三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (11): 1544-1560.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.004

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三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化

杨萌，邵博，龚忠诚，宁晓婷，刘慧，克热木•阿巴斯，凌彬，尹小朋, 王冰，胡露露，王玥，胡鑫，林兆全

新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2016-01-18 出版日期:2016-03-11 发布日期:2016-03-11
通讯作者: 龚忠诚，博士，教授，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:杨萌，男，1989年生，山西省临汾市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事颞下颌关节基础研究。并列第一作者：龚忠诚，男，1974年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，博士，教授，副主任医师，主要从事颞下颌关节的临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31260229)；新疆维吾尔自治区青年科技创新人才培养工程项目(2014721046)

Chondrocyte-like differentiation of synovial mesenchymal stem cells co-cultured with chondrocytes on a three-dimensional scaffold

Yang Meng, Shao Bo, Gong Zhong-cheng, Ning Xiao-ting, Liu Hui, Rekemu Abasi, Ling Bin, Yin Xiao-peng, Wang Bing, Hu Lu-lu, Wang Yue, Hu Xin, Lin Zhao-quan

Oncological Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2016-01-18 Online:2016-03-11 Published:2016-03-11
Contact: Gong Zhong-cheng, M.D., Professor, Associate chief physician, Oncological Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Yang Meng, Studying for master’s degree, Oncological Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Gong Zhong-cheng, M.D., Professor, Associate chief physician, Oncological Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Yang Meng and Gong Zhong-cheng contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31260229; the Project for Training Youth Talents of Scientific Innovation in Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2014721046

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

细胞支架复合物：由细胞与支架材料共同组成，支架材料为细胞生长、增殖、分化提供立体空间，同时对机体无毒、无害，不会引起炎症反应，细胞可由单一细胞组成或两种细胞混合培养，但一定含有具有多向分化潜能的间充质干细胞。

滑膜间充质干细胞的多向分化潜能：滑膜来源间充质干细胞具有高度多向分化潜能，而且其潜能不受细胞代数、供体年龄或细胞是否冷冻复苏的影响，相同条件下滑膜间充质干细胞成软骨能力最强，在病理状态下出现的滑膜性软骨化进一步支持滑膜的软骨形成潜能。滑膜间充质干细胞在特定条件下还可分化为骨组织和脂肪组织，除此以外，滑膜间充质干细胞在体外和体内实验中还具有生肌功能。

背景：体外环境下软骨细胞与滑膜间充质干细胞共培养能够使滑膜间充质干细胞向软骨分化，关于体内环境下细胞共培养诱导干细胞分化的研究很少。

目的：拟将滑膜间充质干细胞/软骨细胞与壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料植入大鼠背部皮下，了解细胞复合支架在体内向软骨分化的情况。

方法：取SD大鼠膝关节滑膜组织及软骨组织，用酶消化法获得滑膜间充质干细胞及软骨细胞分别进行培养。实验设单纯软骨细胞组，单纯滑膜间充质干细胞组，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞为1︰2组，无细胞材料组，取第3代滑膜间充质干细胞及第2代软骨细胞培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中移植于SD大鼠皮下，4，8周时取材进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色和免疫组织化学检测。

结果与结论：植入4，8周后，细胞支架材料保持圆盘状，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞为1︰2组可见细胞及细胞基质Ⅱ型胶原阳性表达，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞为 1︰2组蛋白聚糖阳性表达，结果表明两种细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中，在体内环境下能够形成软骨样组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-3010-4017(龚忠诚)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 滑膜间充质干细胞, 软骨细胞, 共培养技术, Ⅱ型胶原, 蛋白聚糖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The co-culture of chondrocytes and synovial mesenchymal stem cells can induce the cartilage differentiation of synovial mesenchymal stem cells in vitro, but the cell differentiation induced by co-culture in vivo is rarely reported. OBJECTIVE: To investigate the chondrogenic differentiation of synovial mesenchymal stem cells co-cultured with chondrocytes on the chitosan/type I collagen composite scaffolds after being transplanted into the subcutaneous layer of Sprague-Dawley rats.
METHODS: The synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes harvested from the synovial membrane and articular cartilage of Sprague-Dawley rats were obtained by enzyme digestion method and cultured respectively. Passage 3 synovial mesenchymal stem cells and passage 2 chondrocytes, which were divided into four groups: group A (chondrocytes alone), group B (synovial mesenchymal stem cells alone), group C (ratio of synovial mesenchymal stem cells:chondrocytes=1:2) and group D (scaffold material without cells), were cultured on chitosan/type I collagen composite scaffolds and transplanted into the subcutaneous layer of rats followed by morphological observation and immunohistochemical staining at 4 and 8 weeks. .
RESULTS AND CONCLUSION: After 4 and 8 weeks, the discoid-like scaffold was visible. The immunohistochemical staining of type II collagen and the toluidine blue staining of aggrecan were significantly positive in groups A and C. These results show that the co-culture of synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes on the scaffold in vivo can form cartilage-like tissues.

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杨萌，邵博，龚忠诚，宁晓婷，刘慧，克热木•阿巴斯，凌彬，尹小朋, 王冰，胡露露，王玥，胡鑫，林兆全. 三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(11): 1544-1560.

Yang Meng, Shao Bo, Gong Zhong-cheng, Ning Xiao-ting, Liu Hui, Rekemu Abasi, Ling Bin, Yin Xiao-peng, Wang Bing, Hu Lu-lu, Wang Yue, Hu Xin, Lin Zhao-quan . Chondrocyte-like differentiation of synovial mesenchymal stem cells co-cultured with chondrocytes on a three-dimensional scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(11): 1544-1560.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析所有实验动物至实验结束均无死亡。

2.2 实验动物及标本大体观察实验动物术后自然苏醒，无死亡，手术创面未见感染，术后2周至3周，缝线部分自然脱落，部分缝线一直保留在手术区至实验结束。SD大鼠背部创面无渗出、裂开、溃疡等。4，8周后均可以见到细胞复合支架在SD大鼠皮下保持原有的圆盘状外形，切开SD大鼠背部皮肤，可见细胞支架复合物表层有一层筋膜包绕，易于分离取出，同时，可见细胞支架复合物表面有小血管附着，细胞支架复合物质地较韧，见图1。

2.3 细胞支架复合物苏木精-伊红染色 4周时，4组细胞支架复合物中均有细胞，细胞及细胞外基质成分多分布在支架材料外层，中心少见，8周时，明显可见细胞及细胞外基质分布较4周时更广泛。4周时，各组未发现明显的软骨细胞样表型，8周时，可见单纯滑膜间充质干细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组有软骨细胞样表型，深红色为支架材料，见图2。

2.4 细胞支架复合物甲苯胺蓝染色 4周时，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组可见细胞核染色为深蓝色，细胞质和细胞外基质均为蓝色，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组可见散在类软骨样组织。8周时，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组类软骨样组织明显增多，细胞质和细胞外基质均呈蓝染强阳性，单纯滑膜间充质干细胞组未见明显改变，见图3。

2.5 细胞支架复合物免疫组化染色 4周时，单纯软骨细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组Ⅱ型胶原表达呈阳性，镜下可见细胞质及细胞外基质有棕黄色颗

粒分布，8周时，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组细胞质中棕黄色颗粒深染，细胞和细胞外基质中分布大量棕黄色颗粒，见图4。

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引言

创伤、关节退行性病变、关节先天性异常是造成关节软骨损伤的3大因素，关节软骨因缺少血供和用于修复损伤的未分化干细胞而表现出有限的自我修复能力，已成为临床关注的焦点。干细胞治疗已经被用于治疗软骨损伤。间充质干细胞易于分离培养，有自我复制和多向分化能力，是细胞治疗潜在的资源^[1-2]。研究证实滑膜间充质干细胞与软骨细胞来源于同一种前体细胞，基因谱表达相似^[3]，与鼠或人的骨髓、骨膜、脂肪、骨骼肌来源间充质干细胞相比，滑膜间充质干细胞具有更高的增殖和成软骨能力^[4-5]。

以往研究将大量的精力投入在既具有结构力学又能够释放生物信号，用于细胞分化和组织生长的生物活性材料^[6-10]，希望通过材料本身来诱导干细胞分化。近年来将干细胞与其他成熟细胞共同培养诱导干细胞分化的研究越来越普遍^[11]，有文献报道软骨细胞生长的微环境及分泌的细胞因子通过细胞间作用能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化及增加软骨细胞外基质的合成^[12-14]。课题组前期研究表明滑膜间充质干细胞与软骨细胞共同培养，利用软骨细胞分泌的可溶性细胞因子可以诱导大鼠滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化^[15]。

组织工程另外一个重要的方面是支架材料，三维支架材料能够维持支架材料内部细胞的形态并且促进组织再生，壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料能够提供三维生长空间，利用软骨细胞分泌生长因子及细胞间的相互作用可以诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化^[16]。实验拟将滑膜间充质干细胞/软骨细胞与壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料植入大鼠背部皮下，了解细胞复合支架在体内向软骨分化的情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体内对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2013年12月至2015年6月在新疆医科大学第一附属医院临床研究院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康雄性SD大鼠，体质量约180 g，SPF级，由新疆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2003-001。实验过程中对动物的处置遵守《关于善待实验动物的指导性意见》相关要求。

1.3.2 实验试剂和设备 HG-DMEM(Gibco公司)，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青/链霉素(Hyclone公司)，DAB显色试剂盒(中杉金桥)，Ⅱ型胶原免疫组织化学试剂盒(博士德公司)，正置显微镜、石蜡包埋机、石蜡切片机(Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 SD大鼠滑膜间充质干细胞的分离与培养^[17] 雄性SD大鼠2只，称质量，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，备皮，用体积分数75%乙醇严格消毒术区，铺洞巾，于大鼠膝关节处切开，钝性分离，至滑膜组织处，取膝关节外包裹的滑膜组织，浸没于10倍体积含 1 000 U/mL双抗(链霉素、青霉素)的PBS中，放于冰盒。移入超净台前，乙醇棉球消毒管壁。剪碎组织，大小约1 mm×1 mm，PBS冲洗3遍，加入10倍体积的0.4% Ⅰ型胶原酶，放入摇床(37 ℃，200 r/min)消化4 h，滤过，回收细胞于15 mL离心管，PBS冲洗，离心3遍，弃上清液，使用HG-DMEM完全培养基(含体积分数15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素，200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸)悬浮细胞，细胞计数，以2×10⁵/cm²的细胞密度接种于培养皿，放入37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱，每隔48 h换液，待细胞生长铺满培养皿的85%-90%时进行传代，以(6-8)×10³/cm²的细胞密度接种于培养皿，使用HG-DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素，200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸)，根据生长情况换液，传代培养。

1.4.2 软骨细胞分离与培养雄性SD大鼠2只，称质量，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，备皮，用体积分数75%乙醇严格消毒术区，铺洞巾，于大鼠后肢根部切开，钝性分离至股骨头，取下软骨组织，浸没于10倍体积含1 000 U/mL双抗(链霉素、青霉素)的PBS中，放于冰盒。移入超净台前，乙醇棉球消毒管壁。剪碎组织，大小约1 mm×1 mm，PBS冲洗3遍，加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，放入摇床(37 ℃，200 r/min)消化过夜，回收细胞于15 mL离心管，PBS冲洗，离心3遍，弃上清液，使用HG-DMEM完全培养基(含体积分数15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素， 200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸)悬浮细胞，细胞计数，以2×10⁵/cm²的细胞密度接种于培养皿，放入37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱，每隔48 h换液，待细胞生长铺满培养皿的85%-90%时进行传代，以(6-8)×10³/cm²的密度接种于培养皿，使用HG-DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素，200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸)，根据生长情况换液，传代培养。

1.4.3 壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料制备详见参考文献[18]。

1.4.4 滑膜间充质干细胞、软骨细胞培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架将无菌的壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料放于24孔板中，消化第3代滑膜间充质干细胞与第2代软骨细胞，计数，每个支架材料接种1×10⁵个细胞，共分为4组：单纯软骨细胞组，单纯滑膜间充质干细胞组，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组，空支架组，培养24 h，供后续体内实验用。

1.4.5 支架材料的回植及标本制备将4组细胞支架复合物移植于16只SD大鼠背部皮下两侧，4，8周后(每个时间点8只)，麻醉后断颈处死大鼠，取出细胞支架复合物，大体观察植入物形态、大小、色泽。然后将取出的细胞支架复合物常规进行石蜡切片，进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色。

1.4.6 苏木精-伊红染色苏木精染片10 s，至流水中洗片10 min，待切片返蓝，使用盐酸乙醇分化1 s，再次流水洗片10 min，伊红染片5 s，重复流水洗片10 min，经体积分数为70%，80%，90%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ，100%Ⅱ梯度乙醇脱水，每个梯度10 s，二甲苯透明，通风橱内切片干燥，中性树脂封固，正置显微镜下观察采图。

1.4.7 免疫组化染色切片经脱蜡后自来水冲洗3 min，蒸馏水冲洗3 min，PBS冲洗3次，每次3 min，现配体积分数为3%双氧水孵育10 min，蒸馏水、PBS各洗片3次，每次3 min，柠檬酸修复10 min，冷却至室温，PBS洗3遍，每次3 min，进口山羊血清封闭30 min(37 ℃)，滴加一抗(稀释比1︰150)，经4 ℃孵育过夜，室温放置1 h，PBS洗片3次，每次5 min，滴加二抗，37 ℃孵育25 min，PBS清洗3次，每次5 min，使用DAB显色剂显色，自来水终止显色，放入苏木精染缸染色5 min，自来水洗片3次，每次3 min，洗片后盐酸乙醇分化1 s，PBS返蓝5 min，经体积分数为80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ梯度各脱水 5 s，二甲苯透明，通风橱内风干，中性树脂封固，正置显微镜下观察采图。

1.4.8 甲苯胺蓝染色切片脱蜡(二甲苯液A、B脱蜡，各30 min)，乙醇梯度脱水(体积分数为70%，80%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ，100%Ⅱ)，各5 s，蒸馏水洗片

3 min，常温下，甲苯胺蓝染色10 min，自来水洗片，经体积分数为80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ梯度脱水，各5 s，二甲苯透明，通风橱内风干，中性树脂封固，正置显微镜下采图。

1.5 主要观察指标显微镜下观察细胞在支架材料中的分布以及软骨细胞外基质、软骨特异性标记物Ⅱ型胶原的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

各种研究表明，可以通过微创关节镜技术获得滑膜组织^[19-22]，滑膜细胞能够自我修复在外科手术切除的部分滑膜组织，再次表明其有很强的再生能力^[23]，是作为软骨组织工程非常有优势的种子细胞。实验结果显示，除空支架组外，其余3组每个支架材料上细胞总数相同，在4周时苏木精-伊红染色发现4组细胞多分布于材料边缘，8周时，细胞向材料中心生长，单纯滑膜间充质干细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组的细胞和细胞基质几乎分布整个支架材料，单纯软骨细胞组中心分布细胞少。软骨细胞增殖能力较滑膜细胞差，单纯滑膜间充质干细胞组、滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组因含有滑膜细胞，在相同的时间内向材料中心生长的能力更强。作为组织工程的重点，支架材料应该具

有良好的生物相容性。之前的文献报道，以壳聚糖/Ⅰ型胶原复合物作为支架材料，因其二者属于天然生物材料，无细胞毒性，有着孔隙均匀，孔径大小较一致，能够大量生产等优点，能够满足软骨组织工程要求^[24-28]，实验结束时，植入SD大鼠背部的细胞支架复合物完整，无液化、吸收现象，SD大鼠背部没有出现皮肤创面感染、裂开、粘连现象，取出时被一层筋膜样组织包绕整个细胞支架复合物，说明壳聚糖良好的组织相容性还是值得肯定的。以往研究重点多集中在制备出仅仅包含胶原和黏多糖成分或者具有细胞外基质成分的3D支架材料^[29-31]，研究表明软骨细胞与干细胞共同培养能够增加软骨基因表达和细胞外基质沉积^[32]。此实验利用软骨细胞自分泌或旁分泌细胞因子来诱导滑膜间充质干细胞向软骨分化，因Ⅱ型胶原是软骨的特异性分子标志物，免疫组织化学检测可以观察到Ⅱ型胶原在细胞周围的基质中及细胞浆中都有阳性表达，8周时细胞支架复合物中的表达量较4周时明显增多，在8周时，滑膜间充质干细胞︰软骨细胞1︰2组较单纯软骨细胞组表达量更多。

综上所述，壳聚糖/Ⅰ型胶原支架材料提供三维环境，利用软骨细胞自分泌和旁分泌的细胞因子以及细胞间的相互作用，能够使滑膜间充质干细胞发生软骨分化，细胞支架复合物中的种子细胞在体内环境下，能够继续生长、增殖、分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化

Chondrocyte-like differentiation of synovial mesenchymal stem cells co-cultured with chondrocytes on a three-dimensional scaffold

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