过表达白血病抑制因子受体对甲状腺癌干细胞干性维持及体内肺转移能力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0467

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1376-1381.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0467

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过表达白血病抑制因子受体对甲状腺癌干细胞干性维持及体内肺转移能力的影响

张振华¹，苏自杰¹，阚云珍²，刘秋雨²

河南省人民医院，¹甲状腺外科，²病理科，河南省郑州市 450003

修回日期:2017-10-16 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 苏自杰，硕士，主任医师，河南省人民医院甲状腺外科，河南省郑州市 450003
作者简介:张振华，男，1974年生，汉族，2010年中南大学湘雅医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事甲状腺疾病方面的研究。
基金资助:
2013年河南省重点科技攻关计划项目(132102310095)

Effects of leukemia inhibitory factor receptor overexpression on stemness maintenance and lung metastasis in vivo of thyroid cancer stem cells

Zhang Zhen-hua¹, Su Zi-jie¹, Kan Yun-zhen², Liu Qiu-yu²

¹Department of Thyroid Surgery, ²Department of Pathology, Henan Province People's Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China

Revised:2017-10-16 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Su Zi-jie, Master, Chief physician, Department of Thyroid Surgery, Henan Province People's Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China
About author:Zhang Zhen-hua, Master, Attending physician, Department of Thyroid Surgery, Henan Province People's Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China
Supported by:
the Major Science and Technology Research Project of Henan Province in 2013, No. 132102310095

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
白血病抑制因子受体(leukemia inhibitory factor receptor，LIFR)：是极其重要的肿瘤转移抑制因子，其在多种肿瘤中表达失调，如LIFR在甲状腺癌和乳腺癌中表达缺失，且LIFR的缺失与乳腺癌的淋巴结阳性状态、肿瘤分级增加、远处转移风险的增加及总体生存率的降低密切相关。通过过表达LIFR可抑制多种恶性肿瘤的复发与转移。
上皮间质转化：研究显示肿瘤发生复发转移的过程中，存在上皮间质转化，即存在上皮细胞向间质细胞转化的过程，上皮间质转化使肿瘤细胞具有更强的侵袭和转移能力，该过程使肿瘤细胞拥有干细胞特征，减少细胞的凋亡和衰老，并促进肿瘤细胞的免疫抑制。在肿瘤发生发展的初期，上皮细胞经过上皮间质转化过程转化为原位癌，后续肿瘤细胞经上皮间质转化过程向周围组织扩散，并经血管或淋巴管向远处组织发生迁移，最终形成转移灶。

摘要
背景：甲状腺癌干细胞是甲状腺癌发生复发转移的关键，白血病抑制因子受体(leukemia inhibitory factor receptor，LIFR)在多种恶性肿瘤中表达下调，且过表达LIFR可抑制恶性肿瘤的复发与转移。
目的：探讨LIFR对甲状腺癌干细胞干性维持和体内肺转移能力的影响。
方法：收集转移性甲状腺癌患者的肺转移灶，分离培养原代甲状腺癌细胞TCLM，经无血清悬浮培养形成肿瘤细胞球，流式分选筛选出CD133⁺表型的转移性甲状腺癌干细胞细胞亚群TCLM-S。将包含LIFR的重组慢病毒过表达质粒及其阴性对照空载体质粒分别以病毒/细胞数量=20的比例感染甲状腺癌干细胞TCLM-S，经2.0 mg/L嘌呤霉素筛选，成功构建稳定表达LIFR或阴性对照的TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control细胞株。qRT-PCR检测LIFR在TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control细胞中的表达，流式细胞术检测TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control细胞中CD133⁺细胞亚群的比例，Western Blot检测TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control细胞中干性相关因子SOX2、Oct4、Nanog及肿瘤侵袭和转移相关蛋白E-cad、MMP-2、MMP-7的表达。将TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control细胞分别经尾静脉注射到BALB/c裸鼠体内，构建甲状腺癌干细胞裸鼠肺转移模型，观察过表达LIFR对裸鼠体内肺转移能力的影响。
结果与结论：与TCLM-S_control细胞相比，TCLM-S_LIFR细胞中LIFR的表达显著增加，流式分选技术检测CD133⁺干细胞亚群的比例显著降低，干细胞干性相关因子SOX2、Oct4和Nanog的蛋白表达显著降低，肿瘤侵袭和转移相关蛋白E-cad的表达显著增加，MMP-2和MMP-7的表达显著降低，裸鼠体内肺转移的数量显著降低。结果表明，过表达LIFR可显著抑制甲状腺癌干细胞的干性和体内肺转移能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2036-7267(张振华)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 甲状腺癌, LIFR, CD133+, 肺转移

Abstract:

BACKGROUND: Thyroid cancer stem cells are essential to the recurrence and metastasis of thyroid carcinoma. Leukemia inhibitory factor receptor (LIFR) shows a downward trend in a variety of malignant tumors, and its overexpression can inhibit the recurrence and metastasis of malignant tumors.
OBJECTIVE: To explore the effect of LIFR on the stemness maintenance and lung metastasis of thyroid cancer stem cells in vivo.
METHODS: Primary thyroid cancer cells TCLM were isolated from the lung metastases of a metastatic thyroid cancer patient. Serum-free suspension culture was used to form tumor cell balls. Flow cytometry was used to screen CD133⁺ phenotype of metastatic thyroid cancer stem cell subpopulation TCLM-S. The overexpressed recombinant lentiviral plasmid containing LIFR and its negative control containing the empty plasmid were infected into thyroid cancer stem cells TCLM-S at the ratio of virus/cell number=20, and screened with 2.0 mg/L puromycin to construct TCLM-S_LIFR and TCLM-S_control stem cells which stably expressed LIFR and its control. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of LIFR in TCLM-S_LIFR and TCLM-S_controlstem cells. Flow cytometry was used to detect the percentage of CD133⁺ phenotype cell subsets, western blot assay was used to detect the expression of tumor stemness related factors SOX2, Oct4, Nanog and tumor invasion and metastasis related proteins E-cadherin, matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-7 in TCLM-S_LIFR and TCLM-Scontrol stem cells. TCLM-S_LIFR and TCLM-S_control stem cells were respectively injected into BALB/c nude mice by tail vein, and the lung metastasis model of thyroid cancer stem cells was constructed. The effect of LIFR overexpression on lung metastasis was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with TCLM-S_controlcells, the expression of LIFR in TCLM-S_LIFR cells was significantly increased, the proportion of CD133⁺ phenotype stem cell subsets was significantly decreased, the expression of SOX2, Oct4 and Nanog were significantly decreased, the expression of E-cadherin was significantly increased, and the expression of MMP-2 and MMP-7 was significantly decreased. Moreover, the number of lung metastasis in nude mice given TCLM-S_LIFR cells was significantly decreased as compared with those given TCLM-Scontrol cells. To conclude, LIFR overexpression can decrease the stemness and ability of lung metastasis in vivo.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neoplastic Stem Cells, Thyroid Neoplasms, Leukemia Inhibitory Factor, Neoplasm Metastasis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张振华，苏自杰，阚云珍，刘秋雨. 过表达白血病抑制因子受体对甲状腺癌干细胞干性维持及体内肺转移能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1376-1381.

Zhang Zhen-hua, Su Zi-jie, Kan Yun-zhen, Liu Qiu-yu. Effects of leukemia inhibitory factor receptor overexpression on stemness maintenance and lung metastasis in vivo of thyroid cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1376-1381.

图/表（结果） 1

2.1 甲状腺癌干细胞的形态学观察及转染结果鉴定 甲状腺癌患者的肺转移灶经体外分离、无血清悬浮培养及CD133⁺分选得转移性甲状腺癌干细胞TCLM-S，镜下观察无血清悬浮培养的TCLM-S圆而亮，生长状态良好(图1A)。分别稳定转染表达LIFR及其阴性对照慢病毒质粒到TCLM-S细胞中，倒置荧光显微镜下观察到荧光表达，随转染时间增加，荧光表达量不断增加，最终荧光表达率均达90%以上时表明稳转细胞株构建成功(图1B)。

qRT-PCR结果显示，转染LIFR后，TCLM-S_LIFR细胞中LIFR的mRNA表达水平显著增加(t=7.700，P=0.001 5，图1C)，进一步表明稳定表达LIFR及其对照慢病毒质粒的TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control细胞株构建成功。

2.2　过表达LIFR对甲状腺癌干细胞亚群比例和干性特征性蛋白表达的影响 与TCLM-S_control细胞相比，过表达LIFR可使TCLM-S_LIFR细胞中CD133⁺细胞亚群的比例显著降低，由(18.44±0.25)%降低到(4.01±0.57)%，差异有显著性意义(t=23.07，P < 0.000 1，图2A)；过表达LIFR使TCLM-S_LIFR细胞中干性特征性蛋白SOX2，Oct4和Nanog的表达均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05，图2B)。

2.3 过表达LIFR对甲状腺癌干细胞侵袭和转移相关蛋白表达的影响 与TCLM-S_control细胞相比，TCLM-S_LIFR细胞中E-cad的蛋白表达水平显著增加，MMP-2和MMP-7的蛋白表达水平显著降低(P < 0.05，图3A，3B)。

2.4 过表达LIFR对甲状腺癌干细胞体内肺转移能力的影响 经尾静脉注射稳转细胞株TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control到裸鼠体内，构建甲状腺癌干细胞转移模型，处死裸鼠取肺组织，统计转移灶的个数。结果显示：TCLM-S_LIFR组裸鼠肺转移灶的个数显著低于TCLM-S_control组(t=14.75，P < 0.000 1，图4)。

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引言

状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，其中女性甲状腺癌的发病率显著高于男性，其发病的危险因素包括性别、体质量指数、地理位置、辐射、碘摄入异常和遗传或基因突变等^[1]。高侵袭性甲状腺癌复发率和转移率偏高，有较高的致死率，且目前对高侵袭转移性甲状腺癌仍缺乏有效的治疗手段^[2]。

肿瘤干细胞是公认的一群具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的细胞，是肿瘤无限生长的主要原因，也是恶性肿瘤复发、转移及治疗耐药的根本原因。通过调控肿瘤干细胞干性相关因子SOX2，Oct4和Nanog等的表达，可以抑制肿瘤的转移、复发或治疗耐药^[3-4]。研究发现甲状腺癌干细胞是甲状腺癌发生复发转移的关键^[5]。甲状腺癌干细胞分选及鉴别的常用表面分子标志物有五次跨膜糖蛋白(prominin 1，CD133)、Ⅰ类跨膜糖蛋白(CD44 molecule，CD44)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)和胰岛素样生长因子1受体(insulin like growth factor 1 receptor，IGF1-R)等，以上述标记物为分选标记，经流式细胞分选技术可分选出甲状腺癌干细胞，该方法是常用的甲状腺癌干细胞识别和分选方法^[6]。

研究显示肿瘤转移抑制基因的重新激活对恶性肿瘤的治疗具有极其重要的意义，而白血病抑制因子受体(leukemia inhibitory factor receptor，LIFR)就属于此类基因之一^[7]，LIFR在多种恶性肿瘤中表达下调，通过过表达LIFR可抑制多种恶性肿瘤的复发与转移，如乳腺癌和肝癌等^[8-9]。因此，实验探讨过表达LIFR对甲状腺癌干细胞干性维持和体内肺转移能力的影响，以期为甲状腺癌复发、转移或治疗耐药患者提供新的临床治疗思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年2月至2017年2月在河南省人民医院基础研究实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 临床样本 甲状腺癌肺转移灶组织标本取材于1例甲状腺癌肺转移患者，相关鉴定及分型由病理科确定，该患者于2016年1至2月在河南省人民医院治疗，女性，37岁，未绝经，无其他基础疾病，术前未进行任何形式的抗肿瘤治疗，将术中获得的组织样本，在无菌条件下迅速放入RNAlater保存液中，于-80 ℃保存用于后续实验。该实验的所有过程均遵从赫尔辛基宣言标准，研究方案经伦理委员会批准，且在充分告知可能存在的风险后与该患者签署了知情同意书。

1.3.2 主要试剂和仪器　兔抗人SOX2，Oct4，Nanog，E-cad，MMP-2，MMP-7单抗和兔抗人GAPDH多抗(CST，USA)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(博士德，湖北武汉)；PE标记的CD133流式抗体CD133-PE(BD，USA)；表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(Gibco，USA)；LIFR慢病毒载体质粒及对照空载体质粒(GeneCopoeia构建，USA)；Lipofectamine 2000转染试剂、Trizol试剂(Invitrogen，USA)；RNA抽提试剂盒(Applied Biosystems，USA)；TaqMan反转录试剂盒(Life Technologies, UK)；qSYBR-Green-containing PCR试剂盒(Qiagen, USA)；蛋白提取试剂盒、ECL增强化学发光试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒(Thermo，USA)；ChemiDoc™触摸成像系统(Bio-Rad，USA，配合Image Lab™Touch软件Version 1.0使用)；奥林巴斯倒置显微镜 OLYMPUS IX71(Olympus公司，日本，CCD图像传感器，配合Image-Pro Plus7.0成像系统使用)；紫外可见分光光度计(Thermo，Nanodrop 2000，USA)；BD FACSAria^TM流式细胞分选仪(BD，USA)。

1.3.3 实验动物 3周龄雌性BALB/c裸鼠10只，体质量(50±2) g，由广东省医学实验中心提供，许可证号SCXK粤2013-0002，合格证编号44007200025147。

1.4 实验方法

1.4.1 原代甲状腺癌细胞的分离及干细胞球的培养 无菌条件下操作，取术中获得的肺转移灶标本约3 cm³，置于装有Hank’s液的无菌培养皿内，漂洗2次，每次3 min，用眼科弯剪将组织剪成大约1 mm³的小块，加入1%胶原消化液于室温下消化0.5 h，将细胞悬液过0.45 μm的细胞筛，室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清，共离心2次，将所得细胞沉淀用适量DMEM培养液重悬，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，取3 mL单细胞悬液接种到25 mL培养瓶内[无血清培养基成分：DMEM/F12(1︰1)500 mL、B27(1︰50)10 mL、表皮生长因子(20 μg/L)1 mL、碱性成纤维细胞生长因子(20 μg/L)500 μL]。每天在显微镜下观察，约2周后开始有细胞球形成，流式细胞仪分选甲状腺癌干细胞TCLM-S，无血清悬浮扩大培养。

1.4.2 流式细胞仪分选CD133⁺表型细胞亚群(甲状腺癌干细胞TCLM-S) 收集对数生长期的细胞，室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清。PBS清洗细胞2次，1 000 r/min离心5 min，用PBS调整细胞浓度至5×10⁸ L^-1，将细胞平均分为2份，分别移至流式管中，一份加入CD133-FITC抗体，一份加入FITC及PE标记的对照抗体，各加入10 μL，加入FcR阻断剂20 μL，缓冲buffer 80 μL，充分混匀后，4 ℃条件下避光静置15 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗1次，弃上清，上机分选出CD133⁺表型细胞亚群，用于后续实验。

经流式分选出的CD133⁺表型的甲状腺癌干细胞培养于含无血清培养基的低吸附6孔板中，置于37 ℃，饱和湿度，含体积分数为5% CO₂的细胞培养箱内孵育，每5 d加入1.5 mL的新鲜培养基以补充干细胞生长所需的生长因子和营养，当干细胞球数量达到200-300个时进行传代，取第3次传代的细胞进行后续细胞实验。

1.4.3　建立稳定表达LIFR及其对照空载体质粒的细胞株 含LIFR的重组慢病毒质粒及其阴性对照慢病毒空载体质粒由美国GeneCopoeia公司构建(均带EGFP的荧光标签)。将两种质粒分别以病毒/细胞数量=20的比例感染甲状腺癌干细胞TCLM-S，感染3 d后观察荧光的表达量，加入2.0 mg/L嘌呤霉素，继续培养，直到所有细胞均可观察到荧光表达。此时即构建了稳定表达LIFR及其阴性对照质粒的细胞株TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control。

1.4.4 RNA提取和qRT-PCR检测 将TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control细胞进行消化、离心，弃上清，收集沉淀。向沉淀中加入1 mL Trizol，室温孵育15 min，裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，按每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿的量加入氯仿，剧烈振荡15 s，冰上孵育15 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，缓慢取上清，避免吸入中间层的白色物质，上层水相体积约为所用Trizol试剂的60%，将吸取的上清置于另一干净EP管内，加入等体积的异丙醇沉淀水样中的RNA，颠倒混匀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，见RNA沉淀附着于EP管，加入1 mL体积分数为75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥，加入30 μL无RNase水溶解，取1 μL测RNA浓度和纯度，剩余RNA立即放入-20 ℃保存备用。

以上述提取的细胞总RNA为模板，按反转录试剂盒说明书进行操作，反转录生成cDNA，以cDNA为模板，按qSYBR-Green-containing PCR试剂盒的说明书进行操作，在BioRad IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统上检测各组的CT值并记录。LIFR引物由Invitrogen公司合成，GAPDH为内参，LIFR的相对表达量用2^-^??CT来表示，??CT= (CT_LIFR−CT_GAPDH)target−(CT_LIFR−CT_GAPDH)control。反应体系为20 μL，每个样本设置3个复孔。

1.4.5 蛋白提取和Western Blot检测 按照蛋白提取试剂盒、ECL增强化学发光试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒说明书进行操作，分别提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度。取蛋白样本30 μg，进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，转移蛋白到PVDF膜上，然后用5% BSA室温封闭1.0-2.0 h。分别加入1︰10⁴的兔抗人SOX2，Oct4，Nanog，E-cad，MMP-2，MMP-7和内参GAPDH抗体，4 ℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1︰10³的辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。最后加入ECL发光剂并曝光，采用ChemiDoc™触摸成像系统扫描并保存蛋白条带图片。Quantity One软件分析，以目的蛋白SOX2，Oct4，Nanog，E-cad，MMP-2，MMP-7与内参GAPDH蛋白条带的灰度值比值来确定目的蛋白的相对表达水平，每组实验设置3个复孔。

1.4.6 建立裸鼠肺转移模型 3周龄雌性BALB/c裸鼠10只，随机分为TCLM-S_LIFR组和TCLM-S_control组，每组5只。将构建的稳转细胞株TCLM-S_LIFR和TCLM-S_control分别经尾静脉注射到裸鼠体内，注射量为每只1×10³，共50 μL。4周后处死裸鼠并解剖，取出肺组织，苏木精-伊红染色，镜下统计肺组织中所有转移灶的个数，该实验经伦理委员会批准且所有操作均符合动物伦理学要求。

1.4.7 苏木精-伊红染色 将裸鼠的肺转移切片在二甲苯中浸泡15 min，更换二甲苯再浸泡1次，将切片置于体积分数为100%无水乙醇中浸泡5 min，更换乙醇再浸泡1次，依次在体积分数为95%乙醇、体积分数为85%乙醇、体积分数为75%乙醇和双蒸水中各浸泡5 min，苏木精染色1 min，1%盐酸-乙醇分化10 s，玻片自来水下冲洗20 s，伊红染色30 s，双蒸水、体积分数为75%乙醇、体积分数为85%乙醇、体积分数为95%乙醇和无水乙醇浸泡脱水透明后封固，操作过程中要保持玻片完好，尽量不要发生脱片。

1.5 主要观察指标 ①LIFR mRNA的相对表达量；②CD133⁺干细胞亚群比例；③干性特征性蛋白SOX2，Oct4和Nanog，侵袭转移相关蛋白E-cad、MMP-2和MMP-7的相对蛋白表达量；④肺转移灶的个数。

1.6　统计学分析 使用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析。计量资料以x(_)±s表示，两组间数据比较采用成组t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，多时点观测资料则采用重复测量方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年来尽管甲状腺癌的诊治已取得了重大的进展，但其易复发和转移的现状并未得到实质性的改善^[10]。大量研究显示肿瘤细胞中存在一小部分可维持肿瘤细胞异常生长的亚群，这群细胞具有无限增殖分裂和多向分化的能力，该类细胞被认为是导致肿瘤复发转移的根本原因，这类细胞即为肿瘤干细胞^[11]。在甲状腺癌复发和转移患者的治疗中，应该将甲状腺癌干细胞作为肿瘤复发转移治疗的重要靶向细胞，寻找其治疗靶点，对靶点的有效干预将成为甲状腺癌复发转移治疗的有效策略。

研究表明白血病抑制因子受体LIFR是极其重要的肿瘤转移抑制因子，其在多种肿瘤中表达失调，如LIFR在甲状腺癌和乳腺癌中表达缺失，且LIFR的缺失与乳腺癌的淋巴结阳性状态、肿瘤分级增加、远处转移风险的增加及总体生存率的降低密切相关^[12-13]。为了进一步挖掘LIFR及肿瘤干细胞在甲状腺癌转移中的作用，探究LIFR对甲状腺癌干细胞干性维持及体内肺转移能力的影响。本实验从转移性甲状腺癌患者的肺转移灶中分离并培养出原代细胞，经无血清悬浮培养形成肿瘤细胞球，流式分选筛选出CD133⁺的转移性甲状腺癌干细胞亚群TCLM-S，随后通过转染慢病毒质粒，筛选并成功构建了稳定表达LIFR及其阴性对照慢病毒质粒的甲状腺癌干细胞株TCLM-S_control和TCLM-S_LIFR。研究显示CD133跨膜糖蛋白是顶端质膜上重要的细胞膜蛋白，是多种肿瘤干细胞分选及鉴别的分子标志物，如白血病和胶质瘤均可以CD133为分选标志物^[14-15]。以CD133为甲状腺癌干细胞亚群分选标志物，采用流式分选技术分选出的干细胞的增殖能力显著增加，且对多种抗癌药物如顺铂、阿霉素和依托泊苷等治疗产生显著的耐药性^[16]。另外通过检测过表达LIFR对TCLM-S中CD133⁺细胞亚型比例、肿瘤干细胞干性相关因子SOX2、Oct4和Nanog蛋白表达和裸鼠体内成瘤能力的影响，结果显示LIFR可降低TCLM-S的比例、干性相关标志物的表达和干细胞的转移能力，该结果表明LIFR抑制甲状腺癌的转移可能是通过降低甲状腺癌干细胞的干性而实现的。

研究显示肿瘤发生复发转移的过程中，存在上皮间质转化，即存在上皮细胞向间质细胞转化的过程，上皮间质转化使肿瘤细胞具有更强的侵袭和转移能力，该过程使肿瘤细胞拥有干细胞特征，减少细胞的凋亡和衰老，并促进肿瘤细胞的免疫抑制^[17-18]。在肿瘤发生发展的初期，上皮细胞经过上皮间质转化过程转化为原位癌，后续肿瘤细胞经上皮间质转化过程向周围组织扩散，并经血管或淋巴管向远处组织发生迁移，最终形成转移灶^[19-20]。本实验通过Western Blot检测E-cad，MMP-2和MMP-7在TCLM-S_control和TCLM-S_LIFR细胞中的表达，结果显示LIFR可使甲状腺癌干细胞中E-cad的蛋白表达增加，使MMP-2和MMP-7的蛋白表达降低，而E-cad，MMP-2和MMP-7是上皮间质转化过程中的几个关键蛋白，其中E-cad表达水平的改变是上皮间质转化或上皮间质转化的逆向过程间质上皮转化发生的最重要的标志^[21]。另外肿瘤和基质细胞之间的黏附和基质的降解过程也是肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键步骤，基质金属蛋白酶家族成员MMP-2和MMP-7可特异性降解基底膜和细胞外基质中主要成分Ⅳ型胶原，该家族可促进肿瘤组织的血管生成，是促进肿瘤发生侵袭及转移的最重要金属蛋白酶^[22-23]。该结果表明LIFR抑制甲状腺癌干细胞的转移可能是通过抑制上皮间质转化过程而实现的。

综上，过表达LIFR可显著抑制甲状腺癌干细胞的干性和体内肺转移能力。因此，研发过表达LIFR的药物将可能为转移性甲状腺癌的临床治疗提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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过表达白血病抑制因子受体对甲状腺癌干细胞干性维持及体内肺转移能力的影响

Effects of leukemia inhibitory factor receptor overexpression on stemness maintenance and lung metastasis in vivo of thyroid cancer stem cells

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