Notch1和Bmi-1蛋白在肺癌组织中的表达及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.013

摘要/Abstract

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文题释义：

细胞信号转导通路：在细胞中，各种信号转导分子相互识别、相互作用，将信号进行转换和传递，构成信号转导通路。当外界环境变化时，单细胞生物可以直接做出反应，多细胞生物则通过复杂的信号传递系统来传递信息，从而调控机体活动。传导方式包括相邻细胞直接接触、细胞分泌各种化学物质来调节其他细胞代谢和功能。

Notch1：是PCG基因家族的一员，最早发现于小鼠B细胞淋巴瘤中，被当做c-myc的协同癌基因，与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关。当Notch1受体与其配体结合时，Notch1受体将脱离细胞膜并进入细胞核内，与转录调节因子相互作用，最终激活靶基因。

背景：有研究发现，Notch通路与Bmi-1基因均有调节干细胞自我更新的能力，二者功能障碍可能与肿瘤的发生有很大的关系。
目的：探讨Notch1和Bmi-1蛋白在肺癌组织中的表达水平及其临床意义。
方法：获取87例肺癌患者术后肺癌组织(肺癌组)、40例心胸外科开胸手术和肺部纤维支气管镜检查所取经病理证实的正常肺组织(正常组)作为研究对象。采用免疫组织化学SP法检测两组标本中的Notch1和Bmi-1蛋白表达情况，并分析Notch1、Bmi-1蛋白表达与肺癌患者临床病理特征的关系。
结果与结论：肺癌组Notch1、Bmi-1蛋白表达阳性率分别为61%、47%，均显著高于正常组标本(P < 0.05)；肺癌组Notch1蛋白表达与Bmi-1蛋白表达具有显著的正相关关系(r=0.567，P < 0.001)。不同性别、不同病理类型患者的Notch1、Bmi-1蛋白阳性表达率差异无显著性意义(P > 0.05)；低分化肺癌、发生淋巴结转移、TNM分期Ⅲ-Ⅳ级患者的Notch1、Bmi-1蛋白阳性表达率显著高于高中分化肺癌、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ、Ⅱ级患者(P < 0.05)。结果表明Notch1基因和Bmi-1基因可能与肺癌的发生、发展有一定的关系。

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ORCID: 0000-0002-0923-5039(蔡华荣)

关键词: 实验动物, 心肺损伤及修复动物模型, 肿瘤干细胞, Notch1基因, Bmi-1基因, 肺癌组织

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that Notch pathway and Bmi-1 gene both have the ability to regulate stem cell self-renew. Functional dysfunction of the both may have a great relationship with tumorigenesis.
OBJECTIVE: To investigate the expression and clinical significance of Notch1 and Bmi-1 protein in lung tissue.
METHODS: Eighty-seven lung cancer tissue samples (lung cancer group) and forty pathologically confirmed normal lung tissue samples (normal group) were obtained from related surgeries and included as research objects. The protein expression of Notch1 and Bmi-1 in specimens of these two groups was measured by immunohistochemistry SP method. The relationship between Notch1 and Bmi-1 protein expression and clinicopathological features of lung cancer patients was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive rate of Notch1, Bmi-1 protein expression was respectively 61% and 47%, which was significantly higher in the lung cancer group than that in the normal group (P < 0.05). In the lung cancer group, Notch1 protein expression was significantly positively correlated with Bmi-1 protein expression (r=0.567, P < 0.001). There were no significant differences in Notch1 and Bmi-1 protein expression rates between different genders and different pathological types of patients (P < 0.05). The Notch1 and Bmi-1 protein positive expression rates in poorly-differentiated, TNM stage III-IV lung cancer patients with lymph node metastasis were significantly higher than those in well- and moderately-differentiated, TNM stage I-II lung cancer patients without lymph node metastasis (P < 0.05). These results demonstrate that Notch1 and Bmi-1 protein may have certain relationship with the occurrence and development of lung cancer.

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蔡华荣，江跃全. Notch1和Bmi-1蛋白在肺癌组织中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(5): 683-687.

Cai Hua-rong, Jiang Yue-quan . Expression and significance of Notch1 and Bmi-1 protein in lung cancer tissue[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(5): 683-687.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] 陈实,李德川,刘华.姜黄素诱导人肺癌细胞凋亡及其机制[J].武汉大学学报:医学版,2012,33(4):507-510,527.
[2] 李海燕,刘红,王静,等.瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的价值[J].中国老年学杂志,2012,32(1):46-48.
[3] 马莉,高晓虹,王猛,等.肺癌影响因素病例对照研究[J].中国公共卫生,2012,28(1):90-91.
[4] 曾庆岳,陶红艳,万毅新,等.慢性阻塞性肺疾病与肺癌关系临床研究[J].中国现代医学杂志,2012,22(12):68-71.
[5] 李娜,王燕.23例肺癌并发肺栓塞的临床分析[J].中国肺癌杂志, 2014,17(3):254-259.
[6] Bridges E, Oon CE, Harris A. Notch regulation of tumor angiogenesis. Future Oncol. 2011;7(4):569-588.
[7] 王利祥,华子春. Notch信号通路研究进展[J].中国医药生物技术,2009,4(3):224-226.
[8] 何晓彬,赖敏.NF-κB、Notch-1和Ki-67在结肠癌中的表达及其意义[J].重庆医学,2012,41(3):230-232.
[9] Fan RH, Li J, Wu N, et al. Late SV40 factor: a key mediator of Notch signaling in human hepatocarcinogenesis. World J Gastroenterol. 2011;17(29):3420-3430.
[10] 王依满,杨晶金,权明明,等. HES1与ICN1、Notch1在胃癌组织中的表达及其意义[J]. 中国卫生检验杂志,2012,22(1):87-89.
[11] Herranz H, Milán M. Signalling molecules, growth regulators and cell cycle control in Drosophila. Cell Cycle. 2008;7(21): 3335-3337.
[12] Donnem T, Andersen S, Al-Shibli K, et al. Prognostic impact of Notch ligands and receptors in nonsmall cell lung cancer: coexpression of Notch-1 and vascular endothelial growth factor-A predicts poor survival. Cancer. 2010;116(24): 5676-5685.
[13] 张超,姚志勇,朱鸣阳,等. MicroRNA-34a通过Notch1对膀胱肿瘤细胞株T24增殖的影响[J].解放军医学杂志,2012,37(5): 426-430.
[14] 刘健,万磊,程园园,等.佐剂关节炎大鼠肺功能与Treg、Notch信号通路的关系[J].中国免疫学杂志,2012,28(9):825-830.
[15] 吴健,张昶,朱亚宁.Bmi-1蛋白在食管鳞状细胞癌中表达及临床意义[J].中国肿瘤临床,2012,39(13):911-913.
[16] 郑伟,吉巧红,李三强,等.Bmi-1、Notch1在乳腺癌中的表达及意义[J].河南科技大学学报:医学版,2014,32(1):7-9.
[17] 魏东,邹浩,王琳,等.靶向miRNA干扰Bmi-1诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3表达的研究[J].中国生物工程杂志,2013, 33(12):1-8.
[18] 谢爱民. Notch1及Bmi-1在肺癌干细胞中表达的相关性及临床意义[J].实用医学杂志,2014,30(7):1104-1107.
[19] 武向梅,余华荣,卜友泉,等. 沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性的研究[J].生命科学研究,2012,16(2): 158-163.
[20] 徐珍珍,吴顺泉,战榕.Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立[J].中国实验血液学杂志,2012, 20(2): 473-477.
[21] 胡花丽,冯爱强,张彦武,等. Bmi-1及Mel-18在乳腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系[J].中国普通外科杂志, 2012, 21(11): 1410-1414.
[22] 廖雯婷,崔艳梅,丁彦青. Bmi-1PTEN及E-Cadherin在结直肠癌中的表达和意义[J].中国肿瘤临床,2012,39(9):559-563.
[23] 李白翎,金磊,钟铿,等.非小细胞肺癌组织Bmi-1和VEGF表达及其临床意义的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2012,19(21): 1610-1613.
[24] 王伟,李勇,牛旗.从耐顺铂肺腺癌A549/DDP细胞系分离和鉴定肺癌干细胞的研究[J]. 中华临床医师杂志:电子版, 2012, 6(22):7229-7232.
[25] Pesch B, Casjens S, Stricker I,et al. NOTCH1, HIF1A and other cancer-related proteins in lung tissue from uranium miners--variation by occupational exposure and subtype of lung cancer. PLoS One. 2012;7(9):e45305.
[26] 曹慧秋,文继舫,胡玉林,等.肺鳞状细胞癌中Notch1-4和DLL4的表达及与微血管密度的相关性[J].临床与实验病理学杂志, 2012,28(8):842-847.
[27] 邵新宏,于游,张才全. miR-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖的影响[J]. 第三军医大学学报, 2012,34(22): 2297-2301.
[28] 陈伟,曹罡,董震,等.人Notch4基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定[J]. 医学研究生学报,2013,26(2):116-121.
[29] 张同韩,刘海潮,梁玉洁,等. Notch信号通路分子在舌鳞癌中的表达及意义[J]. 华西口腔医学杂志,2013,31(3):303-309.
[30] Guo J, He L, Yuan P, et al. ADAM10 overexpression in human non-small cell lung cancer correlates with cell migration and invasion through the activation of the Notch1 signaling pathway. Oncol Rep. 2012;28(5):1709-1718.
[31] 张洪开,徐韬钧,具英花,等.PI3K和MAPK信号通路通过FOXO1转录因子诱导A549细胞周期的阻滞和凋亡的研究[J].中国医科大学学报,2012,41(10):908-911.
[32] 陈玲.结肠癌组织中Bmi-1表达变化及意义[J].现代诊断与治疗, 2014,25(16):3810-3812.
[33] 郑伟,吉巧红,李三强,等. Bmi-1、Notch1在乳腺癌中的表达及意义[J]. 河南科技大学学报:医学版, 2014,32(1):7-9.
[34] 邹艳芳,田永,徐峰. Bmi-1和Mel-18基因在大肠癌组织中的表达及意义[J]. 世界华人消化杂志,2013,21(5):397-402.
[35] 郑翔宇,朱杰,王艺芳,等. Bmi-1-siRNA对肺腺癌A549细胞体内外增殖能力的影响[J]. 中国癌症杂志,2013,23(7):505-511.
[36] 李海玉,武向梅,陈兴凤,等.siRNA介导的Bmi-1基因沉默对乳腺癌细胞株MDA-MB-231侵袭迁移的影响[J].中国免疫学杂志,2014,30(4):475-479.
[37] 徐磊,蒋峰,杨欣,等. miR-203下调Bmi-1基因对肺腺癌细胞侵袭转移的影响[J]. 临床肿瘤学杂志,2014,19(4):289-293.
[38] Zhu LB, Xu Q, Hong CY,et al. XPC gene intron 11 C/A polymorphism is a predictive biomarker for the sensitivity to NP chemotherapy in patients with non-small cell lung cancer. Anticancer Drugs. 2010;21(7):669-673.
[39] 毛楠,何关生,饶进军,等.沉默Bmi-1表达可逆转肺癌细胞对顺铂的耐药性[J].南方医科大学学报,2014,34(7):1000-1004.
[40] 唐甜,陕光. Bmi-1和EZH2基因在小细胞肺癌中的表达及其意义[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志,2012,21(1):48-52.
[41] 刘丹丹,姜悦,刘奔,等. Bmi-1 siRNA对宫颈癌Hela细胞体外增殖能力的影响[J]. 大连医科大学学报,2012,34(2):109-114.

引言

肺癌是临床发病率最高、死亡率增长最快的一种恶性肿瘤，男性肺癌发病率及死亡率占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率、死亡率则占第二位^[1-2]。多数肺癌患者在发病初期多无明显不适，临床诊断较为困难，确诊时疾病已进展到中晚期，虽采取多种综合治疗方法但患者的死亡率仍较高^[3-5]。

Notch信号通路普遍存在于无脊椎和有脊椎动物中，在它们的进化中扮演重要角色，它是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一，调控机体的细胞凋亡、增殖和分化。Notch信号转导通路由Notch受体、Notch配体和细胞内效应分子CSL(CBF 1、Suppressor of Hairless、Lag-1)组成^[6-7]。人体内的Notch配体共有4个同源受体Notch 1-4，均由细胞内结构域、跨膜结构域、胞外结构域组成，胞内结构域负责将Notch信号转到细胞核内^[8-10]。近年来随着肿瘤干细胞学说的提出，人们认为肺癌可能是一种干细胞疾病，正常干细胞的自我更新能力使其长时间存在并持续发生细胞分裂分化，倘若干细胞自我更新的调控机制发生障碍则会促使肿瘤的发生^[11-13]。有研究报道，Notch基因具有促癌作用，而且该基因在肺的发育过程中发挥重要作用^[14]，因此，越来越多的学者研究Notch信号通路与肺癌的关系。

Bmi-1基因是多梳基因家族成员之一，是一种核蛋白。Bmi-1基因可协助c-myc癌基因的生物学作用，调控着细胞中心体的异常扩增，造成遗传稳定性发生紊乱，细胞正常活动功能障碍而发生癌变^[15-17]。Bmi-1蛋白通过p16INK4a/细胞周期素D/Rb和p19/ARF/MDM2/p53通路，可负性调控p16/INK4蛋白的表达，从而促使细胞增殖并抑制细胞凋亡，导致多种恶性肿瘤的发生发展^[18-20]。因此，Bmi-1与恶性肿瘤的关系也成为人们关注的热点，高水平表达Bmi-1的细胞被人们认为是肿瘤组织中存在的“肿瘤干细胞”。研究已证实Bmi-1基因在人类多种恶性肿瘤(如淋巴瘤^[21]、乳腺癌^[22]、胃癌^[23])的发生发展过程中出现高表达，而且与肿瘤的恶性程度、侵袭能力及预后有关。

实验分析Notch1和Bmi-1蛋白在肺癌组织中的表达水平及其临床意义。

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材料方法

1.1 材料以重庆市肿瘤研究所病理科收集到的肺癌患者肺癌组织(肺癌组)及病理检查证实为正常的肺组织标本(正常组)作为研究对象。①肺癌组87例，男47例，女40例；年龄37-79岁，平均年龄(55.24±14.26)岁；病理组织类型：鳞癌31例，腺癌44例，小细胞癌12例；分化程度：高分化28例，中分化29例，低分化30例；淋巴结转移57例，无转移30例。②正常组40例，男22例，女18例；年龄41-79岁，平均年龄(56.79±12.84)岁。两组患者的年龄、性别构成差异无显著性意义(P > 0.05)。

纳入标准：①所有肺癌患者术前均接受CT、MRI检查及术后病理组织学活检确诊。②正常肺组织标本来自心胸外科开胸手术和肺部纤维支气管镜检查所取经病理证实的正常肺组织。

排除标准：术前接受放疗、化疗等治疗的肺癌患者。

试剂与仪器：鼠抗人Notch1单克隆抗体、鼠抗人Bmi-1单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)；S-P免疫组织化学试剂盒及BAD显色试剂盒(德国Leica公司)；TWY781型医用微波仪(浙江临安电子器材厂)。

1.2 方法

免疫组织化学方法检测Notch1、Bmi-1蛋白表达水平：取手术切除淋巴组织送至病理科进行标本组织石蜡包埋、切片。选用二甲苯脱蜡，乙醇水化，H₂O₂消除内源性过氧化物酶，EDTA修复，滴入鼠抗人Notch1单克隆抗体/鼠抗人Bmi-1单克隆抗体，孵化过夜，洗涤，加入二抗，洗涤，DAB显色，苏木精复染，固定，封固，观察。

判定标准：Notch1和Bmi-1的阳性表达染色主要表现为黄色或棕黄色，无棕黄色表达为阴性；Notch1蛋白主要定位于细胞膜和细胞浆；Bmi-1蛋白阳性表达定位于细胞质、细胞核内。随机选取5个以上的的高倍视野(×400)，每张切片选取具有代表性的区域在显微镜下进行计数，计算每100个细胞中的阳性细胞数，坏死区和血管内皮细胞区不计算在内(图1)。

1.3 主要观察指标肺癌组织及正常肺组织中Notch1、Bmi-1蛋白表达，以及Notch1、Bmi-1蛋白表达与肺癌患者临床病理特征的关系。

1.4 统计学分析所有统计分析在SPSS 17.0统计软件中进行。Notch1、Bmi-1蛋白阳性表达率采用百分率表示，组间比较采用卡方检验，相关性分析法采用Spearman相关分析法。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

生物学研究显示，肿瘤的形成是细胞调节通路及整体网络紊乱的结果^[24]。Notch1是PCG基因家族的一员，最早发现于小鼠B细胞淋巴瘤中，被当做c-myc的协同癌基因，与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关^[25]。当Notch1受体与其配体结合时，Notch1受体将脱离细胞膜并进入细胞核内，与转录调节因子相互作用，最终激活靶基因^[26-27]。已有研究证实，Notch1信号通路与肿瘤发生密切相关，多种实体瘤及血液系统瘤均可见Notch1高表达^[28]。本次研究发现肺癌组中Notch1蛋白表达阳性率为61%，显著高于正常组标本，提示Notch1信号通路与肺癌密切相关，但临床尚未明确Notch1的完整信号通路，且其诱发肿瘤的机制也尚无定论，这有待进一步研究^[29]。

Bmi-1是Polycomb原癌基因家族的一员，可通过调节INK4a-ARF、Hox以及端粒酶反转录酶等诱使细胞恶性转化，并可通过抑制肿瘤基因而延长细胞寿命，诱使细胞永生化，同时还可增强肿瘤的自我更新能力，加速肿瘤团块生成^[30-32]。Bmi-1可通过不同途径参与肺癌浸润、转移：一方面，Bmi-1作为原癌基因，在激活后可直接调控细胞的增殖分裂^[33]。

高表达Bmi-1细胞则通常情况被当作为肿瘤启动因子即“肿瘤干细胞”，由于Bmi-1含有协同癌基因，可诱发正常细胞出现恶性异变，形成拮抗肿瘤抑制基因，并造成细胞凋亡缓解，从而维持肿瘤干细胞不断自更新，促进肿瘤干细胞团块不受限制逐渐增大。

已有研究证实，高表达的Bmi-1可通过抑制P16NK4a的表达来延长细胞生命周期^[34]；另一方面，Bmi-1还可在蛋白水平直接与肿瘤浸润、转移因子相互作用，以促进肿瘤浸润、转移^[35]。

通过染色实验发现，Notch1蛋白阳性产物主要存在于肺癌细胞的细胞膜及细胞浆内，而Bmi-1蛋白阳性产物则主要存在于肺癌细胞的细胞质及细胞核内，且免疫组织化学染色结果为棕黄色。有文献称，肺癌干细胞内的Notch1及Bmi的阳性表达率要明显高于正常肺组织细胞^[36]。而研究结果显示肺癌组中的Bmi-1蛋白表达阳性率为47%，显著高于正常组标本，提示Bmi-1基因与肺癌存密切联系，这也表明Notch1异常表达可诱发Notch信号通路功能异常，同时和Bmi-1高表达相互作用，共同积极促进肺癌的产生和发展。研究结果中，肺癌组Notch1、Bmi-1蛋白表达具有显著的正相关性(r=0.567，P=0.000 < 0.001)，该两种蛋白在肺癌干细胞中呈现相关性关系又进一步印证，它们的异常表达和肺癌的发生、发展具有密切关系。作者推断这可能是因为Notch１高表达先刺激Notch信号通路，能够诱发Bmi-1介导肺癌产生相关细胞内信号加快传输效率，进而诱发肺癌发生、发展和转移、浸润。实验还发现，低分化肺癌、发生淋巴结转移、TNM分期Ⅲ-Ⅳ级患者的Bmi-1蛋白阳性表达率显著高于高中分化肺癌、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ、Ⅱ级患者，提示Bmi-1是肺癌浸润、转移的重要影响因子。此外，作者还发现不同性别、不同病理类型患者的Bmi-1蛋白阳性表达率差异不显著，这表明Bmi-1在肺癌发生、发展中的作用无组织学类型特征，也可能表明Bmi-1基因不是肿瘤细胞分化的主导基因。

临床尚未明确Bmi-1基因的上游协同基因及其效应通路，但分析Notch1可能是Bmi-1的上游信号通路之一，其可调控Bmi-1活性以促进细胞增殖，并参与肿瘤发生、发展^[36-37]。在肺癌组织中，Notch1蛋白与Bmi-1蛋白表达呈正相关关系，提示Bmi-1活性与Notch1信号通路密切相关，这可能与Bmi-1在各种致瘤因子的刺激下，激活Notch1信号通路，并诱使调节功能异常化，最终导致肿瘤细胞异常生长^[38-41]。肺癌是一个多信号通路参与的病理改变，Notch1、Bmi-1蛋白正相关表达也可能与多种信号通路共同交互有关，这有待进一步的研究。

综上所述，Notch1基因和Bmi-1基因是肺癌发生、发展的重要参与因子，与肺癌的浸润、转移密切相关，其中Bmi-1基因可能成为恶性肿瘤靶向治疗的新内容，具有极高的研究价值，值得进一步研究。

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