黄精多糖调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.001

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (15): 2133-2139.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.001

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黄精多糖调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

农梦妮¹，曾高峰¹，宗少晖²，杜力³，李柯柯⁴，彭小明⁴，严芳娜⁴

广西医科大学，1公共卫生学院，4研究生学院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西医科大学，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2016-02-12 出版日期:2016-04-08 发布日期:2016-04-08
通讯作者: 曾高峰，博士，教授，硕士生导师，广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360279)

Polygonatum sibiricum polysaccharide regulates osteoblastic differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Nong Meng-ni¹, Zeng Gao-feng¹, Zong Shao-hui², Du Li³, Li Ke-ke⁴, Peng Xiao-ming⁴, Yan Fang-na⁴

1College of Public Health of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 4Graduate School of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2016-02-12 Online:2016-04-08 Published:2016-04-08
Contact: Zeng Gao-feng, M.D., Professor, Master’s supervisor, College of Public Health of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360279

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

wnt信号通路：1982年在小鼠乳腺癌发现了Wnt基因，由于此基因激活依赖小鼠乳腺癌相关病毒基因的插入，因此，当时被命名为Int1基因，之后的研究表明，Int1基因在小鼠正常胚胎发育中起重要作用，相当于果蝇的无翅(Wingless)基因，可控制胚胎的轴向发育。此后大量研究提示了Int1基因在神经系统胚胎发育中的重要性，因此将Wingless与Int1结合，称为Wnt基因。人Wnt基因定位于12q13.在胚胎发育中，Wnt基因调控的重要信号传导系统即为Wnt通路。

wnt信号通路分类：①典型Wnt/β-catenin信号通路：此通路激活核内靶基因的表达，与Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受体蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-连环蛋白及TCF/LEF家族转录调节因子等构成了经典通路；②平面极细胞通路：此通路参与JNK的激活及细胞骨架的重排；③Wnt/Ca⁺通路：激活磷脂酶C和蛋白激酶C；④胞内通路：调节纺锤体的方向和非对称细胞分裂。

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能。黄精多糖可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

目的：探讨黄精多糖对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号通路的影响。

方法：培养小鼠骨髓间充质干细胞，在传统成骨诱导培养基诱导下给予5，10，25，50 mg/L 黄精多糖进行干预，不加黄精多糖作为对照组，显微镜下观察细胞形态变化。PNPP法检测碱性磷酸酶活性；观察细胞发生矿化并进行茜素红染色，记录矿化结节数和面积分数；qRT-PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素mRNA表达；采用qRT-PCR和Western Blot分别检测β-catenin基因和蛋白表达水平；采用双荧光素酶报告基因检测系统检测下游β-catenin/TCF的转录活性。

结果与结论：①与对照组相比，不同质量浓度的黄精多糖以剂量依赖性的方式提高碱性磷酸酶活性(P < 0.05)，显著增强细胞的矿化能力，明显提高碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素基因的表达(P < 0.05)；②诱导后β-catenin mRNA在第3天表达最高，黄精多糖在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中还能显著上调β-catenin的表达(P < 0.05)，促使含有TCF结合位点的荧光素酶报告基因(TOPFlash)的高表达(P < 0.05)；③说明黄精多糖通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-0595-0043(曾高峰)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 黄精多糖, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, Wnt/β-catenin, 骨质疏松, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have the ability of multi-directional differentiation. Polygonatum sibiricum polysaccharide can promote osteogenetic differentiation of mouse BMSCs by activating Wnt/β-catenin signaling pathway, which is expected to become a new drug for the treatment of osteoporosis.

OBJECTIVE: To investigate the effects of Polygonatum sibiricum polysaccharide on Wnt/β-catenin signaling pathway in the osteogenic differentiation of mouse BMSCs.

METHODS: The mouse BMSCs were cultured and induced in osteoblast medium containing final concentrations (5, 10, 25, 50mg/L) of Polygonatum sibiricum polysaccharide. The mouse BMSCs treated without Polygonatum sibiricum polysaccharide was set as the negative control group. The morphological changes of cells were observed under an inverted microscope. Alkaline phosphatase (ALP) activity assay was performed by PNPP method. The mineralization nodules were observed and stained with alizarin red S and the number and area fraction were recorded under an inverted microscope. The mRNA expressions of osteogenesis-related genes ALP, Runx2, and osteocalcin were evaluated by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). qRT-PCR and western blot were used to determine the expression level of β-catenin. The downstream β-catenin/TCF transcriptional activity was evaluated with the Dual-Luciferase Reporter Assay System.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, polygonatum sibiricum polysaccharide significantly enhanced the alkaline phosphatase activity, the mineralization ability of cells, and the mRNA expression of ALP, Runx2 and osteocalcin in the differentiated BMSCs in a dose dependent manner (P < 0.05). After induction, the mRNA expression of β-catenin was the highest on the 3^rd day. Polygonatum sibiricum polysaccharide significantly increased the expression of β-catenin (P < 0.05) in the process of promoting the differentiation of BMSCs into osteoblasts, and also promoted the high-level expression of luciferase reporter gene (TOPFlash) which contains wild type TCF binding sites (P < 0.05). These results demonstrate that Polygonatum sibiricum polysaccharide can promote the osteoblast differentiation of mouse BMSCs by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Polygonatum, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, beta Catenin, TCF Transcription Factors, Tissue Engineering

农梦妮，曾高峰，宗少晖，杜力，李柯柯，彭小明，严芳娜. 黄精多糖调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(15): 2133-2139.

Nong Meng-ni, Zeng Gao-feng, Zong Shao-hui, Du Li, Li Ke-ke, Peng Xiao-ming, Yan Fang-na. Polygonatum sibiricum polysaccharide regulates osteoblastic differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(15): 2133-2139.

图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞生长情况及形态学变化正常骨髓间充质干细胞呈长梭形，成纤维细胞样，传代后均匀分布生长，平行排列。细胞增殖旺盛，生长潜伏期短，经传代8次后，细胞活力仍很旺盛。骨髓间充质干细胞成骨诱导3 d后，细胞体积变大，呈短梭形，诱导六七天细胞长满单层，大部分呈多角形，胞质内细胞颗粒增多。继续诱导逐渐形成多层生长，高密度区的细胞形态逐渐向成骨细胞方向转化，细胞外基质分泌增多，并包裹细胞。

2.2 黄精多糖对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性的影响与对照组相比，黄精多糖实验组(10，25，50 mg/L)以剂量依赖性显著提高细胞碱性磷酸酶活性，25 mg/L 黄精多糖实验组较其他黄精多糖组提高碱性磷酸酶活性最为显著，而较高质量浓度组(50 mg/L)提高碱性磷酸酶活性的幅度稍下降(表1)。

2.3 黄精多糖对骨髓间充质干细胞外基质矿化能力的影响矿化结节经茜素红染色呈红色。黄精多糖实验组形成的矿化结节数(数量，×40)与矿化面积分数(大小，×100)均显著高于对照组(P < 0.05)，各黄精多糖实验组矿化结节数之间的差异不明显，但矿化面积分数以剂量依赖性增高，其中以25 mg/L黄精多糖组形成的矿化结节数和面积分数最高(表1)，结果提示黄精多糖能显著增强骨髓间充质干细胞的矿化能力。

2.4 黄精多糖对成骨相关基因表达的影响通过qRT-PCR方法检测成骨细胞分化早期标志物碱性磷酸酶(14 d)、成骨细胞特异转录因子Runx2(14 d)、成骨细胞分化成熟晚期标志物骨钙素(21 d)mRNA表达水平，与对照组相比，黄精多糖诱导组在5-50 mg/L之间有不同显著程度的高表达水平，而且在浓度范围内呈剂量依赖性升高，在25 mg/L组表达量最高(表2)，与碱性磷酸酶活性和矿化结节实验结果相一致。这些结果均表明黄精多糖对体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的促进作用。

2.5 黄精多糖对Wnt/β-catenin信号通路相关因子β-catenin的表达情况实验首先用含不同质量浓度黄精多糖的成骨诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞，在诱导24，48，72 h时提取总RNA，qRT-PCR法检测β-catenin mRNA表达水平，结果显示各质量浓度组β-catenin mRNA表达水平随诱导时间的延长而增高，在72 h达到高峰，且10，25，50 mg/L组显著高于对照组(表3)。诱导72 h后，WB检测β-catenin在总蛋白的表达水平，结果显示，10，25，50 mg/L 黄精多糖+成骨诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞能明显增加β-catenin的蛋白水平，呈现剂量依赖性(表3)，与qRT-PCR结果一致，提示黄精多糖上调骨髓间充质干细胞内β-catenin的表达，从而激活Wnt/β-catenin信号通路。

2.6 黄精多糖对β-catenin/TCF/LEF转录活性的影响与对照组相比，黄精多糖组(10，25，50mg/L)TOPFlash报告基因的荧光素酶活性显著增强，其中25 mg/L组增加了3倍，达最大效应，FOPFlash报告基因没有显著变化(表4)。结果说明黄精多糖可增强β-catenin/TCF的转录活性，激活Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的表达。

参考文献

[1] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science.1999;284(5411):143-147.

[2] Lagari VS, Levis S. Phytoestrogens in the prevention of postmenopausal bone loss. J Clin Densitom. 2013;16(4): 445-449.

[3] Lagari VS, Levis S. Phytoestrogens for menopausal bone loss and climacteric symptoms.J Steroid Biochem Mol Biol.2014;139(1): 294-301.

[4] 崔亦华,崔英德,易国斌.应用广泛的天然多糖及其提取方法[J].广州化工,2002, 30(3): 7-9.

[5] 何才通,李文.黄精多糖药理功效研究进展[J].新中医, 2014, 46(3): 196-199.

[6] 雷震,杨光义,叶方,等.黄精多糖药理作用及临床应用研究概述[J].中国药师, 2012, 15(1): 114-116.

[7] 曾高峰,张志勇,鲁力,等.黄精多糖对骨质疏松性骨折大鼠骨代谢因子的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(33): 6199-6202.

[8] Zeng GF, Zhang ZY, Lu L, et al. Protective effects of Polygonatum sibiricum polysaccharide on ovariectomy- induced bone loss in rats. J Ethnopharmacol.2011; 136(1): 224-229.

[9] 曾高峰,张志勇,鲁力,等.多糖干预骨质疏松模型大鼠的作用及机制[J].中国组织工程研究, 2012,16(50): 9471-9478.

[10] Clevers H, Nusse R. Wnt/β-catenin signaling and disease. Cell.2012;149(6):1192-1205.

[11] Baron R, Kneissel M. WNT signaling in bone homeostasis and disease: from human mutations to treatments. Nat Med. 2013;19(2): 179-192.

[12] Manolagas SC. Wnt signaling and osteoporosis. Maturitas.2014;78(3):233-237.

[13] Wang YP, Li YP, Paulson C, et al. Wnt and the Wnt signaling pathway in bone development and disease. Front Biosci (Landmark Ed), 2014;19: 379-407.

[14] 李府,沈柏均.间充质干细胞的来源、特性及临床应用前景[J].国外医学(儿科学分册), 2004, 31(2): 104-107.

[15] Satija NK, Gurudutta GU, Sharma S, et al. Mesenchymal stem cells: molecular targets for tissue engineering. Stem Cells Dev.2007;16(1): 7-23.

[16] 廖庆辉,黄震,蔡德鸿.抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2009, 13(1): 88-91.

[17] 张建萍.不同浓度地塞米松在体外定向诱导分化兔骨髓间充质干细胞为成骨细胞的实验研究[J]. 现代中西医结合杂志, 2012, 21(24): 2642-2645+2691.

[18] 曾高峰,宗少晖,邹斌,等.黄精多糖对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中PINP和BMP-2表达的影响[J].天然产物研究与开发, 2014, 26(8): 1188-1192.

[19] 文珠,胡国柱,俞火,等.黄精多糖干预长春新碱抑制骨髓基质细胞增殖的研究[J].中华中医药杂志, 2011, 26(7): 1630-1632.

[20] Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM. Wnt signaling in osteoblasts and bone diseases. Gene. 2004;341: 19-39.

[21] Rawadi G, Roman RS. Wnt signalling pathway: a new target for the treatment of osteoporosis. Expert Opin Ther Targets.2005;9(5): 1063-1077.

[22] Wang PP, Zhu XF, Yang L, et al. Puerarin stimulates osteoblasts differentiation and bone formation through estrogen receptor, p38 MAPK, and Wnt/β-catenin pathways. J Asian NatProd Res.2012;14(9): 897-905.

[23] Pan LL,Shi XG,Liu S,et al.Fluoride promotes osteoblastic differentiation through canonical Wnt/β-catenin signaling pathway. Toxicol Lett.2014;225(1): 34-42.

[24] Zhou HB,Shang LS,Li X, et al.Resveratrol augments the canonical Wnt signaling pathway in promoting osteoblastic differentiation of multipotent mesenchymal cells. Experimental Cell Research.2009;315(17): 2953-2962.

引言

材料方法

1.1 设计以细胞为观察对象的体外平行对照实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年8月在广西医科大学医学实验中心完成。

1.3 材料

细胞：C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(P6)，购自广州赛业生物科技有限公司。

黄精多糖调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化实验用试剂：
试剂	来源
黄精多糖，纯度98%	陕西慈缘生物技术有限公司
L-DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶	美国Gibco公司
抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松	美国Sigma公司
碱性磷酸酶检测试剂盒	上海碧云天公司
茜素红染液	广州赛业公司
RNAiso试剂	大连Takara
兔源抗β-catenin抗体	Abcam公司
兔源抗β-actin抗体、Dylight 680标记的山羊抗兔IgG	EarthOx公司
TCF荧光素酶报告质粒试剂盒	millipore公司
海肾荧光素酶载体pRL-TK、双荧光素酶报告基因检测试剂盒	Promega公司

1.4 实验方法

1.4.1 成骨诱导培养液的配制、实验分组及细胞诱导分化 ①传统成骨诱导培养液：含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素、抗坏血酸 50 mg/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，地塞米松10^-7 mol/L的L-DMEM培养基。②实验分组：分为阴性对照组(成骨诱导培养液)和黄精多糖实验组(含黄精多糖终浓度为5，10，25，50 mg/L的等量成骨诱导培养液)，共5组。③诱导分化：将消化下来的骨髓间充质干细胞用完全培养基重悬，按照2×10⁴/cm²的细胞密度接种于细胞培养瓶或培养板(茜素红矿化结节实验事先用0.1%明胶包被孔板)中培养，当细胞融合度达到70%时，更换诱导培养基：成骨诱导培养液+黄精多糖(0，5，10，25，50 mg/L)，每两三天换液1次，倒置显微镜下观察细胞的形态变化及生长状况。

1.4.2 碱性磷酸酶活性检测在24孔板连续干预14 d后，用预冷的PBS洗涤2遍，每孔加入500 μL 0.1%的Triton X-100/PBS，4 ℃冰箱放置过夜，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清。根据碱性磷酸酶检测试剂盒生产说明书，将收集的上清液与显色底物在96孔板中混合，37 ℃孵育5 min，终止反应，用酶标仪检测405 nm的A值，根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性，参考BCA法测定蛋白质浓度校正结果作为相对活性。

1.4.3 茜素红染色检测矿化结节在12孔板中干预28 d后，用40 g/L多聚甲醛在室温下固定细胞20min，加入茜素红染液于37 ℃染色5 min，倒置相差显微镜下观察并拍照细胞外基质矿化结节。记录低倍镜(×40)下进行矿化结节计数，每孔细胞随机计数5个视野。用Image J图片处理软件计算矿化结节面积比。

1.4.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测成骨相关基因干预14/21 d后，按 RNAiso试剂说明书提取细胞总RNA，紫外可见分光光度计检测浓度及纯度。按照反转录试剂盒(Thermo fisher)说明书将2.5 μg总RNA反转录合成cDNA。然后根据ROCHE公司荧光定量试剂盒说明书将cDNA加入PCR反应体系(20 μL)，使用ABI 7500 实时荧光定量仪行qRT-PCR反应。每个样品做3个复孔，重复3次实验，结果用RQ=2^-^平均^??^CT计算RNA相对表达量。所有引物均由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.4.5 Western Blot检测β-catenin的蛋白表达 72 h后收集细胞，用RIPA裂解液(碧云天)提取总蛋白，用BCA法检测浓度。每孔上40 μg蛋白样跑凝胶电泳，将分离胶上的目的蛋白在电转液中以恒压100 V、90 min条件下转移至0.45 μm硝酸纤维素膜(NC膜)，5%脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗(anti-β-catenin 1∶1 000、anti- β-actin 1∶1 000) 4 ℃过夜，37 ℃避光孵育Dylight 680标记的荧光二抗(1∶500)1 h，LI-LOR Odyssey红外荧光扫描仪扫膜成像，Image J软件进行图片条带灰度分析。

引物序列：
碱性磷酸酶	上游引物： 5’- CCA ACT CTT TTG TGC CAG AGA -3’，下游引物：5’-GGC TAC ATT GGT GTT GAG CTT TT-3’；
Runx2	上游引物：5’-TTC TCC AAC CCA CGA ATG CAC-3’ ，下游引物：5’-CAG GTA CGT GTG GTA GTG AGT-3’；
骨钙素	上游引物：5’-GAG GGC AAT AAG GTA GTG AAC AGA-3’ 下游引物：5’-AAG CCA TAC TGG TTT GAT AGC TCG-3’；
β-actin 作为内参	上游引物：5’-ATG GCT GGG GTG TTG AAG GT-3’ ，下游引物：5’-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AA-3’；
β-catenin	上游引物：5’-GCG TGG ACA ATG GCT ACT CAA G-3’，下游引物：5’-GTC ATT GCA TAC TGC CCG TCA A -3’。

1.4.6 双荧光素酶报告基因的检测转染质粒前1 d将细胞以1×10⁴/孔密度接种至96孔板中，根据lipofectamine 3000(Invitrogen)操作说明书向每孔中共转染100 ng TOPFlash或FOPFlash和20 ng pRL-TK质粒。转染6-8 h后按前述实验分组更换诱导液，继续培养48 h，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书裂解细胞，用单管式化学发光检测仪检测每孔中萤火虫荧光值和海肾荧光值，二者的比值即为该质粒转染细胞所得的荧光素酶的相对活性。每实验组每种质粒平行做3个复孔，取平均值，重复3次实验。

1.5 主要观察指标观察细胞形态学变化，检测碱性磷酸酶活性，矿化结节数目和面积分数，检测碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素mRNA表达，β-catenin基因和蛋白表达水平，双荧光素酶报告基因(TOPFlash和FOPFlash)的表达。

1.6 统计学分析实验数据以x(_)±s表示，多组样本均数采用SPSS 16.0统计软件单因素方差分析，用LSD检验进行组间比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞是从C57BL/6小鼠骨髓基质中分离出来的具有多向分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞，在特定诱导条件下，它可以分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种不同功能的细胞，形成多种组织和器官^[14]。小鼠骨髓间充质干细胞体外培养潜伏期短，细胞增殖快，可作为组织工程的种子细胞^[15]。在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松的联合诱导下骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化^[16]。诱导体系中的抗坏血酸不仅可以促进骨髓间充质干细胞贴壁，还可以促进体外培养的骨髓间充质干细胞合成胶原和骨形成蛋白，促进骨基质矿化，也能调节碱性磷酸酶的活性；β-甘油磷酸钠是骨形成矿化阶段中羟磷灰石形成的原料，在培养液能迅速被碱性磷酸酶水解，释放大量磷酸离子，促进钙盐的沉积和结节钙化；地塞米松可诱导骨髓间充质干细胞表达骨钙蛋白、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原，促进骨基质的合成和矿化，促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化^[16-17]。正是由于含这3种试剂的成骨诱导培养基能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的特性，此次实验以C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞为细胞模型，在成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化的过程中加入不同质量浓度的黄精多糖，分析黄精多糖处理对骨髓间充质干细胞骨向分化的影响。

在成骨诱导培养基作用下，骨髓间充质干细胞可向成骨细胞分化，在骨形成过程中历经细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化3个阶段。在细胞增殖期、成骨分化的早期主要是Ⅰ型胶原蛋白和碱性磷酸酶表达，因此碱性磷酸酶被认为是细胞外基质成熟的早期标志。当成骨分化晚期，当细胞进入矿化期，碱性磷酸酶表达量降低、活性下降，与细胞外基质发生矿化相关的基因表达达到高峰，如骨桥蛋白、骨钙素。骨钙素等非胶原蛋白分泌至细胞外基质中，与钙、磷结合，促进基质矿化。Runx2是主要的转录因子，在成骨细胞分化和骨形成中扮演着重要的角色。Runx2已被证实通过特定的增强子区能直接刺激骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中相关基因的转录，如骨钙素、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原蛋白。Runx2还是骨形成过程中激活经典Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因。本研究以骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基作用下，同时加入不同质量浓度(0，5，10，25，50 mg/L)黄精多糖进行干预，黄精多糖以剂量依赖性的方式提高细胞碱性磷酸酶活性，显著增强骨髓间充质干细胞的矿化能力，而且能明显促进成骨分化过程中碱性磷酸酶、骨钙素和Runx2 mRNA的表达水平，在25 mg/L质量浓度下这些效应达到最大。结果表明黄精多糖在质量一定浓度下对体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化具有促进作用，但过高的质量浓度(50 mg/L)会抑制骨向分化的促进作用。实验结果证实了前期对黄精多糖抗骨质疏松作用的研究，如黄精多糖治疗去卵巢骨质疏松症大鼠模型可以抑制骨吸收，改善骨质流失，防止骨质疏松症^[8]；黄精多糖可促进骨髓间充质干细胞骨向分化过程中骨形态发生蛋白和Ⅰ型前胶原N端前肽(PINP)的表达^[18]；黄精多糖具有促进小鼠骨髓基质细胞(骨髓间充质干细胞) 生长及干预长春新碱对骨髓间充质干细胞增殖的抑制的作用，表明黄精多糖具有促进骨髓间充质干细胞骨向分化的作用^[19]。因此，可以认为黄精多糖有望成为治疗骨质疏松症的一种新兴发展的药物。

Wnt信号分子通过几个不同的途径调节细胞生长、分化、功能以及死亡，尤其是在成年人骨骼的发育和稳态的调节发挥重大的作用，其中Wnt/β-catenin信号通路被认为是Wnt信号传导中研究最清楚最经典的通路，是一条在生物进化中极为保守的信号通路^[20-21]。近年来研究显示Wnt/β-catenin信号通路与成骨分化、骨形成和骨质疏松的治疗密切相关。细胞外Wnt信号蛋白通过与膜受体结合激活经典Wnt/β-catenin信号通路。当没有Wnt信号分子存在时，β-catenin被APC复合体中的CK1和GSK3β磷酸化后进入蛋白酶解途径。当细胞外Wnt配体蛋白与细胞表面特异性七次跨膜受体卷曲蛋白(Frizzled，FZD) 和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(the low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)复合物结合后，酪蛋白激酶(caseinkinase 1，CK1)过度磷酸化Disheveled(Dvl)，使Dvl获得了与FRAT和FZD 更强的亲和性，引起 LRP5/6-Axin-FRAT 复合物的形成，导致支架蛋白(axisinhibition，Axin)降解，使APC-Axin-GSK3β复合物无法分解β-catenin蛋白而在细胞质中积累。在没有β-catenin的状态下，TCF与Croucho、CtBP、Coop等抑制性因子结合，募集组蛋白脱乙酰酶(HDAC)，使下游基因的转录被抑制；在细胞质中稳定累积的β-catenin转移入细胞核，作为转录共激活因子与TCF/LEF相互作用，可以替换Croucho和Coop与TCF结合，介导Wnt通路下游靶基因Runx2等的表达。

Wang等^[22]研究发现葛根素可以上调经典Wnt/β- catenin信号通路的活化水平，从而增强碱性磷酸酶的活性、Ⅰ型胶原蛋白的分泌和成骨细胞矿化结节形成，促进成骨细胞分化和骨组织形成。Pan等^[23]在研究氟化物对大鼠原代培养成骨细胞影响时发现，氟化物通过增加Akt和GSK-3β的磷酸化水平从而抑制GSK-3β活性，激活经典Wnt信号通路中β-catenin在核内的积累，促进成骨细胞分化。Zhou等^[24]研究发现，在成骨条件培养基的诱导下，白藜芦醇通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进ST2细胞向成骨细胞的分化和骨形成。正是由于这些对骨形成的重要作用，Wnt/β-catenin信号通路成为了治疗骨质疏松症的药物研究的重要方向，Wnt/β-catenin信号通路中的多个环节都可以作为研究药物调节的靶点。此次研究通过检测骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中β-catenin 基因表达水平和蛋白表达水平，结果显示，黄精多糖以剂量依赖性的方式上调β-catenin的表达，通过双荧光素酶报告基因检测系统发现黄精多糖可以还激活含有TCF转录因子结合位点的荧光素酶报告基因(TOPFlash)的表达，增强β-catenin/TCF的转录活性。

综合实验研究结果，可以认为黄精多糖通过调节Wnt/β-catenin信号通路下游核心分子β-catenin的表达，激活下游靶基因的转录，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，但并不能排除黄精多糖也可以对其他靶点的作用或者通过激活其他信号通路来促进骨形成。因此，黄精多糖有望成为治疗骨质疏松症的新兴药物。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黄精多糖调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

Polygonatum sibiricum polysaccharide regulates osteoblastic differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells

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[1]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[2]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[3]	李中峰, 陈明海, 凡一诺, 魏秋实, 何伟, 陈镇秋. 右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1256-1263.
[4]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[5]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[6]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[7]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[8]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[9]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[10]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[11]	侯广原, 张继学, 张志军, 孟祥晖, 段文, 高维陆. 骨水泥强化椎弓根螺钉内固定治疗伴骨质疏松腰椎退行性疾病的1年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 878-883.
[12]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[13]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[14]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[15]	肖方骏, 陈树东, 栾继耀, 侯宇, 何坤, 林定坤. 丹参干预骨质疏松症：网络药理学解释的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 772-778.