 眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(18): 2634-2641.

Liu Hui-ying, Wang Peng-qin, Bian Ying, Wang Jin-chun, Wei Ying-hong. Effects of eye acupuncture therapy on neurological function and brain-derived neurotrophic factor expression in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(18): 2634-2641.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析纳入实验SD大鼠54只，造模过程中死亡大鼠均给予随机补足数量，保证最终每组大鼠18只，最终大鼠54只均进入结果分析，干预流程图见图1。

2.2 各组大鼠神经功能变化造模后即刻模型组与眼针组大鼠神经功能评分差异无显著性意义(P > 0.05)；模型组与眼针组神经功能评分均明显高于假手术组 (P < 0.01)，说明脑缺血再灌注模型建立成功。治疗后第3天眼针组神经功能评分有所降低，但与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；治疗后第7，14天眼针组神经功能评分明显降低，与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但仍高于假手术组(P < 0.05)，说明眼针干预可明显改善脑缺血再灌注模型大鼠的神经功能，见图2。

2.3 大鼠脑组织神经生长因子的表达免疫组织化学染色观察显示，神经生长因子阳性表达的细胞胞浆染成棕黄色，假手术组只观察到少量的神经生长因子阳性细胞。

模型组神经生长因子阳性细胞数量增多，免疫阳性细胞平均灰度值降低，与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；模型组第2周时间点与第1周时间点相比，神经生长因子阳性细胞数量减少(P < 0.05)，免疫阳性细胞平均灰度值增高(P < 0.05)。

眼针组第1周时间点神经生长因子阳性细胞数量明显增多，免疫阳性细胞平均灰度值明显降低，与模型组和假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；眼针组第2周时间点神经生长因子阳性细胞数量有所下降，但仍高于同时间点的模型组(P < 0.05)，免疫阳性细胞平均灰度值低于模型组(P < 0.05)，表明眼针刺激能明显增强脑缺血再灌注模型大鼠脑组织神经生长因子的表达，见表1和图3。

2.4 免疫组织化学染色观察大鼠脑组织脑源性神经营养因子的表达脑源性神经营养因子与神经生长因子表达规律相仿，主要分布在脑梗死灶周围皮质和海马区，脑源性神经营养因子阳性表达的细胞胞浆和胞膜染成棕黄色，假手术组只观察到少量的脑源性神经营养因子阳性细胞，染色强度较弱。

模型组第1周和第2周时间点脑源性神经营养因子阳性细胞数量比假手术组明显增多，免疫阳性细胞平均灰度值明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；但模型组第2周时间点与第1周时间点相比，差异无显著性意义(P > 0.05)。

眼针组第1周时间点脑源性神经营养因子阳性细胞数量明显增多，免疫阳性细胞平均灰度值明显降低，与模型组和假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与第1周比较，眼针组第2周时间点脑源性神经营养因子阳性细胞数量有所下降(P < 0.05)，但仍高于同时间点的模型组(P < 0.05)，免疫阳性细胞平均灰度值低于模型组(P < 0.05)，表明眼针刺激能明显增强脑缺血再灌注模型大鼠脑组织脑源性神经营养因子的表达，见表2和图4。

2.5 各组大鼠脑梗死体积百分比模型组大鼠大脑切片梗死区呈白色，眼针组大鼠脑片梗死区白色部分明显缩小。

治疗后第2周，眼针组和模型组大鼠脑梗死体积均明显大于假手术组(P < 0.01)，但眼针组脑梗死体积明显小于模型组(P < 0.05)，见表3。

参考文献

[1] Che J, Piao LH, Tian WZ. Professor Tian Wei-zhu's clinical experiences in acupuncture treatment of stroke. Zhongguo Zhen Jiu. 2007;27(8):609-611.

[2] Huang J, McCaskey MA, Yang S, et al. Effects of acupuncture and computer-assisted cognitive training for post-stroke attention deficits: study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 2015;16(1):546.

[3] Zhang S, Zhang LH, Wang YJ, et al. Effects of synchronous treatment of bilateral scalp acupuncture and rehabilitation training on activities of daily life in patients with cerebral infarction at acute phase. Zhongguo Zhen Jiu. 2014;34(9):837-840.

[4] Bai ZH, Zhang ZX, Li CR, et al. Eye acupuncture treatment for stroke: a systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:871327.

[5] Zhou HF, Wang J, Cao TJ, et al. Effects of eye acupuncture on SEPCT-determined cerebral blood flow in patients with cerebral infarction. Zhongguo Zhen Jiu. 2011;31(5):391-394.

[6] Lu H, Liu X, Zhang N, et al. Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor and noggin-modified bone mesenchymal stem cells in focal cerebral ischemia in rats. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2016; 25(2):410-418.

[7] Cheng CY, Lin JG, Su SY, et al. Electroacupuncture- like stimulation at Baihui and Dazhui acupoints exerts neuroprotective effects through activation of the brain-derived neurotrophic factor-mediated MEK1/2/ERK1/2/p90RSK/bad signaling pathway in mild transient focal cerebral ischemia in rats. BMC Complement Altern Med. 2014;14:92.

[8] Kong SY, Li QF, Yang J, et al. The effect of butylphthalide on expression of NGF and BDNF in ischemia stroke tissue of rat cerebrum. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2007;38(3):400-403, 407.

[9] 王刚,范顺武,李强,等.神经生长因子梯度缓释系统促进周围神经再生的临床疗效观察[J].中华显微外科杂志, 2013, 36(6):558-562.

[10] 赵淑杰,朱雨岚.脑源性神经营养因子对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的影响[J].中国实用神经疾病杂志, 2015, 18(13):40-41.

[11] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 1989;20(1):84-91.

[12] 田维柱.中华眼针[M].沈阳:辽宁科技出版社,1998:78-85.

[13] 王鹏琴,王健,周鸿飞.眼针对急性脑梗死患者神经功能缺损及血浆纤维蛋白原水平的影响[J].中国康复医学杂志, 2006,21(2):118-120.

[14] 姜华锋.眼针运动疗法并用治疗中风恢复期30例[J].实用中医内科杂志,2009,23(5):95-96.

[15] 荆思琪,王鹏琴.彭氏眼针治疗头痛疗效观察[J].上海针灸杂志,2015,34(11):1038-1039.

[16] 常红专,卢建立,阴盛奎.眼针治疗急性腰扭伤56例报告[J].河南实用神经疾病杂志,2001,4(5):81.

[17] 胡玉莲,林强,厉岩.眼针治疗原发性痛经疗效观察[J].上海针灸杂志,2011,30(6):370-371.

[18] 何宇,何川,孙年怡,等.作业治疗结合眼针对脑卒中患者日常生活活动能力和上肢运动功能的疗效观察[J].中国康复医学杂志,2015,30(9):949-950.

[19] 张雪松.眼针治疗脑中风26例疗效观察[J].实用中医内科杂志,2010,24(2):100-101.

[20] Cheng S, Ma M, Ma Y, et al.Combination therapy with intranasal NGF and electroacupuncture enhanced cell proliferation and survival in rats after stroke. Neurol Res. 2009;31(7):753-758.

[21] Andsberg G, Kokaia Z, Björklund A,et al.Amelioration of ischaemia-induced neuronal death in the rat striatum by NGF-secreting neural stem cells. Eur J Neurosci. 1998;10(6):2026-2036.

[22] 禄韶英,王燕.神经生长因子对脑缺血大鼠学习与记忆的影响[J].中华神经外科疾病研究杂志,2012,11(4): 339-342.

[23] Li HF, Wang YR, Huo HP, et al.Neuroprotective effects of ultrasound-guided nerve growth factor injections after sciatic nerve injury. Neural Regen Res. 2015; 10 (11): 1846-1855.

[24] 刘鹏,王瑾,苗常青,等.大鼠局灶性脑缺血后神经营养因子表达的自然变化[J].卒中与神经疾病,2015,22(4): 211-214.

[25] Solev IN, Balabanyan VY, Volchek IA, et al. Involvement of BDNF and NGF in the mechanism of neuroprotective effect of human recombinant erythropoietin nanoforms. Bull Exp Biol Med. 2013; 155(2):242-244.

[26] Kokaia Z, Zhao Q, Kokaia M, et al. Regulation of brain-derived neurotrophic factor gene expression after transient middle cerebral artery occlusion with and without brain damage.Exp Neurol. 1995;136(1):73-88.

[27] Choi Y, Kang SG, Kam KY. Changes in the BDNF-immunopositive cell population of neocortical layers I and II/III after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 2015;16(5):76-82.

[28] Harada S, Fujita-Hamabe W, Tokuyama S. Ameliorating effect of hypothalamic brain-derived neurotrophic factor against impaired glucose metabolism after cerebral ischemic stress in mice. J Pharmacol Sci. 2012;118(1):109-116.

[29] Guan J, Tong W, Ding W, et al. Neuronal regeneration and protection by collagen-binding BDNF in the rat middle cerebral artery occlusion model. Biomaterials. 2012;33(5):1386-1395.

[30] Wang Q, Mao-Draayer Y.Interferon beta (IFN-β) treatment exerts potential neuroprotective effects through neurotrophic factors and novel neurotensin/ neurotensin high affinity receptor 1 pathway. Neural Regen Res. 2015; 10(12): 1932-1933.

[31] Zhang YR, Zhang H, Zhang GC, et al.Combining acellular nerve allografts with brain-derived neurotrophic factor transfected bone marrow mesenchymal stem cells restores sciatic nerve injury better than either intervention alone. Neural Regen Res. 2014;9 (20): 1814-1819.

[32] 马贤德,王守岩,张威.眼针对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织BDNF、p75NTR表达影响及其脑保护作用机制[J].北京中医药大学学报,2014,37(1):48-52.

[33] 王欢,郭峰,单德红,等.眼针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马区BDNF及TrkB表达的影响[J].吉林中医药, 2011, 31(5): 475-477.

[34] 王哲,王守岩,王德山,等.眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织BDNF表达影响[J].针灸临床杂志, 2011, 27(7):57-60.

引言

脑梗死是由于脑组织缺血、缺氧、坏死而导致动脉狭窄或闭塞，引发一系列神经功能缺失表现。该病具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高以及并发症多等特点，对脑保护和康复治疗已成为国内外学者研究的重点。

大量临床研究表明，针灸治疗脑缺血疾病具有较好疗效，对患者语言、运动等功能恢复和并发症的改善均有良好的促进作用^[1-3]，其中眼针疗法是一种特殊针灸施术针法，由辽宁中医药大学附属医院著名老中医彭静山教授于20世纪70年代首创，主要是针刺眼球周围、眼眶边缘的穴位，调整气血运行、疏经通络和调和阴阳，现已在临床广泛运用，对缺血性脑血管病等多种疾病疗效显著^[4-5]，但是具体作用机制尚不明确。

神经营养因子是一类调控神经元存活、发展和发挥作用的蛋白家族，包括神经营养因子3、神经营养因子6、神经生长因子(never growth factor，NGF)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)等，均与神经系统疾病关系密切^[6-8]。

神经生长因子是神经系统非常重要的生物活性分子之一，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要作用。王刚等^[9]对周围神经损伤患者进行一期神经修复同时利用自制的梯度缓释系统进行神经生长因子局部缓释，经神经电生理检查和感觉及运动功能评定，表明神经生长因子梯度缓释系统可早期安全、有效地促进周围神经损伤修复后的功能恢复。

脑源性神经营养因子是一种小分子二聚体蛋白质，在结构上与神经生长因子相关，对中枢神经系统的多种类型神经元的生长、发育、分化、维护和再生同样具有重要作用。赵淑杰等^[10]研究表明脑源性神经营养因子能改善6-羟多巴胺所致的帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元数目的减少，明显抑制6-羟多巴胺引起的纹状体部多巴胺含量降低，并可抑制6-羟多巴胺对黑质多巴胺能神经元的毒性作用。

实验选择不同时间段观察眼针对脑缺血再灌注模型大鼠神经功能和脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子表达的影响，探索其可能的作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年5至7月在辽宁中医药大学实验室完成。

1.3 材料 SPF级健康SD大鼠54只，雄性，体质量180-220 g，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。自由饮水、普遍颗粒饲料喂养，光暗周期12 h，室内温度18-22 ℃，相对湿度55%-70%。

实验对动物处置严格遵循动物伦理学要求。适应性喂养1周后，将大鼠54只随机分为假手术组、模型组和眼针组，每组18只大鼠。

1.4 实验方法

1.4.1 脑缺血再灌注模型大鼠的制备参照改良Longa线栓法制备大脑中动脉栓塞模型^[11]。主要步骤为：10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，常规消毒，取颈正中切口，分离右侧颈总动脉，颈外动脉与颈内动脉，结扎颈总动脉近心端及颈外动脉，将预先处理过的4-0尼龙线的线栓插入颈总动脉，经颈内动脉送至颅内，稍遇阻力则止，线栓插入深度距离颈内、外分叉处18-20 mm(注意鱼线不能插入过深，否则易致蛛网膜下腔出血)，收紧线栓。缝合切口，留置线头于体外，用手术灯照射，2 h后实现再灌注时，抽提线栓至颈总动脉内即可。

假手术组只分离出右颈内、外动脉，不结扎、不插尼龙线。造模后的动物在自然苏醒后，若出现追尾现象、原地向左侧旋转、右侧出现Honer征为造模成功。

1.4.2 眼针干预眼针组大鼠缺血2 h再灌注即刻给予眼针干预。大鼠皮肤用体积分数为75%的乙醇棉球消毒后，取31号13 mm毫针，于大鼠眶周2 mm处针刺，定位参照人体取穴^[12]，取穴肝区、上焦区、下焦区和肾区。采取眶外平刺法平刺进针，左眼按照顺时针方向(右侧按逆时针方向)刺入真皮，达到皮下组织，进针3 mm终止。留针20 min，留针10 min时用刮柄进行刮针1次，每针5下，拔针后用干棉球按压针眼防止出血。

1.4.3 神经功能评估于治疗后第3，7，14天参照Longa方法^[11]进行神经功能评分。0分：无明显神经缺损症状；1分：不能完全伸展前爪；2分：行走时，身体向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自行行走，意识消失。

1.4.4 免疫组织化学染色于治疗后第1周和第2周，3组每个时间点取6只大鼠，将大鼠用体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔暴露心脏，经左心室先灌流生理盐水100 mL，然后灌流40 g/L多聚甲醛进行固定30 min，断头取脑，放入40 g/L多聚甲醛固定过夜，组织脱水、透明、浸蜡、包埋，以梗死灶为中心行连续冠状切片(片厚7 μm)，每只大鼠取2张连续切片，分别进行神经生长因子、脑源性神经营养因子免疫组化染色。

具体操作步骤：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，滴加体积分数3%H₂O₂室温下放置10 min，PBS漂洗3次，每次5 min；然后滴加体积分数5%BSA室温封闭 15 min，分别滴加一抗兔抗鼠神经生长因子抗体、兔抗鼠脑源性神经营养因子抗体 (1︰200)，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加生物素标记的二抗，室温孵育20 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加SABC试剂，室温孵育20 min，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB显色，PBS漂洗3次，苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。以PBS代替一抗作为空白对照，进行上述免疫组织化学染色。

光学显微镜(日本Olympus公司)下观察神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性表达细胞呈棕黄色，每张切片选择3个相邻视野计数染色明显的阳性细胞，并用全自动图像分析系统对染色强度进行定量分析，测定灰度值。

1.4.5 TTC染色法计算脑梗死体积于治疗后第2周， 3组各取6只大鼠，将大鼠用体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速断头取脑组织，制作冠状位切片，厚 2 mm，立即置于体积分数2%的TTC溶液中，于37 ℃下染色30 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min。

采用显微图像分析系统采集图像，其中正常脑组织染成红色，梗死灶为白色，计算大鼠脑梗死体积百分比。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠神经功能评分。②各组大鼠脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性细胞数量和胞质平均灰度值。③各组大鼠脑梗死体积百分比。

1.6 统计学分析计量资料采用x(_)±s表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，多组间数据差异的比较采用单因素方差分析和SNK-q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

眼针疗法属于微针中的一种疗法，主要以脏腑经络学说，五轮八廓学说以及易经的阴阳八卦学说为理论根据，通过针刺眼眶周围的穴区以调整气血运行、疏经通络和调和阴阳，长期以来已在临床得到广泛应用，其中应用最多的是脑血管疾病^[13-14]，也就是中医所说的“中风”，其基础病变在血脉，“脉者，血之府也”，脉以通为顺，若血运不利，瘀血在脑，即引起缺血等症状，其他疾病还有头痛、胃痛、急性扭伤和痛经等^[15-17]。

眼针的操作手法不同于其他针灸手法，快速刺入以后，不用提插、捻转、开合任何手法，针刺后患者即有麻酸胀痛或温热、清凉等感觉，具有操作简便，有效率高等特点。

大量研究证实眼针治疗脑血管疾病有显著效果^[18-19]，实验对脑缺血再灌注模型大鼠进行眼针干预，结果显示治疗后第7，14天眼针组神经功能评分明显降低，与模型组比较差异有显著性意义；治疗后第2周，眼针组和模型组大鼠脑梗死体积均明显大于假手术组，但眼针组脑梗死体积明显小于模型组，说明眼针干预可明显改善脑缺血再灌注模型大鼠的神经功能，缩小梗死体积，但其作用机制尚未完全阐明。

神经生长因子是神经营养因子家族中重要的成员之一，是近年来引起科学家们十分关注的特异蛋白质分子，其与中枢神经系统疾病的关系日益受到重视。

神经生长因子在脑内含量较少，主要存在于海马、大脑皮质和嗅球等部位，研究证实其能够促进受损神经元的存活和再生，从而改善神经功能、运动功能等相应症状^[20-23]。刘鹏等^[24]研究表明脑缺血大鼠的神经功能评分和梗死体积均严重受损，缺血半暗带神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性神经元数增加，结果表明脑缺血可上调缺血半暗带神经生长因子、脑源性神经营养因子的表达水平。

实验结果显示，模型组在第1周后脑组织神经生长因子阳性表达明显多于假手术组，在治疗后第2周时神经生长因子表达虽有所下降，但仍高于假手术组，可能是造模后脑组织启动了内源性保护机制，上调脑内神经营养因子的表达，从而降低缺血对脑组织的损害，挽留更多的脑功能^[25]。

单纯内源性神经生长因子的上调不足以防止神经细胞死亡，只有当达到一定阈值损伤神经元才能够恢复，眼针组在治疗后第1周脑组织神经生长因子阳性表达高于模型组和假手术组，在治疗后第2周虽已呈下降趋势，但仍高于同时间点的模型组，提示眼针能提高脑缺血再灌注模型大鼠脑组织神经生长因子的分泌，延长表达时程，是其促进神经功能恢复的机制之一。

脑源性神经营养因子也是神经营养因子家族重要成员之一，是1982年Barde等从猪脑中分离纯化出的一种蛋白质，其能够抑制神经元细胞凋亡，促进神经元损伤的修复和再生^[26-31]，在脑中主要分布于皮质、海马、基底节等区域。

实验发现，模型组治疗后第1，2周大鼠脑组织脑源性神经营养因子表达明显高于假手术组，可能是因为脑栓塞后机体启动自我保护功能，模型组治疗后2个时间点之间比较差异无显著性意义。眼针组大鼠脑组织脑源性神经营养因子表达显著增多，在2周时仍明显高于模型组，提示眼针治疗效果持续时间较长，作用更持久，眼针疗法可使脑源性神经营养因子持续高水平表达，能有效地修复受损伤神经元，与其他学者研究结果一致^[32-34]。

综上所述，眼针干预可能是通过增强脑缺血后神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达，从而改善神经功能，缩小脑梗死体积，对缺血性脑损伤具有一定的保护作用。因为实验只选取2个时间点，所以无法看出神经生长因子和脑源性神经营养因子在脑缺血再灌注模型大鼠缺血区脑组织的表达规律，具体作用环节有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达

Effects of eye acupuncture therapy on neurological function and brain-derived neurotrophic factor expression in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury

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[1]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[2]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[3]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[4]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[5]	罗选翔, 经历, 潘彬, 冯虎. 甲钴胺联合鼠神经生长因子促进脊髓型颈椎病术后神经功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 719-722.
[6]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[7]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[8]	徐晓明, 陈艳, 宋倩, 袁露, 顾加明, 张丽娟, 耿洁, 董坚. 人胎盘间充质干细胞凝胶促进SD大鼠放射性皮肤损伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3976-3980.
[9]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[10]	白胜超, 高扬, 王博, 李俊平, 王瑞元. 针刺干预大负荷运动损伤模型大鼠骨骼肌线粒体功能的动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3648-3653.
[11]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[12]	谢阳, 吕志宇, 张淑江, 龙婷, 李作孝. 重组腺病毒介导神经生长因子转染实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠少突胶质细胞的凋亡及髓鞘化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3678-3683.
[13]	徐伟龙, 左媛, 辛大奇, 贺晨阳, 赵鹏, 史鸣, 周博源, 刘雅婷, 赵岩. 急性钳夹型脊髓损伤模型大鼠造模方式的选择：一项网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3767-3772.
[14]	董丽萍, 罗怀青, 袁衡, 龙娟, 许少辉. 增龄对大鼠缺血后肢侧支血管生长的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3156-3161.
[15]	王朝格, 翁锡全, 林宝璇, 陈丽娜, 徐国琴. 低温运动干预肥胖大鼠的脂肪组织类型及功能改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3162-3167.